專利名稱：模擬細胞外基質的脂肪來源干細胞的干細胞性增進用組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及對細胞外基質進行模擬，使得干細胞的特性得以維持以及增進的干細胞性增進用組合物。
背景技術：
皮膚由表皮、真皮以及皮下組織構成，真皮組織中作為三維的支撐體具有含有無機鹽類、營養成分，廢物等的水溶液和多糖類大分子等的細胞外基質(extracellular matrix 以下稱之為ECM)成分。這些在包圍細胞的空間內形成網絡而維持并支承組織的形態，起到調節細胞間的信號傳遞以及細胞的生長和分化的重要的作用。至今為止，被模擬的ECM成分大部分來自于動物。但是，來自動物的成分中，病原體感染等安全性問題漸漸顯現，因此具有不在化妝品使用的趨勢。已知占ECM總體的70 80%的主要成分膠原蛋白是長度較長的纖維結構的蛋白質中的一種，對皮膚強度和彈性進行調節，因此與皮老化即彈性減少或皺紋的形成等有密切的關聯。但是，目前使用的大部分膠原蛋白為來自動物的原料，是分子量為約30萬Da左右的高分子，因此對經皮膚的傳達而言，膠原蛋白本身具有吸收的限度。作為ECM成分之一的透明質酸(hyaluronic acid)能夠起到使皮膚內真皮組織的細胞相互結合并傳遞營養成分的作用，使皮膚能夠維持適量的水分。但是，由于透明質酸是分子量在數十萬到數百萬的高分子，因此由于粘度高而用于化妝品時使用量受限，且具有直接涂抹在皮膚時很難透過皮膚的缺陷。皮膚為構成人體的器官中最大的器官，占我們身體體積的約16%，面積為1. 8m2， 厚度為2 4mm，重量為約3kg，由表皮、真皮以及皮下脂肪層構成。這種皮膚與外部環境直接接觸而起到使人體免受人體有害微生物之類的多種有害因子和紫外線等外部刺激的影響的重要的保護膜作用，并且是營造全身的代謝所需的生化功能的對生命維持必不可少的器官。尤其，存在于真皮下方的皮下脂肪層由脂肪細胞(adipocyte)的小葉構成，針對外部的熱量起到保護皮膚內部的器官以及吸收沖擊的緩沖作用，將營養成分以甘油三酸酯 (Triglyceride)的形態儲存在稱之為脂肪體(Lipid droplet)的細胞小器官中，需要時作為能量源來使用。但是，隨著年齡的增加，皮膚因自然性因素和各種外部刺激而受到損傷， 尤其，真皮中左右彈性的膠原纖維(膠原蛋白)、彈性纖維(彈性蛋白)的活性以及表達降低，從而彈性降低的同時皮下脂肪中的脂肪生成也減少，結果皮膚全面性地無法正常實現各構成細胞的原本的功能。因此，現在廣泛使用的方法為脂肪移植手術，它是利用具有郁金香針(tulip needle)形狀的尖部不鋒利的針的注射器，采集自身的脂肪而移植到看上去彈性降低的皮膚的各個部位的手術。但是，有報告指出，在脂肪移植手術以后，移植體積的 40 60%重新被吸收到體內，皮膚薄且皮下脂肪少的部位上進行的脂肪移植手術中被指出存在能夠摸到細胞塊等問題，且實際上移植的脂肪的生存率和生存時間無法達到預期而發生需要再次進行移植的情形。
因此，對能夠代替存在這些問題的脂肪移植手術且能夠增加足夠的皮下脂肪層的組合物的要求提高。另外，由于皮膚的基本結構由皮下脂肪組織來維持，且這些皮下脂肪組織起到左右皮膚的體積和強度的作用，因此與以往使用的給皮膚外圍層的真皮或表皮賦予彈性的方法相比，增加脂肪組織的體積的方法反而會對維持皮膚的飽滿感(獸晉咎)起到更好的效果。因此，為了維持以及增進皮膚的飽滿感，期待開發出能夠增加脂肪組織的體積的組合物。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種能夠使可增加脂肪組織的脂肪來源干細胞的干細胞性增進，并且能夠增加皮膚飽滿感的組合物。為實現上述目的，本發明提供一種作為有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸(Gly-Pr0-Hyp)構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素的脂肪來源干細胞的干細胞性增進用組合物。另外，本發明提供一種作為有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素的用于增進皮膚飽滿感的美容或整形用組合物。另外，本發明提供一種作為有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素的用于增進皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物。本發明的組合物中，三肽、低分子量透明質酸、礦物質成分以及維生素等在包圍細胞的空間中形成網絡而維持并支撐組織的形態，并調節細胞間的信號傳遞以及細胞的生長和分化，從而增進脂肪來源干細胞的干細胞性，因此對美容或整形為目的的脂肪組織增加有效。因此，本發明的組合物能夠增進皮膚飽滿感，促進脂肪來源干細胞的再生，恢復損傷的皮下脂肪的功能，從而能夠作為用于增進皮膚飽滿感的美容或整形用組合物而使用，并且能夠作為皮膚外用劑組合物來使用。
