專利名稱：海葵強心肽及其提取方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽，尤其涉及一種來自海葵毒素的強心肽，本發明還涉及該強心肽的提取方法及應用。
背景技術：
海葵又名海菊花，屬于腔腸動物門(Coelenterata)、珊瑚蟲綱(Anthozoa)、六放珊瑚亞綱(Hexacorallia)，目前已報道的超過1000種，其中中國約占10%。海葵主要通過刺細胞分泌毒液捕食魚、貝類、橈足類、甲殼類動物以及蠕蟲，其毒液中富含各種多肽成分，是目前生物毒素研究的重要內容，也是海洋藥物開發的主要來源之一。海葵毒素包括神經毒素和細胞毒素，目前已經從約40種海葵中分離到超過300種毒素多肽分子，主要包括鈉離子通道毒素，鉀離子通道毒素，酸敏感質子通道毒素，海葵溶細胞毒素以及酶抑制劑等，其中海葵鈉離子通道毒素是一類分子量為3-5kDa的多肽分子，通常含有3-4對二硫鍵， 目前已鑒定的海葵鈉離子通道毒素超過50種，由于海葵鈉離子通道毒素專一性強，活性特殊，是海葵毒素中最令人感興趣的研究對象，也是研究鈉離子通道結構與功能以及鈉離子通道相關疾病的主要工具試劑和潛在的藥物。電壓門控鈉離子通道具有廣泛的生理功能，特別是在可興奮細胞中介導了動作電位的發放。海葵毒素中富含各種針對電壓門控離子通道起作用的多肽分子，是篩選離子通道研究相關工具試劑以及離子通道相關疾病的藥物先導分子的資源寶庫。目前已鑒定的海葵鈉離子通道毒素絕大多數的作用機制在于抑制電壓門控鈉離子通道的失活，增加鈉離子內流，是一類興奮性毒素多肽。海葵毒素中的鈉離子通道毒素以其高度特異性和較強的活性，有助于發現和鑒定新型電壓門控鈉離子通道蛋白、分析鈉離子通道蛋白的結構與功能、 研究鈉離子通道的組織特異性、治療鈉離子通道相關疾病等。目前國際上研究得最多的海葵毒素為Anthopleurin-A(Ap-A)，Ap-A能專一地和興奮組織(如神經、心肌、骨骼肌)細胞膜上電壓依賴Na離子通道結合，其結合部位是Na 離子通道3位點.毒素與Na離子通道結合后，能夠延長Na離子通道的開放，增加Na離子內流，使細胞內Na離子度增高，并進一步通過Na/Ca交換機制和繼發的鈣通道開放和刺激內鈣釋放，導致細胞內的Ca離子濃度增加，從而增強心肌的收縮.在增強心肌收縮的同時， 對實驗動物的心率、血壓沒有影響。另外，Ap-A還具有抗心律失常的作用，能夠延長心肌細胞的動作電位時程，與3類抗心律失常藥的作用機理類似，因而Ap-A已成為最有希望開發成強心肽的多肽毒素。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述的技術現狀而提供一種新的海葵強心肽。 本發明中將這種海葵強心肽命名為AX-1。本發明所要解決的又一個技術問題是提供一種海葵強心肽的提取方法。本發明所要解決的又一個技術問題是提供一種海葵強心肽的應用。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種海葵強心肽，其特征在于具有如下氨基酸序列1 6 11 16 21 26 31 36 41 46GGVPC LCDSD GPSVR GNTLS GIIffL RGCPS GffHNC KAHGP TIGffC CKQ。進一步，該氨基酸序列中包含6個半胱氨酸，形成三對二硫鍵，二硫鍵連接方式分別為I-V、II-IV和III-VI ；所述強心肽的分子量為5018. 2Da。進一步，該強心肽空間結構包含三段反平行β-折疊片，分別為3-5號，21- 號以及46-47號氨基酸殘基構成的肽段；由三段反平行β-折疊片連接分子中的兩個大的環，分別為6-20號以及25-45號氨基酸殘基所在肽段。一種海葵強心肽的提取方法，其特征在于包括如下步驟①采用丙酮分級沉淀法對海葵粗毒液進行初步抽提；②將初步抽提樣品以去離子水溶解，過濾后，上樣反相高效液相色譜進行分離，首先，采用半制備型C8反相柱樣品進行分離，收集主峰，冷凍干燥；③利用分析型C18反相柱進行精細分離，獲得所需的強心肽。