專利名稱：TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
痛經為婦科血瘀證臨床常見多發病癥，可分為原發性痛經(PD)和繼發性痛經 (SD)兩大類。原發性痛經特征表現在無生殖系統明顯病變，一般在初潮開始就會發生；繼發性痛經可由生殖器炎癥、子宮肌瘤、子宮內膜異位等生殖器官疾病引起，其中子宮內膜異位癥者居多。流行病學研究表明，我國婦女中痛經發生率33. 1%，尤其是原發性痛經者占 53.2%，痛經嚴重影響工作者占13. 55%，為影響婦女正常工作和生活質量的常見原因。痛經為婦科最常見的癥狀之一，約有75%的婦女發生痛經。現代醫學研究表明，痛經的發病機制與子宮異常收縮有關。由于子宮痙攣性收縮使子宮血流量減少，造成子宮缺血和疼痛發生，其病理機制涉及內分泌因素(前列腺素合成和釋放，加壓素、催產素、內啡肽)、神經與神經遞質(去甲腎上腺素)和免疫失調等多種環節。西醫臨床常可使用非留體抗炎藥或口服避孕藥進行治療，但這些藥物長期療效不理想，且對機體代謝有明顯的毒副作用，臨床不良反應大。目前有關基因治療痛經的報道較少，轉化生長因子β (transforming growth factor)家族由一類結構、功能相關的多肽生長因子亞家族組成，其中包括TGF-β、活化素 (activin)、骨形態發生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)等。TGF-β除了影響細胞的增殖、 分化，還在胚胎發育、胞外基質形成、骨的形成和重建等方面起著重要作用。TGF-β家族成員廣泛存在于從果蠅到人多種生物的各種組織中，對正常細胞、癌變細胞都有著顯著作用。且TGF-β超基因家族成員共同的特征(1)N-端有1段信號肽序列，可借以跨過內質網；( 緊挨著生物活性區有由4個氨基酸(RSRR)組成的蛋白酶加工位點；C3)C-末端包含9個保守的半胱氨酸的生物活性區，靠分子間的二硫鍵形成二聚體。目前還沒有文獻報道TGF-β超家族基因用于治療痛經。
發明內容
發明目的本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中治療痛經藥物的不足， 提供TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用。技術方案為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為本發明提供TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用，其中優選的 TGF- β 超家族基因為 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSF1、⑶Fll、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL。本發明所述的TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用，所述的痛經類型可為原發性痛經或繼發性痛經。本發明采用了 Real-time PCR免疫芯片為研究工具，通過比較原發性痛經患者和正常人外周血單個核細胞(PBMC)基因表達譜。發現在原發性痛經發病前后，病人與正常人
3相比，TGF-β 超家族基因(BMP4、BMP6、GSFl、GDFll、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL) 表達明顯下調。發明者首次發現了下調的TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSFU⑶F11、⑶F5、 MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)為原發性痛經的致病基因。上述基因及其TGF-β /Smad信號通路，構成了原發性痛經藥物治療的新靶點。總之，TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、GDFl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或NODAL)的表達和原發性痛經直接相關，即TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSFl、ffl)Fll、 0^5、1^111乂1^嫩、1^ 1丫2或而040的表達下調導致和加劇痛經發生，上調TGF-β超家族基因出1^4、81^6、65 1、0^11、0^5、]^111乂11^、1^ 1￥2或吣041^)的表達可作為治療原發性痛經的新靶點。其中，TGF-β 超家族基因 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、⑶Fl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 和 NODAL的核苷酸序列分別為說明書序列SEQ ID NO 1 9，即BMP4核苷酸序列為序列1 ； BMP6核苷酸序列為序列2 ；GSFl核苷酸序列為序列3 ；GDFll核苷酸序列為序列4 ；GDF5核苷酸序列為序列5 ；MSTN核苷酸序列為序列6 ；TXLNA核苷酸序列為序列7 ；LEFTY2核苷酸序列為序列8 ；NODAL核苷酸序列為序列9。有益效果本發明通過大量實驗研究結果表明TGF-β超家族基因和痛經，尤其是原發性痛經的直接相關性，TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、⑶F11、⑶F5、MSTN、 TXLNA、LEFTY2或NODAL)的表達下調導致和加劇痛經發生，上調TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、 ΒΜΡ6、GSFU⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)的表達能減輕和消除痛經癥狀， TGF-β超家族基因可作為治療原發性痛經的新靶點；和現有技術相比，本發明從基因水平治療痛經癥狀，具有針對性強，療效好，不良反應低的優點。本發明經大量實驗研究表明， 四物湯的類方，如少腹逐瘀湯、香附四物湯等能顯著上調TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、 GSFl、⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)表達，進一步從基因水平驗證四物湯類方的良好的抗痛經效果。