圖1是表示為了研究本組合物的細胞毒性，對人的脂肪來源干細胞(human adipose derived stem cells,hADSCs)以 0. 0001 10%濃度的本發明的 ECM模擬組合物進行處理，并利用CCK-8試劑盒來確認細胞毒性程度的結果的圖表。Iiquiderm表示本發明的實施例1的組合物。圖2是為了測定脂肪來源干細胞標記物(盈列口！·約)基因的表達水平，顯示了 (擬9、44、73、90、105基因的表達圖案變化的圖表。Iiquiderm表示本發明的實施例1的組合物。圖3為通過流式細胞分析而顯示脂肪來源干細胞中表達⑶四、44的細胞數量變化的圖。Iiquiderm表示本發明的實施例1的組合物。圖4是為了研究本發明的組合物對脂肪來源干細胞的生長因子的表達起到的影響，顯示實施了生長因子陣列的結果的圖。Iiquiderm表示本發明的實施例1的組合物。
具體實施例方式以下，詳細說明本發明。本發明提供一種將由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸(Gly-Pr0-Hyp)構成的三肽、 低分子量透明質酸、礦物質以及維生素作為有效成分而含有的脂肪來源干細胞的干細胞性增進用組合物。上述干細胞性(sternness)是指帶有干細胞的自我再生能力和動態平衡，且具有干細胞的活性的狀態；干細胞性增進是指維持干細胞性或增加干細胞的活性。本發明的一實施例中，上述組合物為對細胞外基質(extracellular matrix, ECM) 進行模擬而成，與來自動物的ECM不同，是由來自于植物或合成物質構成的ECM模擬組合物。本發明的一實施例中，上述脂肪來源干細胞(Adipose derived stem cell =ADSC) 是人脂肪來源干細胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)。本發明的一實施例中，上述組合物使脂肪組織增加而提高皮膚的飽滿感。上述組合物促進脂肪來源干細胞分化為脂肪細胞而生成脂肪體(Lipid droplet)。因此，使脂肪組織增加而給特定部位的皮膚提高飽滿感。本發明的一實施例中，上述組合物能夠增加作為脂肪來源干細胞標記物的分化群 ^(Cluster of Differentiation^ 以下稱之為 CD^)、分化群 44(Cluster of Differentiation 44 以下稱之為 CD44)、分化群 73 (Cluster of Differentiation 73 以下稱之為CD73)、分化群90 (Cluster of Differentiation 90 以下稱之為CD90)或分化群105 (Cluster of Differentiation 105 以下稱之為CD105)的表達量。與陰性對照組比較，⑶29、⑶44、⑶73、⑶90或⑶105的表達量的增加意味著脂肪來源干細胞的活性的增加。⑶四為整合素β l(integrin beta 1)的別稱，是脂肪來源干細胞的標記物，⑶44 通過Wnt信號(signaling)活性而增加脂肪來源干細胞的活性。⑶73是5 ‘-核苷酸酶
-nucleotidase)的別稱，是將核苷酸轉化為核苷的酶，是脂肪來源干細胞的標記物， ⑶90是Thyl的別稱，是干細胞的代表性標記物，⑶105為內皮糖蛋白(Endoglin)的別稱， 是TGFb的受體的一部分，是脂肪來源干細胞的標記物。本發明的一實施例中，上述組合物能夠使脂肪來源干細胞的生長因子的表達量增力口，具體地，可使干細胞因子(Stem cell factor 以下稱之為SCF)的表達量增加。與陰性對照組比較，生長因子的表達量的增加意味著脂肪來源干細胞的活性的增加。本發明的一實施例中，相對于組合物總重量，上述組合物可含有0. 001 3重量％ 的三肽，0. 01 50重量％的低分子量透明質酸，0. 001 3重量％的礦物質以及0. 001 3重量％的維生素。相對于組合物總重量，本發明的三肽未達到0. 001重量％時，其效果甚微；超過3 重量％時，相比含量的增加，其功效增加不大，喪失價格的競爭力。上述三肽(trip印tide)由3個氨基酸，即甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)構成，促進膠原蛋白的生成，且分子量低，因此皮膚透過性高。另外，由于上述三肽是通過合成來制備，因此純度高，且由于不是來自動物的成分，具有不存在病原體感染等安全性問題的優點。將膠原蛋白用酸進行水解時，產生多種斷片而難以切斷成三肽，而利用酶來進行分解時，對降低分子量具有限度。因此，本發明以氨基酸作為基礎采用逆向合成的方式，因此能夠獲得均質的三肽。本發明的三肽可采用本領域通常的氨基酸合成方法來制備，該方法無特別限定。相對于組合物總重量，本發明的低分子量透明質酸可使用0. 001 50重量％、優選使用0.01 10重量％。上述低分子量透明質酸(hyaluronic acid)比高分子透明質酸易于皮膚吸收，表現出優秀的皮膚保濕、皺紋改善、傷口治愈以及抗炎效果。