專利名稱：惡性b細胞淋巴瘤抗體藥物的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及已知惡性B細胞淋巴瘤抗體的新用途。
背景技術：
惡性淋巴瘤(ML)是源于淋巴結和淋巴結外淋巴組織的惡性腫瘤，ML可分為何杰金氏淋巴瘤(HD)和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)兩大類。在我國，惡性淋巴瘤新發病例中，NHL患者占85 90%。在NHL中，預后較好的低度惡性淋巴瘤在我國的發病率較低，約占NHL的5% ;而預后較差的高度惡性淋巴瘤發病率較高，占NHL的30%左右。調查顯示，隨著時間的推移和社會經濟的發展，惡性淋巴瘤呈現增長的趨勢，其中HD相對穩定，而NHL的發病率和死亡率均在上升。非何杰金氏淋巴瘤的病因與發病機制尚未確定，目前認為與性別、年齡、免疫功能缺失、細菌或病毒感染、環境等多種因素有關。臨床上治療NHL的方法有化學治療、放射治療、手術治療、骨髓移植等。目前對NHL的治療以化療為主，但化療的短期副作用很明顯，而且對復發病人作用不肯定，一般化療聯合方案效果不佳；放療存在的問題是應用范圍較小，而手術對NHL僅起診斷作用，極易復發，需要結合化療；骨髓移植方法則由于配型困難、排異反應、價格昂貴等原因難以開展。隨著細胞生物學、分子生物學及生物工程技術的發展，免疫療法在最近幾年逐漸成為癌癥治療的主要方法之一。它直接或間接利用人體免疫系統內的免疫細胞及抗體來對抗癌癥或減少因癌癥或其治療所引起的副作用，而腫瘤特異性的單克隆抗體類藥物是目前免疫治療的主導方向。目前在國際上研究的用以治療NHL的單抗類藥物主要是靶向于淋巴細胞表面的抗原，已發表的研究結果中有針對⑶20、⑶22、⑶52、⑶19、⑶30及HLA-DR等幾種抗原的抗 體產品。由 National Cancer Insititute 研制的人源化 IgGl 單抗 Apolizumab (MoAbHulDlO)可作用在正常及惡性B淋巴細胞表面的HLA-DR抗原β鏈上的多個位點上產生抗體依賴性的細胞毒殺作用，在針對復發性或彌漫型CLL或ALL的I期臨床試驗中，有11 %的病人治療后達到PR，67%的病人為SD，22%的病人為H)。所有的病人都出現了 1_2度輸注反應(58%乏力、50%惡心、50%高血糖、42%發熱、42%風疹和33%頭痛)。該藥現正處在II期臨床試驗研究階段。由Peregrine Pharmaceuticals 公司研制的鼠源型單抗 Lym-1 (Oncolym)是一種能夠特異性識別HLA-DRlO抗原的鼠源性IgG2a單抗，該抗原在80%惡性淋巴瘤B細胞表面都有表達。它與淋巴瘤細胞的結合能力明顯高于與正常B淋巴細胞的結合能力。在對1251-Lym-l的放射性顯像研究中證實，Lym-1對已知的淋巴瘤組織部位有高度的選擇性結合，而在正常的組織上結合較少。在對Lym-1進行的在I期臨床試驗中，10例病人中有3例出現緩解。IgM HAMA反應均呈陰性。主要的毒性反應表現為有8例病人出現了在注射近終點時或注射完成后的發熱，其中4例最高體溫保持在38°C以下，另4例最高體溫保持在38 40°C之間，該發熱很容易用藥控制，而且通常只持續2 4小時；有4例病人在注射后出現了風疹；在研究過程中，沒有發現心臟、肝腎或肺部毒性反應；而且在血液學指數方面也沒有明顯的改變；大多數病人的外周血淋巴細胞沒有降低，免疫球蛋白的水平也未發現有明顯改變。放射免疫治療(Radioimmunotherapy，RIT)則是一種免疫療法和放射療法相結合的治療手段，它是以能與腫瘤抗原結合的物質作為靶向載體，偶聯放射性核素作為“彈頭”(治療劑)的腫瘤治療藥物注入體內與腫瘤細胞相關抗原特異結合所致的腫瘤局部比其他正常組織劑量高，達到對腫瘤殺傷而對正常組織損傷小的一種治療方法，而放免療法中最常用的靶向載體是腫瘤細胞相關抗原的單克隆抗體。目前在美國獲準上市銷售的治療腫瘤的單抗類放射免疫藥物主要有=Zevalin和Bexxar,輸液反應及骨髓毒性是其主要毒副反應。3度或4度白細胞減少和血小板減少較為常見，并常發生于治療后5-7周，并在2-4周后恢復。約5-7%接受Zevalin和Bexxar治療的患者因感染需要住院治療。少部分接受Zevalin和Bexxar治療的患者可出現骨髓增生異常綜合癥和急性白血病，但這些病人往往先前接受過烷化劑治療。研究還發現，若患者的骨髓受淋巴瘤侵犯越嚴重，則更多的放射性同位素聚集骨髓，從而對正常骨髓的損傷更大。因此，在使用Zevalin或Bexxar治療前,必須仔細評價患者骨髓情況。淋巴瘤骨髓侵犯超過25%或發現骨髓功能不良者不宜接受Zevalin或Bexxar治療。由美國Peregrine Pharmaceuticals 公司研制的鼠源型單抗 Lym-1 (Oncolym)既可以引導放射性核素靶向到腫瘤局部殺死腫瘤細胞，還具有ADCC、CDC及誘導Raji細胞凋亡的作用殺傷腫瘤細胞。Lym-1經放射性核素131I標記后形成的1311-Lym-1與大多數惡性B細胞表面的HLA-DRlO抗原結合后可以引導放射性核素1311靶向到腫瘤局部殺死腫瘤細胞。中國專利ZL200410053872. O公開了將Lym-1的可變區基因和人IgGl的Yl和K恒定區基因融合，得到的一個低免疫原性的人鼠嵌合單抗(chLym-1)其中人源性序列為65%,鼠源性序列占35%。