專利名稱：藍莓提取物用于預防阿爾茨海默病的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥學領域。具體涉及藍莓提取物對β -淀粉樣蛋白及同型半胱氨酸誘導的PC12細胞損傷的保護作用。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s Disease,AD)是一種神經退行性疾病。主要的臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化，并伴隨各種神經精神癥狀和行為障礙。在我國65歲以上的老年人中患病率約為5%。AD的主要病理特征之一是在大腦皮層和海馬出現由β -淀粉樣蛋白(Αβ)聚積形成的老年斑(SP)。大量研究已經表明，Αβ在AD的病中起著相當重要的作用。Αβ的神經毒性能引起氧化應激，線粒體損傷，激活凋亡因子，啟動細胞的凋亡。同時，臨床研究證明血漿中同型半胱氨酸水平增高可增加AD的發病率。因此，減少Αβ的生 成，抑制Αβ或同型半胱氨酸引起的神經損傷是研究AD治療的熱點之一。目前治療AD的藥物主要是神經營養藥、擬膽堿藥或膽堿酯酶抑制劑，均屬對證治療藥物，不能減緩AD病情的發展。藍莓(Vaccinium myrtillus L.)制劑現已廣泛用于各種保健品，可預防眼科及心血管方面的疾病。然而藍莓提取物對AD的預防作用還未見報道。
發明內容
本發明的目的是為藍莓物用于預防海默病提供細胞水平的依據。發明人經過多次藥理學實驗，發現含25 %總花青素的藍莓提取物可有效對抗A β 25_35及同型半胱氨酸引起的細胞毒性，抵制細胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3的表過。該藥理作用在本發明以前尚無文獻報道。
圖1，和對照組比較，經Αβ25_35處理后細胞核出現凋亡特征表現為細胞核變小或破碎，熒光增強。藍莓提取物預處理可有效抑制A β25_35誘導的細胞凋亡。藍莓提取物對A β 25_35誘導的PC12細胞凋亡的影響(Α :對照組，B Α β 25_35處理組，C :25 μ M藍莓提取物預處理組，D :50 μ M藍莓提取物預處理組)圖2，和對照組比較Αβ 25_35處理后PC12細胞caspase-3的表達顯著增高。藍莓提取物預處理可有效降低caspase-3的表達。藍莓提取物抑制A β 25_35誘導的caspase-3表達增高。
具體實施例方式細胞培養PC12細胞于37°C、5% CO2培養箱培養。培養基為含8%胎牛血清，8%馬血清的DMEM培養液。取對數生長期的細胞以1Χ 104/100 μ I接種于96孔板，37°C培養24h。藥物處理藍莓提取物由香港東方保健品公司提供。細胞加入終濃度為0-50 μ M的藍莓提取物，培養24h以觀察藍莓提取物的細胞毒性。細胞先不同濃度的藍莓提取物預處理lh，再加入O. 5 μ M A β 25_35或5mM同型半胱氨酸繼續培養24h以觀察藍莓提取物對Aβ 25-35及同型半胱氨酸毒性的對抗作用。MTT細胞活力測定藥物處理后，去除培養液，每孔加入50 μ IMTT溶液(終濃度
O.5mg/ml)，37°C培養 4h 后，每孔加入 50 μ IMTT 裂解液(20% SDS, 50% DMFpH4. 7)，37°C 反應過夜。酶標儀檢測各組細胞570nm的OD值。將OD值轉換為百分比(％ )。未經藥物處理的細胞OD值設為100%。每組6空對照，結果用X土SD表示。熒光顯微鏡檢測細胞凋亡將生產良好的PC12細胞接種于6孔板，37°C孵育24h。分組及藥物處理同上。棄除培養液，用4%多聚甲醛于4°C固定30min。用磷酸緩沖液(O. IMPBS, pH7. 4)漂洗后，加入終濃度為5 μ g/ml的Hochest33258避光染色lOmin，PBS漂洗后
封片，熒光顯微鏡觀察細胞核凋亡。Western blot 檢測 caspase-3 的表達方法將生長良好的PC12細胞接種于6孔板，37°C孵育24h。分組及藥物處理同上。用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。電泳后蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液(含O. 05%Tween20的TBS緩沖液)室溫封閉lh。將膜與溶解于TBST緩沖液的caspase-3 —抗4°C孵育過夜。TBST洗滌5minX 3次后，將膜與溶解于TBST緩沖液的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育Ih。TBST洗滌5minX3次，用ECL化學發光法檢測蛋白表達。附圖I說明和對照組比較，經Αβ25_35處理后細胞核出現凋亡特征表現為細胞核變小或破碎，熒光增強。藍莓提取物預處理可有效抑制A β 25_35誘導的細胞凋亡。藍莓提取物對Αβ25_35誘導的PC12細胞凋亡的影響(Α :對照組，B :Αβ25_35&理組，C : 25 μ M藍莓提取物預處理組，D : 50 μ M藍莓提取物預處理組)附圖2說明和對照組比較Αβ 25_35處理后PC12細胞caspase-3的表達顯著提高。藍莓提取物預處理可有效降低caspase-3的表達。
權利要求
1.藍莓提取物對β-淀粉樣蛋白致PC12細胞損傷的保護作用。
2.藍莓提取物對同型半胱氨酸致PC12細胞損傷的保護作用。
3.藍莓提取物對β-淀粉樣蛋白致PC12細胞核凋亡的抑制作用。
4.藍莓提取物對β_淀粉樣蛋白致caspase-3表達增強的抑制作用。
5.藍莓提取物對阿爾茨海默病的預防作用。
6.如權利要求1-4任一項中的應用，其中所述的藍莓提取物有效成分含25%的總花青素。
全文摘要
本發明藍莓提取物用于預防阿爾茨海默病，首次通過體外實驗證明，含25％總花青素的藍莓提取物可有效抑制β-淀粉樣蛋白及同型半胱氨酸引起的PC12細胞凋亡。藍莓提取物可進一步開發用于預防阿爾茨海默病。
文檔編號A61P25/28GK102641351SQ20111036751
公開日2012年8月22日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者劉靜怡, 張艷波, 施祖榮, 童瑤 申請人:張艷波