專利名稱：一種豬用c型口蹄疫基因工程疫苗佐劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物疫苗用的佐劑及制備方法，確切講是一種豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑及制備方法，更確切講本發(fā)明是一種用于由C型口蹄疫的VPl和VP3蛋白混合物構(gòu)成的C型口蹄疫亞單位疫苗的佐劑，以及其制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一種能夠感染包括牛、羊、豬等主要家畜在內(nèi)的多種偶蹄動(dòng)物的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，其病原體為口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)。FMDV 屬于微 RNA 科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，共包括 7 個(gè)血清型(A、C、0、Asia I、SAT I、SAT II 及 SAT III)，各血清型之間無交叉保護(hù)力?；騺唵挝还こ桃呙缬捎诎踩院靡子诒４?，效果理想等優(yōu)點(diǎn)具有廣闊的前景。 然而基因亞單位工程疫苗免疫原性相對較弱，為了更好地激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其對口蹄疫病毒具有足夠的抵抗力，多采用在疫苗中加入佐劑，例如油佐劑。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于C型口蹄疫基因工程亞單位疫苗的佐劑。本發(fā)明的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑是重組豬α-干擾素。更確切講，本發(fā)明的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑是剔除掉了干擾素的前端8個(gè)信號肽的重組豬 α-干擾素，其核苷酸序列為SEQ ID Νο3。本發(fā)明所述的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑制備方法是用經(jīng)口蹄疫病毒攻毒后屠宰的豬新鮮脾臟提取脾臟總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄方法獲得豬α -IFN基因，將所得到的豬α -IFN基因連接于原核表達(dá)載體上構(gòu)成質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)復(fù)性純化處理后得到所要的佐劑。作為最佳實(shí)施方式，本發(fā)明的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑制備方法是用經(jīng)口蹄疫病毒攻毒后屠宰的豬新鮮脾臟提取脾臟總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄方法獲得豬α -IFN基因，將所得到的豬α -IFN基因連接于原核表達(dá)載體上構(gòu)成質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)復(fù)性純化處理后得到所要的佐劑。這里所用的復(fù)性處理中可采用不同濃度的尿素溶液，或者鹽酸胍或者甲酸溶液(如70%的的甲酸溶液)。在前述制備方法中所用的一對豬α-干擾素基因用RT-PCR引物為IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；。所用的原核表達(dá)載體為pET_30a ；所用的原核表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑制備方法中優(yōu)選的于產(chǎn)物復(fù)性處理方法為采用含DDT和EDTA的鹽酸胍溶液，其中鹽酸胍的終濃度為1.5M，DDT的終濃度為 ImM, EDTA的終濃度為10mM。
α-IFN是一種廣譜抗病毒劑，雖然它不直接殺傷或抑制病毒，但卻可以通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞 (NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。 干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。近年研究表明干擾素有利于CD8+記憶T細(xì)胞的生長作用， 在病毒性疾病，如乙肝、丙肝、水泡性口炎病毒等得治療中被廣泛應(yīng)用。IFN-α家族由至少13個(gè)功能性亞型組成，它們擁有同樣的受體系統(tǒng)和相似的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)它在先天性免疫和適應(yīng)性免疫方面具有許多重要的功能。作為口蹄疫疫苗佐劑的研究最早見于 Moraes (2003)的報(bào)道，國內(nèi)研究見于2008年，是以干擾素全序列(含有全部信號肽)與口蹄疫病毒VPl結(jié)構(gòu)蛋白序列以及腺病毒載體共表達(dá)的活載體疫苗(Veterinary Immunology and Immunopathology, 124, 2008 :274-283)，但安全性目前依然存在風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的佐劑是用于是將口蹄疫亞單位疫苗中，由于口蹄疫亞單位疫苗不存在自我復(fù)制能力，不會整合到試驗(yàn)動(dòng)物基因組上，安全性很高。