研究表明chLym-1有著和Lym-1相似的親和力，而且在攝取后的24-72小時內chLym-1在腫瘤上的滯留量與Lym-1近乎相同。此外,chLym-1同樣具有誘導ADCC、CDC效應及誘導淋巴瘤細胞凋亡效應來直接殺死腫瘤細胞的能力。它誘導ADCC效應的水平是鼠源型Lym-1的兩倍，而且即便在較低的抗體濃度的條件下也可誘導最大的ADCC效應。因此新一代的人鼠嵌合型單克隆抗體chLym-1相對于鼠源型Lym-1具有表達率高、性能穩定、腫瘤攝取率高、正常組織攝取率低、可增加效應器功能、不易起HAMA反應而降低免疫源性及自身殺傷腫瘤細胞能力優秀等優點，優化了放免治療效果。但該藥物目前的研究僅限于腫瘤治療上的應用，對于其它疾病的應用還有待開發及拓展。中國專利申請200810034400. 9進一步揭示了 chlym_l在治療惡性淋巴瘤及自身免疫性疾病中的應用。白血病是造血組織的惡性疾病，又稱“血癌”。其特點是骨髓及其它造血組織中有大量無核細胞無限制地增生，并進入外周血液，將正常血細胞的內核明顯吸附，該病居年輕人惡性疾病中的首位，原生性病毒可能是神經性負感組織增生，還有許多因素如食物的礦物放射性化、毒化(苯等)或藥物變異、遺傳素 質等可能是致病的輔因子。根據白血病細胞不成熟的程度和白血病的自然病程，分為急性和慢性兩大類。我國急性白血病比慢性白血病多見(約5. 5 I)，其中急粒細胞白血病最多(1. 62/10萬)，其次為急淋白血病(O. 39/10萬)、慢粒白血病(O. 36/10萬)，慢淋白血病少見。目前對于白血病主要治療有下列幾類化學治療、放射治療、標靶治療、中藥治療。部分高危險性病人，需要進行骨髓移植。近10年來，隨著分子生物學、生物遺傳學的進展，使白血病預后得到極大的改觀。本發明根據研制單抗的作用機理，進一步研究了 chlym-1在治療白血病上的應用。
發明內容
本發明對現有的抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體chLym_l的應用進一步拓展，提供了其在治療白血病上的用途。本發明一方面公開了一種抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體用于制備治療白血病藥物的用途,所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體包括重鏈及輕鏈，其中，重鏈含恒定區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈含恒定區，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO :2，重鏈及輕鏈通過二硫鍵相連。所述白血病可選自急性淋巴細胞白血病，早幼粒細胞白血病，急性粒細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病。·在一優選例中，所述抗體重鏈恒定區為Y類型；而抗體輕鏈恒定區為K類型。
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在另一優選例中，所述抗體是由NSO細胞株產生。較佳的，所述抗體的重鏈的恒定區為人抗體重鏈的恒定區，所述抗體的輕鏈的恒定區為人抗體輕鏈的恒定區。進一步的，所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體經放射性同位素標記。較佳的，上述放射性同位素選自1311、188Re、90Y或67Cu，優選1311。本發明的抗體可作為主要活性成分與常用藥用輔料配伍制成藥物組合物用以治療白血病。活性成分的給藥量是治療有效量。例如每天約I微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的抗體還可與其他治療劑一起使用。本發明進一步拓展了抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體在治療白血病上的新用途，為白血病患者帶來了福音。
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。實施例1抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的制備采用中國專利(專利號200410053872. O)中記載的保藏號為CCTCC NO. 200405的小鼠骨髓瘤細胞株NSO-clym，將該細胞株接種于含10%血清、不含L-谷氨酰胺的SFM培養基中置于37°C，5% CO2培養箱中培養，收集培養上清，將過濾后的無細胞上清上樣到MabSelect填充的FineLINE柱，上樣的濃度是30mg/ml。洗脫后，洗脫液立即用磷酸鉀中和PH值到6. 8-7.0。再用凝膠過濾檢測，結果表明純度在95%以上。將產品測序，結果為，抗體的重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID N0:2，符合預期。采用中國專利200410053872. O實施例4記載的方式檢測該抗體的親和常數Ka =3. βθΧΙΟ^οΓ1實施例2 131I標記的抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的制備
