專利名稱：一種蜂毒的精制方法
技術領域：
本發明涉及一種蜂毒的分離純化方法，具體地說是ー種蜂毒的精制方法。 ニ背景技術：
蜂毒是エ蜂腺體分泌出來的ー種具有芳香氣味的毒液，儲存于毒囊中，當エ蜂攻擊其它物種時由尾部蟄針排出，它是ー種復雜的混合物，其化學組成復雜，主要分為多肽， 大分子量的酶類，小分子量的胺類等物質，肽類主要包括蜂毒素(約占蜂毒干重的50% )， 蜂毒明肽，MCD肽，心臟肽，安度肽，組胺肽等，酶類包括55種以上的酶類物質，其中磷脂酶 A2 (簡稱PLA2,平均分子量14500)是受蜂蜇之后產生過敏反應的主要物質，胺類包括組織胺、兒茶酚胺等其它活性胺類物質，胺類與受蜂蜇產生疼痛有關。蜂毒在民間用于醫療保健歷史悠久，現代研究證實，蜂毒具有抗炎和鎮痛作用，用于治療風濕性關節炎、類風濕性關節炎，強直性脊椎炎等風濕性疾病，周圍神經炎肌神經痛等疾病有確切的療效，然而蜂毒中大分子量的酶類物質容易造成過敏，小分子量的胺類物質容易造成疼痛，極大地影響了蜂毒制劑在臨床上的推廣使用。CN101088514A公開了ー種蜂毒的精制方法，是將粗蜂毒溶于乙醇溶液中去除蜂毒中的蜂膠、蜂蜜等雜質，再采用溶媒萃取方法，得到精制蜂毒。先將粗蜂毒加入95%乙醇制成懸濁液，過濾去除雜質，濾液離心后去除液相，沉淀物加入無水乙醇脫水，再將提出的沉淀物加入水于10士2°C下浸提12-15HR;浸提液用乙醇沉淀，去除乙醇水溶液，沉淀物加入 0. 15-0. 2摩爾的氫氧化銨與正丁醇溶液中萃取，棄除沉淀物，蒸餾萃取液，濃縮物進行冷凍干燥即得到精制蜂毒。CN1416827A公開了ー種蜂毒的提取方法。該發明所述的方法如下將活體大胡蜂剪去羽翅置于有密封蓋的容器內，加入40%以上濃度的乙醇水溶液或者40°C以上的食用酒，使活體大胡蜂完全浸泡于其中，將容器加蓋密封，靜置至少3天，取其容器內下部的乳白色液體，過濾。CN101455287A公開了ー種蜂毒肽的分離提純方法，是將粗蜂毒用水浸洗，濾液用乙醇沉淀，沉淀物用氫氧化銨和正丁醇萃取，萃取液以丙酮沉淀，使沉淀物溶于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換柱上作洗脫層折，柱下收集溶血活性最強吸收峰V的層析餾分濃縮，濃縮液經葡聚糖凝膠G-IO柱脫鹽，丙酮沉淀，再溶解、脫鹽沉淀處理，沉淀物溶于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上以緩沖B液作梯度洗脫，柱下收集吸收峰時層析餾分濃縮、脫鹽冷凍干燥即得到電泳級蜂毒肽。CN1088215A公開了ー種快速從粗蜂毒中分離蜂肽的方法，將粗蜂毒溶解在蒸餾水中，使用超濾膜和透析袋對蜂毒進行分離、純化。
發明內容
本發明旨在提供臨床注射用的精制蜂毒，所要解決的技術問題是盡可能多地除去蜂毒中的酶和生物胺類。
本精制方法包括蜂毒粗品的制備和蜂毒粗品的純化，具體步驟如下1、溶解取蜂毒加5-10倍重量的去離子水溶解后高速離心(3000rpm) 10-15分鐘， 傾出上清液，包括棕灰色殘渣內的殘留物再加去離子水溶解、高速離心后過濾分離，合井水相，備用。高速離心的作用是使油脂狀雜質與殘渣分離，轉移并漂浮在水相的表面。2、沉淀向上述水相中加入1-3倍體積的丙酮，于溫度< -8°c條件下靜置至沉淀完全(實驗表明不少于10小吋)，傾出上清液，向沉淀物中再加入丙酮并搗碎，過濾分離，沉淀物揮去丙酮便得到蜂毒粗品。實驗表明，要使以蜂毒素為主的肽類沉淀完全(> 99% )，丙酮與水溶液的體積比要彡1，取1 1為佳，這樣可節省丙酮用量。3、純化用濃度0. 08-0. 12mol/L醋酸溶液溶解蜂毒粗品，上葡聚糖凝膠G50層析柱，以0. 08-0. 12mol/L醋酸溶液洗脫，并用UV-3000紫外檢測器在280nm波長下進行在線檢測，當第三峰出現時開始收集，至第三峰下降到IOOmV停止收集。向洗脫液中加入活性炭，緩慢攪拌0. 5-1小吋，過濾分離，濾液冷凍干燥，得精制蜂毒。實驗表明葡聚糖凝膠G50可有效去除大分子量的PLA2和HAase (透明質酸酶，分子量45000)等酶類蛋白質，又可去除小分子量的胺類物質。活性炭的作用不僅是脫色，同時可有效去除內毒素，活性炭的加入量為洗脫液質量的0. 02-0. 05%。蜂毒中大分子量物質約占蜂毒干重的16%左右，通過柱色譜分離，大分子量物質含量< 1.5%，蜂毒素含量>76% (粗品中蜂毒素含量45%左右)，本精制蜂毒可直接加工供臨床注射用的凍干制劑。
