專利名稱：一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，尤其涉及采用現代藥劑學技術制備一種載多西他賽的溫度敏感型納米膠束，其在超聲波產生的熱效應下發生相轉變，從納米級膠束轉變成微米級栓塞劑，可達到腫瘤血管栓塞與化療的雙重抗腫瘤作用，操作簡便，安全高效，具有廣泛的臨床應用前景。
背景技術：
經導管動脈栓塞化療TACE將化療藥物與栓塞劑混合在一起經導管注入腫瘤供血靶動脈，一方面使腫瘤供血動脈栓塞，造成腫瘤組織缺血壞死，另一方面提高了腫瘤局部藥物濃度，延長藥物與腫瘤組織的接觸時間，具有栓塞與化療的雙重抗腫瘤作用，已經廣泛應用于肝癌、顱腦腫瘤、婦科腫瘤等的治療。但TACE也存在某些不足，如對于散在分布的多發腫瘤栓塞較困難，具有放射污染，單純栓塞腫瘤動脈可能導致癌細胞殘留或腫瘤側枝循環形成腫瘤復發，且患者經濟負擔大等。多西他賽是一種高效、抗瘤譜廣的抗腫瘤藥物，可通過抑制細胞微管解聚，抑制 DNA、RNA或蛋白質的合成，導致細胞死亡，已經廣泛應用于乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等疾病的治療。但多西他賽難溶于水，目前臨床使用的制劑多采用表面活性劑吐溫80和乙醇增溶，易導致患者發生過敏反應，化療前后需口服大量糖皮質激素等進行預防。因此，改進多西他賽的劑型，提高藥物的水溶性，可有效減少過敏反應的發生率。聚合物膠束系統在水溶液中自組裝形成親水性外殼和疏水內核“核-殼”結構。 疏水性內核包載難溶性藥物如多西他賽，可增加藥物溶解度，并且保護藥物的穩定性。聚乳酸羥基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)三嵌段共聚物具有溫度敏感性，且生物相容性好，可生物降解，在體內最終降解成二氧化碳和水，無毒副作用。疏水嵌段 PLGA構成內核，可作為微藥庫通過物理包埋方式結合疏水性藥物如多西他賽，增加疏水性藥物的水溶性。親水性的PEG形成外殼，保護膠束免受網狀內皮系統的捕獲清除，延長藥物在血液循環中的存在時間，還可在一定程度上避免藥物的分解及腫瘤細胞對藥物的識別與外排，降低藥物的毒性及腫瘤細胞多藥耐藥性的發生。超聲波是一種正負交替的疏密機械波，具有相對無創性，能穿透到機體的深部組織，超聲頻率與劑量、超聲發射周期等參數可準確調控等優點。在超聲波與生物組織相互作用的過程中，超聲波會產生熱效應、空化效應、機械效應和理化效應等，可提高腫瘤局部的血管及細胞通透性，誘導腫瘤細胞凋亡壞死等。乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤發病率中居第1 位。全世界每年新發的乳腺癌患者約有120萬，約50萬婦女死于乳腺癌。三陰性乳腺癌是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2表達缺失的乳腺癌，約占乳腺癌的 10%-20%。三陰性乳腺癌具有特殊的生物學行為和臨床病理特征，臨床表現為侵襲力強、遠處轉移風險高和預后較差等特點。由于缺乏相應受體不能進行內分泌及生物治療，目前這類特殊類型乳腺癌的全身治療僅限于化療，但單純化療效果欠佳，腫瘤細胞容易發生多藥耐藥。下面是本發明通過超聲波輻照產生的熱效應使載多西他賽的溫敏型納米膠束發生相轉變，形成微米級的血管栓塞劑，使腫瘤局部血管發生栓塞，在腫瘤局部緩慢釋放藥物，達到栓塞與化學治療的雙重效果，此外，超聲波空化效應、機械效應等可預防腫瘤細胞發生多藥耐藥。
發明內容
