一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的制備方法

專利名稱：一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的制備方法
技術領域：
本發明屬于制藥領域，涉及一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的其制備方法。
背景技術：
本發明所涉及的難溶性藥物以紫杉烷類藥物為例。紫杉烷類藥物(如紫杉醇、多烯紫杉醇等)是目前臨床上所使用的最有效的抗腫瘤藥物之一。紫杉醇為七十年代發現的從紅豆杉或其種屬的樹皮或針葉中分離得到的天然產物多烯紫杉醇為半合成產物，之后發現這是一類具有特殊抗腫瘤作用機制的抗腫瘤劑。紫杉烷類藥物的抗腫瘤作用機制是促進微管聚合，降低微管的解聚速度，從而使微管處于穩定的非功能性狀態，從而達到阻止腫瘤細胞有絲分裂和增殖的目的。且臨床前研究表明多烯紫杉醇與紫杉醇相比，對微管的親和力更強、血漿半衰期更長及細胞內滯留時間更長。盡管紫杉烷類藥物具有良好的抗腫瘤作用，但是其水溶性均較低(約lOug/ml)， 因此臨床上所使用的紫杉醇注射液和多烯紫杉醇注射液均需要分別使用表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨酯80 (吐溫-80)以及助溶劑乙醇來到溶解紫杉醇藥物的目的。紫杉醇注射液和多烯紫杉醇注射液則最早分別是由美國百時美施貴寶公司和法國賽諾菲-安萬特公司成功開發上市的產品。雖然使用表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨酯80后可以配制成注射液，但是其在臨床應用中的毒副作用較大，容易引起較多的并發癥，較為常見的包括過敏反應、骨髓抑制(主要表現為中性粒細胞減少)、液體潴留、神經毒性、脫發等不良反應。大量的研究顯示聚氧乙烯蓖麻油在體內可促進大量組織胺釋放，進而產生過敏反應，還可導致神經傳導延遲感覺神經病變。此外，聚氧乙烯蓖麻油還可以在血液中形成微小顆粒包囊紫杉醇分子，影響了藥物分子向組織的擴散，從而影響了其抗腫瘤效應。還有研究表明聚氧乙烯蓖麻油可溶解PVC輸液器中的二乙烯己基鄰苯二甲酸鹽(Diethylehexy Withalate)。而聚山梨酯80 (吐溫-80)具有溶血性，且黏度大，臨床用藥很不方便。上述注射液制劑在毒副作用、給藥方便性以及穩定性等方面均存在一定的問題，因此開發新的紫杉烷類藥物給藥劑型成為必要。許多生物相容性的聚合物可以用來制備聚合物外殼，包裹在不溶于水的藥理活性藥物的外部。實際上任何一種聚合物，天然的或是人工合成的，只要能根據需要在其結構內含有巰基或二硫鍵，就可以用于在實際上不溶于水的藥理活性藥物的周圍形成一層二硫鍵交聯外殼。含有半胱氨酸和/或二硫鍵的蛋白質是藥學上可接受的生物學載體，本專利以人血清白蛋白為例。人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)由585個氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質，分子質量66. 5kDa，是人血漿中最豐富的蛋白質(占人體血漿總蛋白的 50% -60% )，具有化學性能穩定、安全無毒、無免疫原性、生物相容性好、生物可降解、體內長循環(半衰期長達19天)的特點。