四
圖1是柱層析時紫外在線檢測圖譜。
五具體實施例方式非限定實施例敘述如下(一)蜂毒粗品的制備1、溶解取蜂毒加入8倍重量的去離子水溶解，高速離心(3000rpm) 12分鐘，傾出上清液， 向殘留物中再加去離子水(同第一次加水量)同法操作，，高速離心后過濾分離，合井水相，2、沉淀向上述水相中加入1倍體積的丙酮，于溫度-10°C下靜置12小時，傾去上清液，向沉淀物中再加入丙酮并搗碎沉淀物，過濾，沉淀物低溫揮去丙酮，得蜂毒粗品。(ニ)粗品的精制3、用0. lmol/L醋酸溶液溶解蜂毒粗品，上葡聚糖凝膠G50層析柱 [(2. 0-10. 0cm) X 100cm]，以 0. lmol/L 醋酸溶液洗脫，流速 5_30mL/min，并用 UV-3000 紫外檢測器在^Onm波長下進行在線檢測，當第三峰出現時開始收集，至第三峰下降到IOOmV停止收集，向洗脫液中加入適量活性炭，緩慢攪拌lh，過濾，濾液冷凍干燥，得精制蜂毒。經測定，蜂毒素含量79. 56%，大分子物質含量1.四％。
蜂毒素的含量按《中國藥典》2010年版一部附錄VID規定的高效液相色譜法測定。大分子物質含量用高效液相色譜法測定，測定條件如下對照品核糖核酸酶A(分子量13700)。由中國藥品生物制品檢定所提供。色譜柱TSKgel G3000pw 凝膠色譜柱(7. 5mm X 300mm)。日本 T0S0H。流動相三氟醋酸-乙腈-水混合液，混合重量比為0. 025 30 70，理論板數按核糖核酸酶A峰計不低于1500。柱溫30°C。流速0. 7mL/min。檢測波長214nm。(三)凍干制劑取甘露醇40g，加入注射用水使溶解，加活性炭適量，加熱至沸15分鐘，濾過，濾液冷至室溫，加入精制蜂毒0. 35g(以蜂毒素計)，攪拌，無菌濾過，定量罐裝制成1000瓶(規格0. 35mg/瓶)或500瓶(規格0. 7mg/瓶)，冷凍干燥，即得。
權利要求
1.一種蜂毒的精制方法，包括蜂毒粗品的制備及其純化，其特征在于所述的蜂毒粗品的制備步驟為(1)溶解取蜂毒加5-10倍重量的去離子水溶解后以3000rpm離心10-15分鐘，傾出上清液，殘留物中再加去離子水溶解、離心后過濾分離，合井水相；(2)沉淀向上述水相中加入1-3倍體積的丙酮于溫度<_8°C下靜置不少于10小吋， 傾出上清液，向沉淀物中加入丙酮并搗碎，過濾分離，沉淀物揮去丙酮便得到蜂毒粗品；所述的純化步驟為(3)純化用濃度0.08-0. 12mol/L醋酸溶液溶解上述粗品，上葡聚糖凝膠G50層析柱，以0. 08-0. 12mol/L醋酸溶液洗脫，并用UV-3000紫外檢測器在280nm波長下進行在線檢測，當第三峰出現時開始收集，至第三峰下降到IOOmV停止收集，向洗脫液中加入活性炭，緩慢攪拌0. 5-1小吋，過濾分離，濾液冷凍干燥；活性炭的加入量為洗脫液質量的 0. 02-0. 05%。
2.根據權利要求1所述的精制方法，其特征在干向水相中加入1倍體積的丙酮于溫度< _8°C下靜置不少于10小吋。
全文摘要
一種蜂毒的精制方法，取蜂毒加5-10倍量的水溶解后高速離心，分離后得到水相；向水相中加入1-3倍體積的丙酮于溫度≤-8℃下靜置至沉淀完全，分離后向沉淀物中加入丙酮并搗碎，過濾分離，沉淀物揮去丙酮得到蜂毒粗品；粗品用0.08-0.12mol/L醋酸溶液溶解后用葡聚糖凝膠G50層析柱分離純化，用同濃度的醋酸溶液洗脫，并用紫外檢測器在280nm波長下在線檢測，收集第三峰的洗脫液，加活性炭，緩慢攪拌，分離后濾液冷凍干燥。本精制蜂毒中，蜂毒素含量≥76％，大分子物質含量＜1.5％，可直接加供臨床注射用的凍干劑。
文檔編號A61P29/00GK102526116SQ20111037559
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月23日 優先權日2011年11月23日
發明者畢焰華, 王友軍, 程文顯, 花家元 申請人:程文顯