本發明的目的在于提供一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，該制劑以高分子聚合物包載多西他賽形成納米粒，通過超聲波輻照產生的熱效應使其在腫瘤局部發生相轉變，形成微米級的栓塞劑，并在腫瘤局部釋放藥物，達到栓塞腫瘤血管與化療的雙重療效。本發明的目的是這樣實現的，所述的超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，包括高分子聚合物和多西他賽，所述高分子聚合物采用聚乙二醇(PEG) /聚(D，L-乳酸一 CO-乙醇酸)(PLGA)共聚物體系，共聚物體系采用聚乙二醇一聚乳酸羥基乙酸一聚乙二醇(PEG-PLGA-PEG )、聚乙二醇一聚乳酸一聚乙二醇(PEG-PLLA-PEG )、聚乳酸羥基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羥基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)或聚乙二醇/聚乳酸羥基乙酸(PEG/PLGA)接枝聚合物，其特征在于多西他賽與共聚物體系的質量百分比為1 20至1 5，采用直接溶解法、乳化溶劑揮發法或透析法制備成載多西他賽共聚物納米膠束。所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，其特征在于所制備的載多西他賽共聚物納米膠束的包封率達96-99wt %，載藥率達3-7 Wt %。本發明的高分子聚合物可以采用聚乙二醇(PEG)/聚(D，L_乳酸一 CO-乙醇酸)(PLGA)共聚物體系，包括聚乙二醇一聚乳酸羥基乙酸一聚乙二醇(PEG-PLGA-PEG)、聚乙二醇一聚乳酸一聚乙二醇(PEG-PLLA-PEG)、聚乳酸羥基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羥基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)或聚乙二醇/聚乳酸羥基乙酸(PEG/PLGA)接枝聚合物等，其中以 PLGA-PEG-PLGA最為優選。PLGA-PEG-PLGA聚合物主要采用開環聚合的方法合成，通過調節合成材料如聚乙二醇的分子量和質量百分數、丙交酯和乙交酯的摩爾比，可以調整聚合物的相轉變溫度。合成聚合物的組成為聚乳酸羥基乙酸質量百分比50-75%，聚乙二醇分子量介于1000-2000dal，質量百分比為25_50%，合成聚乳酸羥基乙酸鏈段的丙交酯摩爾百分比為60-80%，乙交酯的摩爾百分比為20-40%。載多西他賽納米膠束可以采用直接溶解法、乳化溶劑揮發法、透析法等制備，其中以直接溶解法制備更優。優選方法為取雙蒸水配制的PLGA-PEG-PLGA共聚物溶液1 mL，加入多西他賽無水乙醇溶液，渦旋震蕩3 min，超聲分散10 min, 10 000 r/min離心5 min，上清液即為載多西他賽共聚物納米膠束。載藥納米膠束真空冷凍干燥，6°Co輻照滅菌后，4°C環境保存備用。多西他賽與PLGA-PEG-PLGA聚合物的質量百分比為1 20至1 5，其中以1 20 為最佳配比，即20份的PLGA-PEG-PLGA聚合物中含有1份多西他賽，所制備的載藥納米膠束具有理想的載藥率和包封率。采用直接溶解法制備多西他賽納米膠束，使多西他賽納米膠束中的多西他賽在水中的溶解度達到40mg/ml，比單純多西他賽提高了近8000倍。多西他賽納米膠束具有一定的緩釋作用，在磷酸鹽緩沖溶液中較平穩釋放，無明顯突釋效應，68 h累積釋放78. 83 wt%0制備成緩釋的多西他賽納米膠束對小鼠的毒性明顯降低，靜脈注射