HSA作為抗腫瘤藥物載體材料，具有很多優點，主要包括①優越的藥物負載潛力HSA多肽鏈上帶有較多的極性基團及疏水性氨基酸，對 70%的小分子藥物、特別是難溶性藥物具有高度的親和力，且可發生可逆結合，為其有效負載和釋藥提供可能；白蛋白二級結構中含有約48%的α-螺旋結構，15% β-折疊片結構， 其余為無規線團結構，因此具有很多的網狀空隙，為攜帶藥物創造了有利的空間條件。②廣譜腫瘤靶向白蛋白是腫瘤細胞的重要氮源，快速生長的腫瘤具有很強的攝取和儲備白蛋白能力。HSA作為抗腫瘤藥物載體，通過與血管內皮細胞膜上的白蛋白受體結合，激活細胞膜上的窯蛋白，從而將抗腫瘤藥物轉移到腫瘤細胞間質中。腫瘤細胞間質和腫瘤細胞表面富含大量的半胱胺酸酸性分泌性蛋白，該蛋白功能類似于白蛋白受體，能專門吸引和粘附白蛋白，而半胱胺酸酸性分泌性蛋白在幾乎所有的腫瘤組織(膀胱、肝臟、卵巢、腎、消化道、乳腺等)都過度表達，這就形成了腫瘤組織中的藥物儲藏池，為載有抗腫瘤藥物的白蛋白納米載體的廣譜靶向殺傷提供了可能。③結構可修飾性HSA結構中含有大量的反應活性基團，如游離氨基、羧基、巰基等，可與抗腫瘤藥物通過化學鍵偶聯，改善藥物溶解性、提高體內循環時間以及腫瘤靶向性；也可與抗體或配體等“靶分子”偶聯，進一步提高HSA納米載體的腫瘤靶向性能。近年來，也有報道將HSA和葡聚糖、己醛醣或聚異丙基丙烯酰胺等高分子材料相偶聯以改善HSA 作為藥物載體材料的理化性質。鑒于HSA作為藥物載體材料具有獨特優勢，目前國內外對基于白蛋白的藥物遞送系統研究主要集中于兩個方向①前體藥物利用HSA大量的反應活性基團，將藥物、尤其是抗腫瘤藥物(阿霉素、 紫杉醇、多烯紫杉醇、甲氨喋呤、絲裂霉素、5-氟尿嘧啶)化學偶聯于HSA的游離氨基、羧基或巰基，以改善藥物溶解性、提高體內循環時間以及腫瘤靶向性，國外已有較多報道。然而通過將HSA和藥物直接化學偶聯，存在以下問題1)藥物可選擇范圍窄藥物需有一定的反應活性基團，且在化學偶聯過程中藥物易失效；幻療效發揮的不定性藥物與HSA之間化學鍵斷裂的容易程度決定了藥物療效的發揮，過快斷裂，HSA失去作為載體材料的優勢，過慢斷裂，藥物則無法發揮療效；幻成本高，載藥量低偶聯過程中，藥物投料量遠遠大于HSA，而偶聯藥物量有限，造成制備成本大(特別是抗腫瘤藥物原料價格昂貴)，體系載藥量低的缺陷。②納米遞藥體系物理包封藥物可顯著提高載體材料對藥物的負載。目前，國內外報道的白蛋白納米粒制備或載藥工藝主要有乳化凝聚法、去溶劑化法、PH凝聚法以及Nab 技術。前三種方法雖然研究應用時間最長，報道最多，但仍存在很多問題1)粒徑大。納米粒粒徑0. 5-10 μ m，且易受操作條件影響，小于200nm的白蛋白納米粒幾無報道，過大的粒徑不利于納米載體通過腫瘤的EI^R效應蓄積于腫瘤；2)需固化。由于HSA高度水溶，所制得的納米粒子需要固化操作，S卩加入化學交聯劑使白蛋白發生交聯或加熱使蛋白發生變性，前者毒性較大，且易使藥物同時發生交聯而失去療效，后者則不適合溫度敏感藥物的負載；另外，還有人認為采用交聯或加熱固化的方法會減少HSA納米粒表面的親水性，從而減少在血液中循環時間，不利于腫瘤靶向；3)后處理工藝復雜。由于工藝中使用了表面活性劑、油、化學交聯劑等有毒添加劑，需以大量有機溶劑清洗純化，但是少量殘留仍將給用藥安全帶來隱患；采用高速離心分離(16000-2(KKK)g)收集納米粒，不僅對儀器要求高，而且在水中重分散性差；4)適用藥物范圍小。僅適合于水溶性藥物的負載，而相當一部分抗腫瘤藥物為難溶性藥物。Nab技術是美國生物科學公司近年來建立的藥物結合白蛋白納米技術。該技術僅適合于血漿蛋白結合率比較高的脂溶性藥物的包裹。2005年，以該技術制備的紫杉醇結合白蛋白納米粒(凱素 )獲得FDA批準上市，主要用于轉移性乳腺癌聯合化療失敗后或輔助化療6個月內復發的乳腺癌。該制劑相對于傳統的聚氧乙烯蓖麻油制劑(泰素 )具有更低的毒性、更好的療效，但是也存在不少缺陷，包括1)毒性溶劑的使用。