本發(fā)明優(yōu)選采用C型FMDV的VPl 和VP3蛋白作為亞單位疫苗的研制對象是基于以下原因首先，C型FMDV的VPl其最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其上含有一個(gè)高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) (RGD)基序的G-H環(huán)(G-H Loop)，是細(xì)胞的吸附位點(diǎn)的主要成分，又是重要的中和位點(diǎn)，一般位于VPl 的140-160位氨基酸殘基。另外在VPl的C端還存在一個(gè)主要的連續(xù)性抗原位點(diǎn)，接種動(dòng)物可以產(chǎn)生中和抗體。其次，C型FMDV的VP3上包括了 B-B knob在內(nèi)的多個(gè)抗原位點(diǎn)，并且與其他小RNA病毒一樣，VP3是結(jié)構(gòu)蛋白中結(jié)構(gòu)最為保守的。因此，VP3也可以作為基因工程疫苗制備的基點(diǎn)。需要指出的是，IFN-α制劑已在40多個(gè)國家得到廣泛使用，用于治療14種以上類型的癌癥，包括一些血源性惡性腫瘤，如毛細(xì)胞白血病，慢性骨髓白血病，一些B細(xì)胞和T 細(xì)胞淋巴瘤及某些實(shí)性腫瘤，如黑色素瘤、腎癌，安全性良好。本發(fā)明是首次將α干擾素的原核表達(dá)產(chǎn)物作為亞單位疫苗佐劑，特別是用作口蹄疫VPl和VP3表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)成的聯(lián)合疫苗的佐劑。在本發(fā)明中由于采用了剔除掉了干擾素的前端8個(gè)信號肽的重組豬α-干擾素為佐劑，這種利用剔除干擾素的前端部分信號肽可來提高蛋白的表達(dá)量，更有利于佐劑的制備。本發(fā)明中在對原核表達(dá)產(chǎn)物時(shí)進(jìn)行復(fù)性時(shí)采用了含DDT和EDTA的鹽酸胍溶液。 還原劑DTT可以盡可能的打開半胱氨酸融合蛋白中所有二硫鍵，EDTA可螯合Cu2+Je3+等金屬離子與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)，從而使得融合蛋白的復(fù)性率達(dá)到最高。同時(shí)DDT 和EDTA可以最大程度的減少融合蛋白質(zhì)溶液中各種離子型、非離子型表面活性劑等得干擾的作用；復(fù)性操作簡單，不需要特殊儀器，所用試劑穩(wěn)定，通?？煞€(wěn)定存放6-12個(gè)月。由本實(shí)驗(yàn)制備的沒有干擾素為佐劑的C型口蹄疫基因工程亞單位疫苗對IOOLD5tlC型FMDV毒株AV104強(qiáng)毒攻擊不能提供保護(hù)，而以干擾素為佐劑的C型口蹄疫基因工程亞單位疫苗可以對50LD5(iC型FMDV毒株AV104強(qiáng)毒攻擊達(dá)到100%保護(hù)，對IOOLD50C型FMDV毒株AV104 強(qiáng)毒攻擊也能提供83. 3%保護(hù)率，同時(shí)，以豬α -干擾素為佐劑的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗免疫豬抗體水平是不以豬α -干擾素普通豬用C型口蹄疫基因工程疫苗的2. 2倍。
圖1. PCR擴(kuò)增a-干擾素基因，其中M lDL2000Marker，泳道1RT-PCR擴(kuò)增豬α -干
擾素產(chǎn)物。圖2. PCR和雙酶切鑒定干擾素重組載體，其中M DLlOOOOMarker,泳道IPCR從克隆載體上擴(kuò)增的豬α-干擾素產(chǎn)物，泳道2PCR從表達(dá)載體上擴(kuò)增的豬α-干擾素產(chǎn)物，泳道3EcoR V, EcoR I雙酶切鑒定重組表達(dá)載體。圖3.豬α-IFN表達(dá)量比較，其中泳道1本發(fā)明所涉及的豬α-IFN基因的融合蛋白，泳道2本發(fā)明用于表達(dá)量對照的的豬α -IFN全基因的融合蛋白。圖4.豬α -干擾素融合蛋白包涵體復(fù)性和純化SDS-PAGE分析，其中泳道1豬 α -IFN融合蛋白的純化產(chǎn)物，泳道2豬α -IFN融合蛋白的全菌產(chǎn)物。圖5.復(fù)性后豬干擾素融合蛋白Western-blotting分析，其中M 蛋白Marker， 泳道1豬α -IFN融合蛋白與酶標(biāo)二抗IgG的反應(yīng)。圖6. ELISA檢測疫苗免疫豬后的抗體水平