所述的海葵粗毒液采用反復凍融法從海葵中提取。步驟①如下丙酮事先在-20°C條件下進行預冷，之后在海葵粗毒液中分別加入 20%,50%,80%的丙酮進行分級沉淀，得到初步提取樣品。步驟②中半制備型C8反相柱樣品進行分離過程如下采用XBridgeTM C8半制備型反相柱，洗脫液分別為含0. TFA的水以及含0. TFA的乙腈；采用線性梯度洗脫，30 分鐘內乙腈濃度由5%上升到45% ；流速為2. 5ml/min收集紫外吸收值最高的主峰。步驟③如下采用反相色譜柱為218TPM C18，洗脫液分別為含0. 1 % TFA的水和乙腈；采用線性梯度洗脫，50min內，乙腈濃度從20%上升到40%，流速為lml/min，收集紫外吸收值最高的主峰，經冷凍干燥后備用。一種海葵強心肽在制備心血管疾病藥物中的應用。一種海葵強心肽在制備心力衰減或心律失常疾病藥物中的應用。海葵強心肽AX-I的鑒定利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)質譜(Voyager-DETMSTR Biospectromitry workstation，美國 Applied Biosystems 公司)測定毒素多肽的精確分子量。AX-I的氨基酸序列測定采用N-端Edman降解法在美國ABI公司的ftx)cise 491-A 型蛋白質測序儀上進行。AX-I的空間結構利用結構模擬軟件ESyPred3D，以來海葵毒素Ap-A的空間結構 (PDB編號1AHL)為模板，對其進行空間結構模擬，獲得AX-I的主鏈空間結構。海葵強心肽的AX-I的活性機制鈉電流和鈣電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用放大器EPC9(HEKA公司Electronic!，Lambrecht, German)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統采用 Pulse+PulsefitS. 0軟件。采用全細胞膜片鉗技術檢測AX-I對大鼠心肌細胞鈉離子通道蛋白的失活以及對心肌細胞鈉離子電流的影響。串聯電阻控制在5ΜΩ左右，線性電容電流和漏電流用P/4程序差減。實驗過程中均采用微量注射器(IM-5B，Narishige)將適當濃度的
4毒素滴入距實驗細胞80 100 μ m的周圍，加藥完畢，立即對實驗細胞進行電刺激誘導，觀察毒素對電流的影響。采用SigmaPlot 8. 0軟件分析試驗結果。與現有技術相比，本發明的優點在于通過海葵強心肽AX-I活性機制的實驗，證明海葵強心肽AX-I對大鼠心肌細胞鈉離子通道具有抑制失活，增強鈉離子電流峰值的功能，是一種可用于治療心率衰竭，心律失常等心血管疾病的候選藥物。
圖1為80%丙酮沉淀后舟山黃海葵粗毒經半制備型C8反相柱分離后的洗脫曲線圖。圖2為舟山黃海葵粗毒經C8反相柱分離后收集的主峰經分析型C18進一步分離后的洗脫曲線圖。圖3為最終提取的海葵強心肽AX-I的分子量質譜鑒定圖。圖4為不同濃度海葵強心肽AX-I對大鼠心肌細胞鈉離子通道電流的作用機制圖。圖5為未加AX-I和加入AX-I后對大鼠心肌細胞鈉離子通道電流I_V曲線比較圖。圖6為未加AX-I和加入AX-I后對大鼠心肌細胞鈉離子通道電導曲線比較圖。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。海葵粗毒的提取取出海葵，用去離子水沖洗干凈，置入IOOOml去離子水(含15ml 0. 5M EDTA, 300 μ L2mg/ml抑肽酶)，混勻后迅速在_80°C條件下冷凍；冷凍12小時后，取出冷凍的海葵，在室溫下溶解，待冰凍的海葵全部融化后，將海葵樣品再次放置在-80°C的冷凍箱內，冷凍12小時；之后取出冷凍的海葵樣品，置于室溫下充分融化，上述步驟重復2-3次；將融化后的海葵樣品用紗布包裹對其進行粗過濾，去掉海葵軀體等雜質，取其濾液；將濾液置于高速冷凍離心機中，在4°C、20000 X g條件下，離心20min，取其上清液；重復過濾兩次后，上清液備用，即為海葵粗毒樣品，置于4°C保存備用。