采用氯仿為溶媒，雖有真空蒸發操作， 但增加了工藝難度，并且產品可能有溶劑殘留；2)載藥量低。僅能控制在2-10wt%，需消耗大量的HSA ;3)體內外穩定性差。該制劑在pH>5.8條件下，藥物在幾小時內極易析出，因此制劑PH值需控制在pH5. 4-5. 8范圍內(在此范圍也僅穩定Mh)。而人體內環境pH值為7. 4，該制劑進入血液循環以后，預計藥物短時間將從載體析出而不利于腫瘤的特異性攝取，目前臨床上用藥劑量是泰素 制劑的1. 5倍。由于超聲波技術等制備方法均不能用于工業化規模的生產，并且其得到的微粒粒徑太大，這使其不合適和不能用于病人給藥使用。因此美國生物科學有限公司在專利 US2007082838以及CN98808225和CN97199720中記載了并要求分別保護用高壓勻化方法制備可以重制的多烯紫杉醇/紫杉醇和人血清白蛋白的冷凍干燥制劑，且所得重構后混懸液的穩定性超過M小時。高剪切技術具有超強的混合、粉碎、分散、乳化等功能，對于SBS、SBR等高分子彈性材料有特別顯著的粉碎效果，能有效解決各類物料的粉碎、乳化難題，取代了傳統的膠體磨設備。與傳統的生產工藝相比，具有能耗低、生產成本低、產品質量高、超細化等優勢。在CN98808225和CN97199720專利中記載并要求保護含有水不溶性藥物以及蛋白質包衣顆粒的藥物輸送系統及其制備方法，其中所述的顆粒平均直徑為10-200nm。其所述藥物組合系統的制備方法為將含所述水不溶性藥物并在其中分散的有機相和含蛋白質的水性介質組成的混合物置于3000-30000I^i的高壓勻漿器內，使其接受高剪切處理，產生上述顆粒，并且該組合物不含有表面活性劑。本發明人曾多次重復上述專利的實施例，特別是CN97199720的實施例1、5和6，不曾得到在此專利的實施例和權利要求中所說明的結果。本發明人制備了所公開的混合物， 然后在其所推薦的壓力范圍內用Avestin高壓均質機對混合物進行處理，得到pH = 6. 8的納米乳劑，并且按照專利中所述的用旋轉蒸發器蒸發除去溶劑，可產生平均粒徑約為220nm 的納米顆粒，在進行冷凍干燥后加入生理鹽水后很容易重制成為混懸液，但是其納米顆粒大小較冷凍干燥前明顯增加，平均粒徑由冷凍干燥之前的220nm增大為390nm，且在4h內即出現納米顆粒的沉淀。此外，以專利CN97199720中所記載的微孔濾膜進行過濾，但結果是濾器很容易出現堵塞，且藥物產率低于30%，這與專利中所陳述的70-100%的產率結果不同。在US20070^838專利中記載并要求保護加入穩定劑檸檬酸鈉和/或氯化鈉的包含多烯紫杉醇藥物的白蛋白納米粒，其平均粒徑< 200nm，并且如專利中所述，這些用高于勻化方法得到的納米乳劑據稱有很高的穩定性，此處術語“穩定性”的意義既表示平均粒徑不隨時間或冷凍干燥過程而變化，也表示不出現納米顆粒的藥物沉淀(US20070^83，實施例 12)。本發明人曾多次重復上述專利的實施例，特別是US20070^83的實施例11，16，和 18，不曾得到在此專利實施例和權利要求書中所公開的結果。本發明人制備了所公開的混合物，然后在其推薦的壓力范圍內用Avestin高壓均質機對其處理，得到pH = 7. 2的納米乳劑，利用旋轉蒸發器蒸發除去有機溶劑后，產生平均粒徑約^Onm的納米顆粒。但是很快出現納米顆粒的沉淀，在進行所述的微孔濾膜過濾(1. 2um，0. 8um，0. 45um和0. 22um)時較難，濾膜容易出現堵塞的情況，且其凍干物在生理溶液中重制后形成的納米混懸液不穩定， 約8小時內出現肉眼可見的沉淀，這些與專利中聲稱的穩定性大于M小時的結果截然不同。