本發明的低分子量透明質酸可具有500 10000道爾頓的分子量。這是由于，500道爾頓以下的透明質酸難以制備及分離，超過10000道爾頓時難以透過皮膚而無法體現其效果，且粘度增加而穩定性差。上述低分子量透明質酸可采用本領域通常方法來制備，其方法無特別限定。具體例子可以舉出如下方法將高分子量的透明質酸低分子化利用高溫加熱及超聲波的方法、 利用酸或堿催化劑的方法、利用過硫酸銨等分解催化劑的方法、或使用透明質酸酶的方法寸。相對于組合物總重量，本發明的礦物質成分以0.001 3重量％的量含有。未滿 0. 001重量％時，其效果甚微；超過3重量％時對皮膚的動態平衡有害，因此不優選。上述礦物質可以為選自氯化鎂(magnesium chloride)、氯化鈣(calcium chloride)、氯化鉀(potassium chloride)、氟化鎂(Magnesium fluoride)、氟化猛 (Manganese fluoride) >(Manganese sulfate) >(zinc sulfate)、it美 (magnesium sulfate)以及硫酸銅(copper sulfate)中的一種以上，但并非僅限于此。上述氯化鎂、氯化鈣以及氯化鉀會參與表皮分化，氟化鎂、氟化錳、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂以及硫酸銅等礦物質成分是細胞動態平衡和皮膚保護中所需的。相對于組合物總重量，本發明的維生素以0.001 3重量％的量含有。未滿0.001 重量％時，其效果甚微；超過3重量％時會發生變色、變臭等而阻礙組合物的穩定性。上述維生素可以為選自肌醇、抗壞血酸、泛酸、煙酸、葉酸、硫胺素、核黃素以及其衍生物中的一種以上，但并非僅限于此。本發明的一實施例提供一種作為有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素的用于增進皮膚飽滿感的美容或整形用組合物。相對于組合物總重量，上述有效成分可含有0.0001 0. 1重量％、可優選含有 0.0001 0.001重量％。未達到0.0001重量％時，效果甚微；若超過0. 1重量％時，存在顯示細胞毒性的問題。上述組合物例如可用于以下目的使用，即通過形成乳房組織而進行的隆胸，微細脂肪移植術、自身脂肪移植術等增進臉部皮膚的飽滿感而去除八字型皺紋、眉間皺紋以及維持彈性，但并非僅限于此。上述組合物可根據藥學領域的通常方法來制成適于向患者體內給藥的單位給藥型制劑來進行給藥。符合此目的的劑型優選為作為非口服給藥劑型的注射劑或局部給藥用制劑等。注射用劑型優選為等滲水溶液或懸濁液。但此時能夠將通常使用的填充劑、增量齊U、結合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等稀釋劑或塑形劑一同使用。這樣制備的本發明的制劑可根據通常的方法經非口服，例如向特定部位直接給藥。此時，組合物注入利用注射器來實現。上述組合物的1日給藥量為IXIO5到IXIO7細胞/kg體重、優選為5X IO5到5X IO6細胞/kg體重，可分成1次或數次來給藥。但是，應理解，有效成分的實際給藥量應根據所要分化以及增殖的脂肪細胞的量、給藥途徑、患者的體重、年齡以及性別等多種相關因素來確定，因此，上述給藥量不論是在任何方面上都并非用以對本發明范圍進行限定。本發明的一實施例提供一種作為有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素的用于增進皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物。相對于組合物總重量，上述有效成分可含有0.0001 0. 1重量％、可優選含有 0.0001 0.001重量％。未達到0.0001重量％時，效果甚微；若超過0. 1重量％時，存在顯示細胞毒性的問題。上述皮膚外用劑組合物可以為化妝料組合物或藥物組合物。上述化妝料組合物的劑型沒有特別限制，可按需要適當進行選擇。例如制備成柔膚水、營養化妝水、按摩霜、精華、營養霜或面膜等劑型，但并非僅限于此。上述藥物組合物可以為洗劑、軟膏、凝膠、霜、貼片或噴霧劑等經皮給藥型劑型，但并非僅限于此。就根據各劑型的皮膚外用劑組合物而言，除了上述本發明的組合物之外的其它成分可由本領域技術人員根據其它皮膚外用劑的劑型或使用目的等而毫無難度地進行適當選擇并進行配比，此時，與其它原料一同使用時可起到協同效果。另外，本發明的組合物作為藥物組合物來使用時，可進一步含有防腐劑、穩定劑、 可濕性粉劑或乳化促進劑、用于滲透壓調節的鹽或緩沖劑等藥物輔料以及其它治療上有效的物質，根據通常的方法以多種口服或非口服給藥形態進行劑型化。應理解，有效成分的實際給藥量應根據癥狀的嚴重度、選擇的給藥途徑、對象的年齡、性別、體重以及健康狀態等多種相關因素來決定。通常，有效成分的給藥量為0. OOlmg/kg/日到大約2000mg/kg/日的范圍。更優選的給藥量為0. 5mg/kg/日到2. 