采用氯胺-T碘化標記法，將mI標記到實施例1獲得的抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體上，制得產物的放射性比活度為llmCi/mg。采用實施例1的方式檢測該單抗的親和常數Ka = 3. ^ΧΚΛ οΓ1。實施例3抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體治療白血病的藥效學研究試驗方法(一 )細胞準備本實驗檢測的細胞均為懸浮細胞，實驗檢測48小時前1: 3傳代細胞，細胞培養于含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640 (GIBCO)培養基中。IOOOrpm離心收集細胞，PBS洗漆2次。試驗細胞系淋巴瘤細胞系Raj1、白血病細胞系HL-60。(二)封閉封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，封閉劑為1% BSA, PBS pH 7. 5。封閉30分鐘。(三)抗體孵育一抗孵育一抗為實施例1制備的人源化抗體ChLym-1抗體，孵育濃度為lug/ml，孵育時間60分鐘。PBST洗滌3次。二抗孵育二抗為Jackson公司的羊抗人FC片段抗體，使用濃度lug/ml，孵育時間30分鐘。PBST洗滌3次。`免疫熒光法中的二抗是熒光抗體，因此抗體孵育的時候必須避光。此外，為保證結合質量和防止干燥，抗體孵育在濕盒中進行。(四)流式檢測流式檢測各細胞表面ChLym-1抗原的表達情況。本實驗使用的流式細胞儀為Beckman FC500,檢測中使用只加二抗而未加入一抗的細胞作為對照細胞，以此計算各組細胞中陽性細胞的比例。試驗結果淋巴瘤細胞系Raji陽性率70%—80% M0LT-4 陽性率40%-50%白血病細胞系HL-60陽性率27%—35%。從結果上看，淋巴瘤細胞系表達較高，白血病細胞系有少數也表達lym-1，此試驗說明ChLym-1抗體有望作用與白血病細胞起到一定的治療作用。
權利要求
1.一種抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體用于制備治療白血病藥物的用途，所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體包括重鏈及輕鏈，其中，重鏈含恒定區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈含恒定區，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID N0:2，重鏈及輕鏈通過二硫鍵相連。
2.如權利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述白血病選自急性淋巴細胞白血病，早幼粒細胞白血病，急性粒細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病。
3.如權利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗體重鏈恒定區為Y類型；而抗體輕鏈恒定區為K類型。
4.如權利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗體的重鏈的恒定區為人抗體重鏈的恒定區，所述抗體的輕鏈的恒定區為人抗體輕鏈的恒定區。
5.如權利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗體是由NSO細胞株產生。
6.如權利要求1所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體經放射性同位素標記。
7.如權利要求6所述抗HLA-DRlO的淋巴瘤特異性人源化抗體的用途，其特征在于，所述放射性同位素選自1311、 188Re、9°Y或67Cu。
全文摘要
本發明涉及惡性B細胞淋巴瘤抗體的新用途，公開了一種抗HLA-DR10的淋巴瘤特異性人源化抗體用于制備治療白血病藥物的用途，所述抗HLA-DR10的淋巴瘤特異性人源化抗體包括重鏈及輕鏈，其中，重鏈含恒定區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQIDNO:1，輕鏈含恒定區，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQIDNO:2，重鏈及輕鏈通過二硫鍵相連。本發明進一步拓展了抗HLA-DR10的淋巴瘤特異性人源化抗體在治療白血病上的新用途，為白血病患者帶來了福音。
文檔編號A61K39/395GK103041387SQ201110306828
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者倪健, 潘健, 許國貞 申請人:蘇州工業園區晨健抗體組藥物開發有限公司