采用丙酮分級沉淀法對海葵粗毒液進行初步的抽提。丙酮事先在-20°C條件下進行預冷，之后在海葵粗毒液中分別加入20 %，50%，80 %的丙酮進行分級沉淀，每一步所得沉淀在4°C、15000 X g條件下，離心lOmin，所得沉淀收集后冷凍干燥，保存于_20°C冰箱中海葵強心肽AX-I的提取重點對海葵粗毒經80%丙酮沉淀所得樣品進行進一步分離純化。沉淀樣品以去離子水溶解，經0. 45m孔徑濾頭過濾后，上樣反相高效液相色譜進行分離。所有分離步驟均在 Waters 600E型高效液相色譜儀上完成，檢測器為Waters M87型紫外檢測器，檢測波長為 280nmo第一步采用XBridgeTM C8半制備型反相柱(10*250mm，美國waters公司)，洗脫液分別為含0. 1% TFA(ν/ν)的水(Α液)以及含0. 1% TFA(ν/ν)的乙腈(B液)；采用線性梯度洗脫，30分鐘內B液濃度由5%上升到45% ；流速為2. 5ml/min收集紫外吸收值最高的主峰，經冷凍干燥后置于冰箱中保存備用，見附圖1所示，圖中的“*”號標注為所收集的
5主峰。第二步對上述步驟中收集紫外吸收值最高的主峰成分進行進一步反相高效液相色譜分離，反相色譜柱為218TPM C18(4.6X250mm, Vydac公司)，洗脫液分別為含0. 1% TFA的水(A液)和乙腈(B液)；采用線性梯度洗脫，50min內，B液從20%上升到40%，流速為lml/min，收集紫外吸收值最高的主峰，經冷凍干燥后進行鑒定，見附圖2所示，圖中的 “*”號標注為所收集的主峰。海葵毒素AX-I的鑒定利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)質譜(Voyager-DETMSTRB iospectromitry workstation，美國 Applied Biosystems 公司)測定毒素多肽的精確分子量。采用線性陽離子模式A2光源337nm;離子加速電壓為20000V。基質為α-氰基-4-羥基-肉桂酸(α -cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, CCA)，通過以下方式制備樣品取1 μ L 樣品液加入到9 μ L CCA的50%乙腈飽和溶液(含0. 1 % TFA)，混勻后取1 μ L點樣，室溫干燥后進行質譜測定，分子量以內標法進行校正。如圖3所示，質譜結果表明，所提取的舟山黃海葵強心肽AX-I的精確分子量為5018. 2Da，且純度較高。AX-I的氨基酸序列測定采用N-端Edman降解法在美國ABI公司的ftx)cise 491-A 型蛋白質測序儀上進行。采用儀器配備的標準程序測序，測50個循環，在線反相高效液相色譜檢測并結合氨基酸標準圖譜判斷氨基酸種類，最終準確讀出所測樣品的氨基酸序列。 序列分析結果表明，AX-I由48個氨基酸殘基構成，其序列如下GGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGIIffLRGCPSGffHNCKAHGP TIGffCCKQ ；序列中包括六個半胱氨酸，根據質譜分子量和理論分子量差值，判斷AX-I形成三隊二硫鍵。海葵毒素多肽的空間結構利用結構模擬軟件ESyPred3D，以來自黃海葵的毒素 Ap-A的空間結構(PDB編號1AHL)為模板，對其進行空間結構模擬，獲得舟山黃海葵毒素多肽的主鏈空間結構。結構分析表明，AX-I采取了與Ap-A類似的主鏈結構，其結構中包含三段反平行β-折疊片，分別為3-5號，21-Μ號以及46-47號氨基酸殘基構成的肽段；由三段反平行β-折疊片連接分子中的兩個大的環(loop)，分別為6-20號以及25-45號氨基酸殘基所在肽段。其分子中四個關鍵氨基酸殘基的分布與Ap-A類似，由ASp8，ASplO，LyS36， His38的側鏈在空間上聚集分布，形成AX-I的活性位點。