5mg/kg/日。根據本發明的增進脂肪來源干細胞的干細胞性的組合物的適用部位包括身體的所有脂肪組織，不限定在特定部位上，例如，可包括脂肪層少的臉部。另外，上述脂肪組織的增加效果有美容或整形目的的脂肪組織增加效果所致的皮膚飽滿感增加效果，但并非限定于此。以下，通過下述實施例以及實驗例來對本發明進行更具體的說明，但這僅僅是用于例示本發明，本發明的范圍不被此限定。[實施例1]以下述表1的組成來制備了模擬細胞外基質(ECM)的組合物。肌醇、抗壞血酸分別作為維生素B、C來使用，煙酰胺作為維生素B3即煙酸的衍生物來使用。硫酸鋅、氯化鉀、 氯化鈣、硫酸鎂以及硫酸銅作為礦物質成分來使用。寡聚透明質酸從BI0LAND株式會社購入而使用，三肽從A&PEP株式會社購入而使用。表 權利要求
1.一種脂肪來源干細胞的干細胞性增進用組合物，其中，作為有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素。
2.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述組合物模擬了細胞外基質。
3.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述脂肪來源干細胞為人脂肪來源干細胞。
4.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述組合物通過增加脂肪組織而使皮膚增進飽滿感。
5.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述組合物增加作為脂肪來源干細胞標記物的⑶四、⑶44、⑶73、⑶90或⑶105表達量。
6.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述組合物增加脂肪來源干細胞的生長因子的表達量。
7.根據權利要求6所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述生長因子為SCF。
8.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，相對于組合物的總重量，所述組合物含有0. 001 3重量％的三肽、0.01 50重量％的低分子量透明質酸、0. 001 3 重量％的礦物質以及0. 001 3重量％的維生素。
9.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，低分子量透明質酸具有500 10000道爾頓的分子量。
10.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述礦物質為選自氯化鎂、 氯化鈣、氯化鉀、氟化鎂、氟化錳、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂以及硫酸銅中的一種以上。
11.根據權利要求1所述的干細胞性增進用組合物，其中，所述維生素為選自肌醇、抗壞血酸、泛酸、煙酸、葉酸、硫胺素、核黃素以及其衍生物中的一種以上。
12.一種用于增進皮膚飽滿感的皮膚美容或整形用組合物，其中，作為有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素。
13.根據權利要求12所述的用于增進皮膚飽滿感的美容或整形用組合物，其中，相對于組合物總重量，含有0. 0001 10重量％的所述有效成分。
14.一種用于增進皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物，其中，作為有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素。
15.根據權利要求14所述的用于增進皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物，其中，相對于組合物總重量，含有0. 0001 10重量％的所述有效成分。
全文摘要
本發明提供一種作為有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羥基脯氨酸(Gly-Pro-Hyp)構成的三肽、低分子量透明質酸、礦物質以及維生素的脂肪來源干細胞的干細胞性增進用組合物。本發明的組合物由于增進脂肪來源干細胞的干細胞性，由此對美容或整形為目的的脂肪組織的增加有用。因此，本發明的組合物能夠增進皮膚飽滿感，促進脂肪來源干細胞的再生，并恢復損傷的皮下脂肪的功能，因此能夠作為用于增進皮膚飽滿感的美容或整形用組合物而使用，并且能夠作為皮膚外用劑組合物來使用。
文檔編號A61K33/34GK102475636SQ201110385108
公開日2012年5月30日 申請日期2011年11月28日 優先權日2010年11月30日
發明者盧旻秀, 李泰龍, 沈重鉉, 沈鐘沅, 申東旭, 金漢坤, 金知賢, 閔大珍 申請人:株式會社愛茉莉太平洋