4的小鼠半數致死量為273. 5 mg/kg，明顯高于多西他賽的47. 3 mg/kg。載多西他賽納米膠束具有溫度敏感性，在環境溫度低于38. 5°C時呈透明的液體，提高溫度到38. 5度以上則變渾濁，顯微鏡下觀察可見長約50um，寬約15um的“紡錘形”栓塞劑。本發明所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑的具體制備方法，包括如下步驟1)采用開環聚合法合成PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物分別稱取相對分子質量為1500和2000的PEG，在95°C真空環境中干燥，然后加入丙交酯和乙交酯，繼續真空干燥后，加入催化劑氯化亞錫，充入氮氣，在140°C條件下反應，抽真空，自然冷卻，得淡黃色的PLGA-PEG-PLGA共聚物；2)采用直接溶解法制備載藥共聚物納米膠束以雙蒸水配制質量分數為5%的步驟1)制備獲得的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物溶液，加入濃度為100 mg/mL的多西他賽無水乙醇溶液，渦旋震蕩，超聲分散，離心獲得上清液，上清液即為載多西他賽共聚物納米膠束；3)載多西他賽共聚物納米膠束真空冷凍干燥，6tlCo輻照滅菌后，4°C 環境保存。本發明所述的腫瘤血管栓塞化療新制劑在制備抑制腫瘤的藥物中的應用。本發明所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑在制備超聲介導下化療乳腺癌的藥物中的應用。本發明的優點為本發明制備的多西他賽溫敏型膠束通過裸鼠尾靜脈注射，超聲波輻照裸鼠皮下移植腫瘤，使腫瘤局部溫度升高，通過血液循環到到腫瘤局部的多西他賽納米膠束發生相轉變，形成微米級的栓塞劑，栓塞腫瘤局部血管，并在局部釋放藥物，達到化療與栓塞的雙重效果。此外，超聲波空化效應、機械效應等可預防腫瘤細胞發生多藥耐藥。本發明用于提高腫瘤局部溫度的方法包括超聲輻照、紅外線等多種物理方法，其中以超聲輻照為佳。本發明操作非常方便，避免了 TACE的放射污染，全身毒副作用低。本發明可適用于機體大部分腫瘤，包括乳腺、甲狀腺、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、腹膜后等多種腫瘤。
圖1為多西他賽納米膠束的掃描電鏡圖(X 200 000)。圖2為多西他賽納米膠束發生相轉變，形成微米級栓塞劑圖(X40)。圖3為本發明的多西他賽納米膠束體外釋放曲線圖。圖4A為本發明的乳腺癌栓塞化療前的超聲造影圖。圖4B為本發明的乳腺癌栓塞化療后的超聲造影圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細說明 實施例1 PLGA-PEG-PLGA的合成
采用開環聚合法合成PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物。分別稱取相對分子質量為1500 和2000的PEG各1.5 g，在95°C真空環境中干燥3 11，加入3.6 g丙交酯、2 g乙交酯，繼續真空干燥30 min，加入催化劑氯化亞錫50 mg，充入氮氣，在140°C條件下反應8 h后，抽真空30 min,自然冷卻，得淡黃色的PLGA-PEG-PLGA共聚物。實施例2多西他賽納米膠束的制備
采用直接溶解法制備載藥共聚物納米膠束。以雙蒸水配制質量分數為5%的實施例1制備獲得的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物溶液1 mL，加入多西他賽無水乙醇溶液(質量濃度 100 mg/mU25ul，渦旋震蕩3 min，超聲分散10 min，10 000 r/min離心5 min，上清液即為載多西他賽共聚物納米膠束。載多西他賽共聚物納米膠束真空冷凍干燥，6°Co輻照滅菌后， 4°C環境保存備用。多西他賽與PLGA-PEG-PLGA聚合物的質量百分比為1:20。載多西他賽共聚物納米膠束以下簡稱為多西他賽納米膠束或納米膠束或載藥納米膠束。實施例3多西他賽納米膠束的表征
配制多西他賽共聚物納米膠束水溶液，充分超聲分散后，滴于覆蓋碳膜的銅網上，干燥后用離子鍍膜儀濺金，在掃描電子顯微鏡下觀察，可見納米膠束分散良好，呈類球形(見圖