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例分成兩個(gè)部分完成，即實(shí)施例一豬α -干擾素的原核表達(dá)和復(fù)性； 實(shí)施例二 重組豬α-干擾素作為疫苗佐劑的在C型口蹄疫亞單位基因工程疫苗的效力試驗(yàn)(包括豚鼠的免疫和攻毒實(shí)驗(yàn)測定)實(shí)施例一豬α -干擾素的原核表達(dá)和復(fù)性取得以口蹄疫病毒攻毒后7天屠宰的豬新鮮脾臟樣品，以大連寶生物的試劑盒提取脾臟總RNA，通過RT-PCR方法從脾臟總RNA中獲得181個(gè)氨基酸的豬α -IFN基因，其氨基酸序列見SEQ. NO. 3，其編碼的核苷酸序列見SEQ. NO. 4。將上述基因克隆載體pMD18_T， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取陽性質(zhì)粒測序并與Genbank的豬α -干擾素比較，獲得正確的基因；設(shè)計(jì)豬α -干擾素特異性表達(dá)引物，其序列為SEQ. NO. 2，加入EcoR V和EcoR I酶切位點(diǎn)，插入pET-30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得的陽性質(zhì)粒命名為pET_SIFN，與LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行純化、復(fù)性并用SDS-PAGE和Western-blotting分析豬干擾素融合蛋白特性。具體步驟如下1豬α -干擾素的RT-PCR擴(kuò)增基因組模板 3ul，IX st印 Enzyme mix 0. 8 μ 1，2Xbuffer 10 μ 1,正反引物各 50pmol、補(bǔ)無菌的超純水至總體積為50 μ 1，混合均勻。擴(kuò)增條件50°C 30min,94°C IOmin, 然后于以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C lmin,56°C lmin,72°C 40s，最后72°C延伸&iiin。本發(fā)明用于擴(kuò)增豬α -干擾素特異性引物，其序列分別為SEQ. NO. 1和SEQ. N0. 2， 即IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；2PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒連接的具體步驟為(1)目標(biāo) DNA 片段(20ng)、pMD18_T 載體(50ng)、T4DNALigase 5UU0XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，補(bǔ)無菌的超純水至總體積10 μ 1。
(2) 16°C連接10 12小時(shí)制備成連接好載體的基因，命名為pMD_SIFN。(3)對步驟⑵連接好的樣品進(jìn)行PCR檢測；連接產(chǎn)物lul，dNTP(10mM)5y 1, IOXpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、補(bǔ)無菌的超純水至總體積為50 μ 1，混合均勻；擴(kuò)增條件94°C IOmin,然后于以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán) 940C lmin，56°C lmin，72°C 40s，最后 72°C延伸 8min。其中所用的正反向引物見SEQ. NO. 3和SEQ. NO. 4，為IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；(4) 1 % TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分析儀下觀察DNA條帶。3豬α -干擾素基因序列的原核表達(dá)重組載體構(gòu)建方法(1)從pMD-SIFN擴(kuò)增的目標(biāo)DNA 片段 QOng)、pET_30a載體(50ng)、T4DNA Ligase 5UU0XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，補(bǔ)無菌的超純水至總體積10 μ 1。(2) 16°C連接10 12小時(shí)制備成連接好載體的基因。(3)對步驟⑵連接好的樣品進(jìn)行PCR檢測；連接產(chǎn)物lul，dNTP(10mM)5y 1, IOXpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、補(bǔ)無菌的超純水至總體積為50 μ 1，混合均勻；擴(kuò)增條件94°C IOmin,然后于以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán) 940C lmin，56°C lmin，72°C 40s，最后 72°C延伸 8min。其中本實(shí)驗(yàn)從pMD-SIFN擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段以及PCR測序所用的正反向引物見 SEQ. N0. 5 和 SEQ. N0. 6 為:IFN-ES :5-GCGATATCGCCCCAACCTCAGCCTTCCT-3 (下劃線標(biāo)記為 EcoRV 酶切位點(diǎn))IFN-EAs :5-GCGAATTCCTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGC_3 (下劃線標(biāo)記為 EcoR I 酶切位點(diǎn))(4)連接好的 pET-SIFN重組基因 IOul，10XH buffer 2ul，EcoR I (8-20U/μ 1)和 Xho I (8-20U/ μ 1)各 1. 5ul，ddH20 定容至 20ul。(5) 1 % TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分析儀下觀察DNA條帶。4豬α -干擾素基因序列的原核表達(dá)、復(fù)性及檢測將鑒定為陽性的重組載體菌液20 μ L接種至6mL LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振搖過夜。