圖 1 為 TGF-β 超家族基因 BMP4、BMP6、GSF1、⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA、LEFTY2 或 NODAL的表達倍數柱形圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。原發性痛經患者PBMC細胞TGF-β超家族基因的研究本發明采用基因芯片技術， 針對免疫因子基因，證明TGF-β超家族基因BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、 LEFTY2或NODAL和痛經的相關性。1、材料與方法1. 1、原發性痛經病人和正常人血樣收集經江蘇省中西醫結合醫院倫理委員會批準，在正常月經前7天和正常月經第一
4天，收集10例原發性痛經病人和10例正常人的靜脈血樣，并收集病人給予少腹逐瘀湯、香 附四物湯治療后的血樣。1. 2、RNA抽提=TRIZOL試劑(Invitrogen)，氯仿(上海化學試劑有限公司)，異丙 醇(上海化學試劑有限公司)，100%乙醇(上海化學試劑有限公司)，75%乙醇(以DEPC 處理的水配制)，無RNA酶的水，無RNA酶的糖原(Ambion)TE =IOmM, Tris-HCl pH8. 0，ImM EDTA (Tris-HCl，EDTA華美生物工程公司)，0. 4M MOPS, pH7. 0 (M0PS，華美生物工程公司)， 0. IM乙酸鈉(乙酸鈉，上海化學試劑有限公司)，0.0 IM EDTA (EDTA，華美生物工程公司)，甲 醛(上海化學試劑有限公司)，甲醛上樣染液(Ambion)，溴化乙錠 thidium Bromide, EB, 華美生物工程公司)，瓊脂糖(生エ生物工程有限公司)。采用人淋巴細胞分離液提取每份血樣的外周血單個核細胞(PBMC)細胞，加入Iml 的TRIZOL試劑，反復吹打溶解，負80度保存。加入0.2ml的氯仿，蓋緊EP管蓋，手動劇烈 振蕩管體15秒后，15到30°C孵育2到3分鐘。4°C下12000轉/分鐘離心15分鐘，離心后 RNA全部被分配于水相中，將水相轉移到新離心管中，水相與0. 5ml異丙醇混合，室溫孵育 10分鐘，4°C 12000轉/分鐘離心10分鐘，移去上清液，加入至少Iml的75%乙醇，清洗RNA 沉淀，振蕩后，4°C 7500轉/分鐘離心5分鐘，去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5 10 分鐘，溶解RNA吋，先加入無RNA酶的水用槍反復吹打幾次，然后55到60°C孵育10分鐘， 獲得的RNA溶液保存于負70°C。采用RNeasy MinEluteTM純化試劑盒^jiagen)純化RNA。 使用NanoDrop ND-1000測RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調零。樣品 RNA濃度計算公式為A26(1X40ng/iU，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度。1.3、cDNA 合成SuperScript. Ill Reverse Transcriptase、invitrogen), RNase Innibitor (,epicentre), IOmM dNTPs Mix oligo (,aT) 181.31、配制混合物
500ng/ul oligo (dT) 181ド1
總 RNA1.5tig
IOmM dNTPs Mix1ド1
滅菌水up to 13 y 11. 32、先在65°C水浴5分鐘后，冰上放置至少1分鐘。1. 33、短暫離心后，在離心管中依次加入
5 X First-Strand 緩沖液4ド1
0. IM DTTm
RNA酶抑制劑1ド1
SuperScript III RT1ド11. 34、移液槍輕輕吸打幾次混合均勻。1. 35、在 50°C溫育 60 分鐘。
1. 36、在70°C溫育15分鐘使酶失活。1. 37、每20 ill cDNA加91 yl滅菌水混勻，置冰浴待用或_20°C保存。1.4、實時定量 PCR2X SuperArray PCR master mix(Cat. No. PA-112), PCR Array1. 41.樣品準備
權利要求
1.TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用，其特征在于，所述的 TGF-6 超家族基因為 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、GDFl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL。
3.根據權利要求1或2所述的TGF-β超家族基因在制備治療痛經藥物中的應用，其特征在于，所述的痛經類型為原發性痛經。
全文摘要
本發明提供了TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、LEFTY2或NODAL)在制備治療痛經藥物中的應用，本發明通過大量實驗研究表明痛經病人外周血單個核細胞PBMC細胞的的TGF-β超家族基因有明顯下調，表明痛經，尤其是原發性痛經和TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、LEFTY2或NODAL)有直接相關性，TGF-β超家族基因可作為治療原發性痛經的新靶點。
文檔編號A61K48/00GK102441176SQ20111039422
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者劉培, 唐于平, 宿樹蘭, 段金廒, 洪敏 , 馬宏躍 申請人:南京中醫藥大學