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述問題和缺點，本發明提供一種制備工藝更簡單、性質更穩定以及更佳的臨床應用性質的蛋白納米顆粒。 本發明的另一個目的是提供上述蛋白納米顆粒的制備方法。本發明人在制備蛋白納米顆粒的過程中無意中發現，當將水溶性載體材料(如， 聚乙二醇，甘露醇，PVP，等)加入蛋白質體系后，包載難溶性藥物的蛋白質納米顆粒更易形成，同時粒徑均勻，穩定性提高。為了考察此水溶性載體材料在體系中的作用，本發明人研究了水溶性載體材料與蛋白質類之間的關系，令人驚奇的是，透射電鏡和差示掃描量熱的結果均反映出，此二者并不是簡單的混合體系，而是通過相互作用形成了一種新的復合體系。我們推測由于此新的復合體系的形成，使得難溶性藥物可以更好的被包載，從而使得制備工藝的可操作性顯著提升，同時使得納米顆粒更穩定與更均勻。由于此新復合體系的顯著優勢，本發明人繼而嘗試將此水溶性載體與難溶性藥物先混合，使難溶性藥物以分子分散的形式存在于水溶性載體中，二者以固體分散體的形式加入蛋白質類溶液中，混合并經過高剪切力的作用形成難溶性藥物的蛋白質納米顆粒。結果發現蛋白質納米顆粒更易形成，穩定性更佳；同時，該納米顆粒具有明顯的血液長循環和組織、器官靶向性，具有更優良的藥效學性質。本發明提供一種將難溶性物質(如紫杉醇，多烯紫杉醇，環孢菌素，羥基喜樹堿， 等)以分子分散狀態的形式加入到一個納米級別載體的制備方法。該方法比nab技術更易獲得難溶性藥物納米顆粒(平均直徑小于200納米)，且不需加入任何有毒的有機溶劑 (如，二氯甲烷，氯仿，等等)，避免了有機溶劑在制劑中的殘留，大大提高臨床用藥的安全性。同時，本發明提供一種蛋白納米顆粒，該蛋白納米顆粒對難溶性藥物載藥量高，可以顯著降低蛋白質類物質的用量；該蛋白納米顆粒還具備良好的體內外穩定性，液體制劑在室溫條件下可長時間穩定保存，提高用藥方便性和安全性。該方法所獲得的難溶性藥物的納米顆粒具有明顯的血液長循環和組織、器官靶向性，因此具備更加良好的藥效學性質。 綜上所述，本發明提供一種制備工藝更簡單、性質更穩定以及更佳的臨床應用性質的蛋白納米顆粒。該蛋白納米顆粒具有粒徑均勻、穩定性好、安全性好高等特征。
本發明的目的是通過下列技術方案實現的—種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的制備方法，該方法包括下列步驟a.將難溶性藥物與水溶性載體材料制成含有難溶性藥物的水溶性載體固體分散體；b.將所得的固體分散體加入含蛋白質類物質的水性介質中，混合均勻，混合物經高剪切條件處理得到包裹了難溶性藥物的蛋白納米顆粒的混懸液；c.將混懸液進行干燥或先經過無菌過濾再干燥，按所需劑型制成包裹了難溶性藥物的蛋白納米顆粒的固體制劑、半固體制劑或氣體制劑；或者將步驟b得到混懸液直接作為液體制劑或進一步制備成其他類型的液體制劑、或將混懸液干燥或先經過無菌過濾再干燥后再復溶制成液體制劑。所述的制備方法，其中所述的難溶性藥物指在每ml水中溶解度小于Img或1μ 1 的物質；優選藥理活性物質、診斷試劑或者營養物質中的一種或多種。所述的制備方法，其中藥理活性物質選自止痛藥、退燒藥、麻醉藥、平喘藥、抗生素、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗真菌藥、抗高血壓藥、抗炎藥、抗腫瘤藥、抗焦慮藥、免疫抑制劑、抗偏頭疼藥、鎮靜劑、安眠藥、抗心絞痛藥、抗精神病藥、抗躁狂藥、抗心律失常藥、抗關節炎藥、抗痛風藥、抗凝藥、溶栓藥、抗纖溶藥、血液流變學試劑、抗血小板藥、抗驚厥藥、抗帕金森藥、抗組胺藥、止癢藥、鈣調節藥、抗菌藥、抗病毒藥、抗感染藥、支氣管擴張藥、激素、 降糖藥、降脂藥、核酸、促紅細胞生成藥、抗潰瘍、抗反流藥、止惡心藥/止吐藥、米托坦、更昔洛韋結氨酸酯、亞硝基脲鹽、蒽環類抗生素和玫瑰樹堿中的一種或多種；診斷試劑選自超聲造影試劑、放射造影試劑或磁造影試劑中的一種或多種；營養物質選自氨基酸、糖、蛋白質、碳水化合物、脂溶性維生素或脂肪中的一種或多種。