1)，提高多西他賽納米膠束溶液溫度到38.5°C時，納米膠束轉變成微米級的栓塞劑(見圖
2)。配制實施例2制備獲得的多西他賽共聚物納米膠束水溶液3mL，充分超聲分散后，用激光粒徑儀測量載多西他賽納米膠束的平均粒徑為30. 8 nm,多元分散系數0. 42。。采用高效液相色譜檢測載藥納米膠束的包封率、載藥率。色譜條件C18色譜柱， 柱溫30°C，流動相甲醇/水=70/30 (體積比)，流速1. Oml /min，進樣量20μ1，UV檢測 (227nm)。精密稱取多西他賽，加入甲醇溶解成濃度lmg/ml的標準貯備液。精密吸取多西他賽標準儲備液0. 05,0. 1,0. 25、0· 5和1. Oml置于IOml量瓶中，甲醇定容得系列濃度的對照溶液。取20 μ 1標準儲備液進樣，以峰面積(Y)對照溶液濃度(X mg/L)進行直線回歸。 精密稱取實施例2制備獲得的載藥膠束IOmg于5ml離心管中，加入0. 5ml 二氯甲烷，超聲破碎促使膠束溶解，再加入2. 5ml甲醇，渦旋10min，5000rpm離心lOmin，取上清液20μ1進樣。測定峰面積，代入標準曲線計算多西他賽濃度，實施例2制備獲得的的載藥納米膠束的包封率達98. 2 wt %，載藥率達4. 68 wt %。以0. 02 mol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液制備多西他賽納米膠束溶液(含0. 02 wt% NaN3、0. 1 wt %吐溫80)，于37°C，80 r/min恒溫搖床下震蕩進行體外釋放，定時取樣，超濾離心管(截留分子量5000dal) 4000Xg離心10分鐘，濾液上樣進行高效液相色譜測定多西他賽含量，結果顯示實施例2制備獲得的多西他賽納米膠束在磷酸鹽緩沖液中釋放平穩， 無明顯突釋效應，3 h釋放19. 9 wt %，68 h累積釋放78. 83 wt % (圖3)。實施例4多西他賽納米膠束的急性毒性試驗
取昆明小鼠80只，雌雄各半，體質量為18 22 g，隨機分為10組，每組8只，分別經尾靜脈注射按實施例2方法制備獲得的載多西他賽共聚物納米膠束(多西他賽劑量分別為 80、120、180、270、405 mg/kg)和多帕菲(多帕菲劑量分別為 15、23、34、51、76 mg/kg)。給藥后常規飼養2周，觀察小鼠的活動、攝食、毛發等情況，記錄小鼠死亡數量。改良寇氏法測得多帕菲靜脈注射的小鼠半數致死量為47. 3 mg/kg，而載多西他賽共聚物納米膠束的毒性明顯降低，其半數致死量升高達273. 5 mg/kg。由此可見，制備成緩釋的多西他賽納米膠束對小鼠的毒性明顯降低，靜脈注射的小鼠半數致死量為273. 5 mg/kg，明顯高于多西他賽的 47.3 mg/kg。實施例5超聲熱效應觀察
測定不同超聲聲強、不同輻照時間大鼠腿部肌肉溫度。大鼠乙醚麻醉后將后腿部皮膚剪開暴露腿部肌肉，用電子體溫計測量肌肉的基礎溫度，超聲治療儀輸出聲強lW/cm2和2 W/cm2，分別輻照1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘后測量腿部肌肉溫度。大鼠腿部肌肉溫度隨超聲聲強的增加和輻照時間的延長而上升(表1)。超聲輸出聲強為lW/cm2，大鼠腿部肌肉溫度3分鐘緩慢上升至38. 2°C。超聲輸出聲強為2W/cm2大鼠腿部肌肉溫度上升迅
速，輻照1分鐘溫度即達到38. 6°C。 表1超聲輻照大鼠腿部肌肉溫度變化
權利要求
1.一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，包括高分子聚合物和多西他賽，所述高分子聚合物采用聚乙二醇(PEG)/聚(D，L-乳酸一 CO-乙醇酸)(PLGA)共聚物體系，共聚物體系采用聚乙二醇一聚乳酸羥基乙酸一聚乙二醇(PEG-PLGA-PEG)、聚乙二醇一聚乳酸一聚乙二醇(PEG-PLLA-PEG)、聚乳酸羥基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羥基乙酸 (PLGA-PEG-PLGA)或聚乙二醇/聚乳酸羥基乙酸(PEG/PLGA)接枝聚合物，其特征在于多西他賽與共聚物體系的質量百分比為1:20至1:5，采用直接溶解法、乳化溶劑揮發法或透析法制備成載多西他賽共聚物納米膠束。