取過夜培養(yǎng)物20 μ L接種于6mL LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至0D600為0. 6-1. 0時(shí)， 加入IPTG至終濃度為0. 5mM，37°C誘導(dǎo)8h，SDS-PAGE觀察各重組菌表達(dá)情況。具體方法是將所取菌液樣12，OOOrpm離心3min，棄上清。用去離子水重懸菌體至無大的細(xì)菌塊殘留，12. OOOrpm離心3min，棄去上清，去離子水重懸菌體。反復(fù)凍融3次， 12，OOOrpm離心3min，吸取上清，菌體用去離子水重懸。取上清和重懸菌體各20 μ L加入 5yL 5 X Loading Buffer，混勻后煮沸7min。蛋白質(zhì)Marker同樣煮沸7min。按預(yù)定順序用微量加樣器吸取待分析樣品5 μ L，緩慢加入加樣孔。每加完一個(gè)樣品，應(yīng)在電極緩沖液中徹底清洗微量加樣器。加蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker作參照。200伏電壓電泳40min左右， 電泳結(jié)束后，染色和脫色，待拍照，記錄結(jié)果。豬α-干擾素重組基因的表達(dá)產(chǎn)物的純化，具體如下(1)蛋白的制備將pET-30VPl 及 pET_30INF BL21 (DE3)菌過夜培養(yǎng)物 500 μ L 分別加入 200mL 培養(yǎng)基中，37°C，0.5mM IPTG誘導(dǎo)他。誘導(dǎo)結(jié)束后將菌液3800rpm，4°C離心15分鐘，棄去上清。 去離子水重懸，相同條件離心，棄去上清。用50mL TE緩沖液重懸菌體，200w超聲3s停3s， 超聲至菌液不再粘稠為止。12，OOOrpm 4°C離心lOmin，棄去上清。(2)包涵體洗滌與變性依次使用包涵體洗滌液BufferA、B、C、D對所制備的包涵體洗滌，其中使用Buffer B洗滌5遍，其余1遍。最后使用8M尿素溶液溶解洗滌后包涵體，4°C過夜。12，000rpm，4°C 離心lOmin。收集上清，取少許上清，使用SDS-PAGE觀察洗滌效果。(3)包涵體復(fù)性對包涵體復(fù)性處理可分別采取不同濃度的尿素、鹽酸胍、鹽酸胍(含DDT和EDTA) 和70%的甲酸的方法進(jìn)行復(fù)性。將復(fù)性成功的包涵體使用SDS-PAGE觀察結(jié)果。(4)Western-blotting上述的豬α -干擾素重組基因的Wfestern blotting分析(1)電泳取所純化的各種蛋白制樣進(jìn)行SDS-PAGE。(2)轉(zhuǎn)印將電泳完的凝膠切除濃縮膠后，去離子水清洗表面，然后在膜轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30min。剪1塊與凝膠相同大小的PVDF膜，在100%甲醇中浸泡^iin左右后與凝膠在緩沖液中平衡至30min結(jié)束。再剪取8塊與所取PVDF大小相同濾紙，并在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡lOmin。然后在正極板上按四層濾紙、PVDF膜、凝膠、四層濾紙的順序疊放整齊，用玻璃棒輕輕擠壓，趕走各層間氣泡，確保各層完全接觸后蓋上負(fù)極板，120mA轉(zhuǎn)移150min。(3)封閉轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取下PVDF膜，按照預(yù)先標(biāo)記剪下蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker 所在區(qū)PVDF膜，置于氨基黑染色液中浸染2-aiiin，取出后用漂洗液(150mM NaCl, 50mM Tris-HCL,pH 7.5)脫色，直至背景蘭色脫盡。其余PVDF膜用PBS沖洗，加入10_20mL封閉液，室溫輕輕振搖池，或4°C過夜(配制封閉液時(shí)要保證脫脂奶粉充分溶解，以免未溶解的奶粉顆粒附著與膜上，影響實(shí)驗(yàn)效果)。(4)與一抗的結(jié)合封閉結(jié)束后，用PBST清洗PVDF膜3次，每次在搖床上振搖 IOmin,加入用PBST適當(dāng)稀釋的各檢測抗體10mL，室溫振搖1. 5h,用PBST沖洗3次，每次在搖床緩慢搖振IOmin。(5)與二抗的反應(yīng)加入適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的與一抗相對應(yīng)的二抗，室溫下輕搖孵育lh，取出用PBST沖洗3次，每次在搖床緩慢搖振lOmin。(6)顯色將PVDF膜轉(zhuǎn)移到10_20mL底物溶液中，室溫避光輕搖^iin觀察顯色情況，待出現(xiàn)條帶時(shí)，立即轉(zhuǎn)入PBS緩沖液中終止反應(yīng)，室溫保存待圖像采集。5前述產(chǎn)物測序及實(shí)驗(yàn)結(jié)果5. 1經(jīng)測序，由前述所得豬α -干擾素重組基因序列見基因序列表的SEQ. Ν0. 7，其氨基酸序列見基因序列表的SEQ. N0. 8。5. 2上述實(shí)施例一實(shí)驗(yàn)結(jié)果1應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增到了豬α -干擾素基因，預(yù)期大小相同的目的DNA片段，在電泳圖中可以看到一條^Obp左右的兩條特異性條帶(附圖1)。將從瓊脂糖凝膠中純化的豬α干擾素基因DNA片段與表達(dá)載體pET_30a重組載體，經(jīng)PCR、酶切鑒定大小與預(yù)期結(jié)果相符。(附圖2)。經(jīng)測序，本發(fā)明獲得了剔除前段8個(gè)氨基酸的豬α-IFN基因序列，見序列表 SEQ. Ν0. 7 和 SEQ. N0. 8。