所述的制備方法，其中抗腫瘤藥選自環磷酰胺、放線菌素、博來霉素、正定霉素、阿霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、卡鉬、卡氮芥、甲基-卡氮芥、順鉬、鬼臼乙叉甙、干擾素、喜樹堿及其衍生物、苯芥膽留醇、紫杉醇及其衍生物、多烯紫杉醇及其衍生物、阿霉素及其衍生物、長春堿、長春新堿、三苯氧胺、哌酰硫烷；所述的免疫抑制藥選自環孢菌素、硫唑嘌呤、咪唑立賓或他克莫司；所述的抗病毒藥物選自Y-干擾素、疊氮胸苷、金剛烷胺、無環鳥苷；所述的抗真菌藥選自灰黃霉素、酮康唑、兩性霉素B、制霉素類、殺念菌素；所述的抗高血壓藥選自普萘洛爾、普羅帕酮、尼莫地平、烯丙氧心安、硝苯地平、利血平、帕吉林鹽酸鹽、脫甲氧利血平、二氮嗪、長壓定、蘿芙木堿、硝普鈉、緩脈靈、蛇根混合堿、甲磺酸酚妥拉明。所述的制備方法，其中水溶性載體材料選自下列物質中的一種或多種聚乙二醇、 聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚乙烯氧化物、混合脂肪酸酯、甘露醇、尿素、海藻酸鈉、羥丙基纖維素鈉、聚丙烯酸樹脂、明膠、羧甲基纖維素鈉。本發明所稱的蛋白質類物質是指能夠通過巰基和/或二硫鍵交聯的下列物質天然存在或合成的蛋白質及其衍生物、合成的蛋白聚合物及其衍生物、天然的或合成的類蛋白及其衍生物，或是它們的混合物。所述的制備方法，其中天然存在的蛋白質包括白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶；所述合成的蛋白聚合物選自含有游離巰基和/或二硫基修飾的下列物質中的一種或多種聚乙醇、聚乙基惡唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚二醇、聚乙交酯、聚己酸內酯或其共聚物、合成聚氨基酸。所述的制備方法，其中水性介質選自注射用水、純水、甘露醇溶液、磷酸鹽水溶液、 右旋糖酐溶液、葡萄糖水溶液、氯化鈉水溶液、氨基酸溶液、維生素溶液、碳水化合物溶液， 或它們的任意兩種或兩種以上的混合物。所述的制備方法，其中制備含有難溶性藥物的水溶性載體固體分散體的方法為熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法、溶劑-噴霧(冷凍)干燥法、研磨法、或雙螺旋擠壓法；且這些方法不引入任何有機溶劑或者任何除乙醇之外的其他有機溶劑；優選采用溶劑-熔融法。 (熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法等方法是制備固體分散體的常規方法。例如，將藥物用乙醇溶解(溶劑)，水溶性載體加熱熔融(熔融)，兩者混合，此即溶劑-熔融法。再例如，將藥物加熱熔融，水溶性載體加熱熔融，兩者混合，此即熔融法。如果是溶劑-熔融法，則為 “不需要引入任何除乙醇之外的其他有機溶劑”即，只用乙醇。如果是熔融法，則為“不需要引入任何有機溶劑”。本發明優選采用的是溶劑-熔融法，溶劑-熔融法相較熔融法的優勢是有些藥物直接熔融，會導致溫度過高，發生降解，穩定性不能保證，因此本專利主要采用溶劑-熔融法，具體采用何種方法可以根據選用的藥物及載體的性質決定。)所述的制備方法中高剪切條件是指應用同時具備高壓和高切變力的設備，使混合物達到高效的混合、粉碎、分散及乳化等目的；其中，高壓是指壓力范圍在5000至30000磅 /英寸2，優選6000 25000磅/英寸2。