2.根據權利要求1所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，其特征在于所制備的載多西他賽共聚物納米膠束的包封率達96-99wt %，載藥率達3-7 wt %。
3.根據權利要求1或2所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，其特征在于所述的PLGA-PEG-PLGA聚合物采用開環共聚的方法合成，合成的 PLGA-PEG-PLGA聚合物的組成為聚乳酸羥基乙酸質量百分比50_75%，聚乙二醇分子量介于1000-2000dal，質量百分比為25_50%，合成聚乳酸羥基乙酸鏈段的丙交酯摩爾百分比為 60-80%,乙交酯的摩爾百分比為20-40% ；多西他賽與PLGA-PEG-PLGA聚合物的質量百分比為 1:20 至 1:5。
4.權利要求1-3任一所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑的制備方法，包括如下步驟1)采用開環聚合法合成PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物分別稱取相對分子質量為1500和2000的PEG，在95°C真空環境中干燥，然后加入丙交酯和乙交酯， 繼續真空干燥后，加入催化劑氯化亞錫，充入氮氣，在140°C條件下反應，抽真空，自然冷卻， 得淡黃色的PLGA-PEG-PLGA共聚物；2)采用直接溶解法制備載藥共聚物納米膠束以雙蒸水配制質量分數為5%的步驟1)制備獲得的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物溶液，加入濃度為100 mg/mL的多西他賽無水乙醇溶液，渦旋震蕩，超聲分散，離心獲得上清液，上清液即為載多西他賽共聚物納米膠束；3)載多西他賽共聚物納米膠束真空冷凍干燥，6tlCo輻照滅菌后，4°C環境保存。
5.權利要求1-3任一所述的腫瘤血管栓塞化療新制劑在制備抑制腫瘤的藥物中的應用。
6.權利要求1-3任一所述的一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑在制備超聲介導下化療乳腺癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種超聲生物效應介導下的腫瘤血管栓塞化療新制劑，包括高分子聚合物和多西他賽，所述高分子聚合物采用聚乙二醇/聚(D,L-乳酸－CO-乙醇酸共聚物體系，共聚物體系采用聚乙二醇－聚乳酸羥基乙酸－聚乙二醇、聚乙二醇－聚乳酸－聚乙二醇、聚乳酸羥基乙酸－聚乙二醇－聚乳酸羥基乙酸或聚乙二醇/聚乳酸羥基乙酸(PEG/PLGA)接枝聚合物，其特征在于多西他賽與共聚物體系的質量百分比為1:20至1:5，采用直接溶解法、乳化溶劑揮發法或透析法制備成載多西他賽共聚物納米膠束。本發明可適用于包括乳腺、甲狀腺、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、腹膜后等多種腫瘤的治療。
文檔編號A61K31/337GK102335119SQ20111032719
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月23日 優先權日2011年10月23日
發明者何以敉, 林禮務, 薛恩生, 陳志奎, 黃靜 申請人:福建醫科大學附屬協和醫院