5. 3上述實(shí)施例一實(shí)驗(yàn)結(jié)果2將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)基因工程菌在不同濃度IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，取各濃度誘導(dǎo)下的菌液裂解產(chǎn)物做SDS-PAGE分析，結(jié)果表明在^kDa出現(xiàn)特異性條帶。在IPTG濃度為0. 5mmol/ml下表達(dá)量最大，表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白且以包涵體形式存在， 并且剔除掉前段8個(gè)氨基酸的豬α -IFN基因的表達(dá)量高于沒有剔除信號肽前段8個(gè)氨基酸的的豬α-IFN基因約為20%，慘見附圖3。使用Model 422EleCtr0-Eluter切膠回收器回收蛋白與目的蛋白大小一致，而且由本發(fā)明的優(yōu)選復(fù)性方法(即采用含DDT和EDTA和鹽酸胍復(fù)性)所得產(chǎn)物純度高，紫外分光光度法檢測表明，其純度可以達(dá)到85%，參見附圖4。上述實(shí)施例一融合蛋白包涵體的復(fù)性分別用尿素、鹽酸胍、鹽酸胍(含DDT和 EDTA(其中DDT的終濃度為ImM，EDTA的終濃度為IOmM)和70%的甲酸的方法進(jìn)行復(fù)性結(jié)果見表1，其中鹽酸胍(含DDT和EDTA)復(fù)性率可以達(dá)到85%以上，對比結(jié)果見下表1。表1不同復(fù)性物質(zhì)復(fù)性率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種豬用C型口蹄疫亞單位疫苗佐劑，其特征在于這種佐劑是重組豬α-干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬用C型口蹄疫亞單位疫苗佐劑，其特征在于所用的重組豬 α-干擾素剔除掉了干擾素的前端8個(gè)信號肽，其核苷酸序列為SEQ ID Νο3。
3.權(quán)利要求1或2所述的豬用C型口蹄疫亞單位疫苗佐劑用于由C型口蹄疫的VPl和 VP3蛋白混合物構(gòu)成的C型口蹄疫亞單位疫苗。
4.權(quán)利要求1所述的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑制備方法，其特征在于用經(jīng)口蹄疫病毒攻毒后屠宰的豬新鮮脾臟提取脾臟總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄方法獲得豬α -IFN基因，將所得到的豬α -IFN基因連接于原核表達(dá)載體上構(gòu)成質(zhì)粒，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)復(fù)性純化處理后得到所要的佐劑。
5.權(quán)利要求2所述的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑制備方法，其特征在于用經(jīng)口蹄疫病毒攻毒后屠宰的豬新鮮脾臟提取脾臟總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄方法獲得豬α-IFN 基因，將所得到的豬α-IFN基因連接于原核表達(dá)載體上構(gòu)成質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)復(fù)性純化處理后得到所要的佐劑，所用的一對豬α -干擾素基因用 RT-PCR引物為IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；。所用的原核表達(dá)載體為pET-30a ；所用的原核表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌BL21 (DE3)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑制備方法，其特征在于產(chǎn)物復(fù)性處理時(shí)采用了含DDT和EDTA的鹽酸胍，其中鹽酸胍的終濃度為1. 5M，DDT的終濃度為ImM，EDTA的終濃度為10mM。
全文摘要
本發(fā)明公開一種豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑及制備方法，特別是一種用于由C型口蹄疫的VP1和VP3蛋白混合物構(gòu)成的C型口蹄疫亞單位疫苗的佐劑，以及其制備方法。本發(fā)明的豬用C型口蹄疫基因工程疫苗佐劑是重組豬α-干擾素，特別是剔除掉了干擾素的前端8個(gè)信號肽的重組豬α-干擾素，其核苷酸序列為SEQ ID No3。
文檔編號A61P31/14GK102363043SQ201110303309
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者丁耀忠, 劉永生, 周建華, 張 杰, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所