海葵強心肽AX-I的活性機制鈉電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用放大器EPC9(HEKA公司Electronic!， Lambrecht, German)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統采用Pulse+Pulsefit 8. 0軟件。玻璃電極管為100yL(VWR micropipettes,VffR Company)硼硅酸鹽玻璃毛細管。玻璃電極兩步拉制而成，經拋光儀(Narishige，Japan)拋光后電極尖端直徑約為3 μ m，充灌電極液后電極電阻為1-3ΜΩ。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動上下不超過2°C。記錄大鼠心肌細胞鈉電流的細胞外液(單位mM) :NaCl 145，KCl 5. 5，MgCl2 1， CdCl22, glucose 10，HERES 10，用 IMNaOH 和 IMHCl 將 pH 值調至 7. 4 ；電極內液(mM) KCl 155，MgCl2 1，Na2-ATP 3，Tris phosphocreatine 5，HERES 10，用 IM KOH 禾口 IM HCl 將 PH值調至7.4。以上細胞內液和外液均經0. 22 μ m濾膜過濾。室溫下，倒置顯微鏡下挑選合適細胞，當鉗制微玻璃管封接上細胞形成了高阻(1-5G)后，自動執行C-fast電容補償，預鉗制于_60mV，進一步抽吸微電極，使細胞膜破裂從而形成全細胞鉗制記錄模式(Whole-cell patchclamp) 0自動執行C-slow電容補償和串聯電阻(R series)補償，鉗制于目標電位，形成電壓鉗，膜電流應用IOKHz濾波，穩定4-6min后，施加去極化脈沖，測試通道電流情況。膜片鉗放大器為 EPC-9 型(List-Electronic，German)，使用 Pulse/Pulsef it 8· 0 軟件(ΗΕΚΑ Electronics, Germany)收集和分析記錄數據。串聯電阻控制在5ΜΩ左右，線性電容電流和漏電流用P/4程序差減。實驗過程中均采用微量注射器(IM-5B，Narishige)將適當濃度的毒素滴入距實驗細胞80 IOOym的周圍，加藥完畢，立即對實驗細胞進行電刺激誘導， 觀察毒素對電流的影響。采用SigmaPlot 8. 0軟件分析試驗結果。海葵毒素AX-I對大鼠DRG神經元鈉通道的作用。將細胞膜電位鉗制在_80mV，以 50ms的時程給予一測試電壓-10mV，每隔5s重復一次。結合圖4所示，1 μ M，10 μ MAX-I均能增大鈉通道電流，同時也能延緩鈉離子通道的失活。1 μ MAX-I能增加大鼠心肌細胞的鈉通道電流約149. 29 士 ；35. 24%，10 μ M AX-1增大鈉通道電流約340. 73 士四.79%，同時也能明顯延緩鈉通道的快速失活時間。在空白對照條件下，鈉電流在去極化5ms時幾乎完全失活，但加毒素后，去極化5ms時鈉電流并未失活，這表明海葵毒素AX-I不僅能增加大鼠心肌細胞上的鈉電流強度，同時能延緩鈉通道的失活。海葵毒素AX-I對鈉通道動力學影響。細胞鉗制電位_80mV，測試電壓變化范圍從-80mV +50mV，測試電壓持續時間50ms，躍遷步幅+10mV。圖5為未加毒素和加入毒素后I-V曲線變化，10 μ M毒素使鈉通道的I-V曲線往超極化方向漂移。圖6為未加毒素和加入毒素后電導曲線變化，10 μ M毒素使鈉通道的電導曲線往超極化方向漂移。在全細胞模式下，檢測AX-I對心肌細胞上鈉離子通道電流-電壓曲線影響(I-V)，以判斷毒素對鈉離子通道開放的影響。細胞鉗制電位_80mV，測試電壓變化范圍從-80mV +50mV，測試電壓持續時間50ms，躍遷步幅+10mV。在沒有加毒素對照條件下，心肌鈉通道的起始激活電壓為_30mV，最大峰值電流激活電壓為-10mV，逆轉電位為+25mV左右。加入IOyM毒素后，鈉通道的起始激活電壓為-40mV，最大峰值電流激活電壓為-20mV，10 μ M的毒素使鈉離子通道I-V曲線往超極化方向漂移10mV，同時也大幅度增加鈉通道I-V曲線峰值電流幅度。電導曲線同樣顯示，10 μ MAX-I毒素能使鈉通道的激活往超極化方向漂移。本實施例中的舟山黃海葵分布廣泛，材料易得，利用本實施例提供的提取方法，可以從一公斤海葵中提取AX-I大約20毫克。
權利要求
1.一種海葵強心肽，其特征在于具有如下氨基酸序列1 6 11 16 21 26 31 36 41 46GGVPC LCDSD GPSVR GNTLS GIIffL RGCPS GffHNC KAHGP TIGffC CKQ。
2.根據權利要求1所述的海葵強心肽，其特征在于該氨基酸序列中包含6個半胱氨酸，形成三對二硫鍵，二硫鍵連接方式分別為I-V、II-IV和III-VI ；所述強心肽的分子量為 5018.2Da0
3.根據權利要求2所述的海葵強心肽，其特征在于該強心肽空間結構包含三段反平行 β-折疊片，分別為3-5號，21-Μ號以及46-47號氨基酸殘基構成的肽段；由三段反平行 β -折疊片連接分子中的兩個大的環，分別為6-20號以及25-45號氨基酸殘基所在肽段。
4.權利要求1 3中任意一種海葵強心肽的提取方法，其特征在于包括如下步驟①采用丙酮分級沉淀法對海葵粗毒液進行初步抽提；②將初步抽提樣品以去離子水溶解，過濾后，上樣反相高效液相色譜進行分離，首先， 采用半制備型C8反相柱樣品進行分離，收集主峰，冷凍干燥；③利用分析型C18反相柱進行精細分離，獲得所需的強心肽。
5.根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于所述的海葵粗毒液采用反復凍融法從海葵中提取。
6.根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟①如下丙酮事先在-20°C條件下進行預冷，之后在海葵粗毒液中分別加入20 %，50 %，80 %的丙酮進行分級沉淀，得到初步提取樣品。
7.根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟②中半制備型C8反相柱樣品進行分離過程如下采用XBridgeTM C8半制備型反相柱，洗脫液分別為含0. 1 % TFA的水以及含0. TFA的乙腈；采用線性梯度洗脫，30分鐘內乙腈濃度由5%上升到45% ；流速為 2. 5ml/min收集紫外吸收值最高的主峰。
8.根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟③如下采用反相色譜柱為 218TP54C18，洗脫液分別為含0. 1% TFA的水和乙腈；采用線性梯度洗脫，50min內，乙腈濃度從20%上升到40%，流速為lml/min，收集紫外吸收值最高的主峰，經冷凍干燥后備用。
9.權利要求1 3中任意一種海葵強心肽在制備心血管疾病藥物中的應用。
10.權利要求1 3中任意一種海葵強心肽在制備心力衰減或心律失常疾病藥物中的應用。
全文摘要
一種海葵強心肽，具有如下氨基酸序列GGVPC LCDSD GPSVR GNTLS GIIWL RGCPS GWHNC KAHGP TIGWC CKQ。本發明還公開了該海葵強心肽的提取方法和應用。與現有技術相比，本發明的優點在于與現有技術相比，本發明的優點在于通過海葵強心肽AX-1活性機制的實驗，證明海葵強心肽AX-1對大鼠心肌細胞鈉離子通道具有抑制失活，增強鈉離子電流峰值的功能，是一種可用于治療心率衰竭，心律失常等心血管疾病的候選藥物。
文檔編號A61K38/17GK102399280SQ201110370900
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月21日 優先權日2011年11月7日
發明者劉少華, 廖智, 楊林, 石戈 申請人:浙江海洋學院