所述的制備方法，其中該蛋白納米顆粒的平均粒徑為20 lOOOnm，優選為20 200nm。所述的制備方法，其中干燥方法采用冷凍干燥或噴霧干燥；無菌過濾采用 0. 22 μ m濾器過濾。一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒，該蛋白納米顆粒的配方含有下列重量百分比的物質0. 1 10%難溶性藥物，0. 1 40%水溶性載體材料，50 90%蛋白質類物質。 該蛋白納米顆粒是采用上述方法制備得到的。詳細地說，本發明是提供一種將難溶性物質(如紫杉醇，多烯紫杉醇，環孢菌素， 阿霉素等)以分子分散狀態的形式加入到一個納米級別載體的制備方法。該方法比nab技術更易獲得難溶性藥物小納米顆粒(平均直徑小于200納米)，且不需加入任何有毒的有機溶劑(如，二氯甲烷，氯仿，等)。該方法所獲得的難溶性藥物的納米顆粒更加穩定，并且載藥量高，具有明顯的血液長循環和組織、器官靶向性，因此具備更加良好的藥效學性質。該方法提供一種通過去溶劑技術形成難溶性物質的納米顆粒的方法，比如，高剪切力(如超聲，高壓勻漿作用或類似條件)可被用來在缺乏任何常規表面活性劑和任何聚合核心物質的條件下形成納米顆粒的基質。該方法提供一種可重復使用的小納米顆粒(直徑小于200納米)的制備方法，該顆粒可通過0. 22微米濾器無菌過濾。這種可通過0. 22微米濾器過濾的一定大小的納米顆粒的制備意義重大，因為含有大量任何蛋白質(如白蛋白)的制劑均不能用常規的方法如高壓滅菌進行消毒，因為熱可使蛋白變性。當然，如果采用孔徑更大的濾器也可將顆粒的平均粒徑控制在IOOOnm左右，但本發明優選將顆粒的平均粒徑控制在20 200nm。
在水性介質中加入蛋白質類物質(例如，人血清白蛋白)的濃度范圍約為 0. 05-25% (w/v, g/ml，下同)，范圍在0. 5%-10% (w/v)內更好。這些水性介質有生理鹽水、緩沖生理鹽水、水、緩沖的水性介質、氨基酸溶液、維生素溶液、碳水化合物溶液或類似的介質，以及任何2種以上這些介質的混合物。與常規的納米顆粒形成方法不同，混合物內不需要加入表面活性劑(例如，十二烷基硫酸鈉、卵磷脂、吐溫80、多聚醇F68和類似化合物等)或有毒有機溶劑(例如，二氯甲烷、氯仿等)。將難溶性物質(例如，紫杉醇、多烯紫杉醇等)與水溶性載體(如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆等)通過熔融法、溶劑法或熔融溶劑法等方法制備成一種含難溶性物質和水溶性載體的固體分散體(粉末)。該固體分散體的形成不需要引入任何除乙醇之外的其他有機溶劑，甚至根本不需要引入有機溶劑，避免了有機溶劑(如氯仿，二氯甲烷等)在制劑中的殘留，大大提高臨床用藥的安全性。于低剪切力下經均化作用形成一種由微米和納米小滴組成的混合物。這可以通過本領域技術人員公知的方式來完成，例如，采用一種操作范圍在大約2，000至大約15，000
轉/分鐘的常規實驗室均漿器。載藥納米顆粒是在高剪切力條件下經均化作用形成的。這種均化作用通常在高壓均漿器內進行，典型的操作壓力在5，000至30，000磅/英寸2的范圍內，此過程在6，000至 25，000磅/英寸2范圍內進行更好。生成的乳劑含極細微的水性載體納米小滴(含溶解的藥理活性物質等)和極細微的蛋白質納米小滴。可接受的均化方法包括可賦予高剪切和空化作用，如高壓均漿器、超聲處理器、高剪切攪拌器，和類似設備。液體混懸物可經干燥得到包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的粉末。生成的粉末可于任何合適的時間和在適宜的水性介質中再分散得到能對哺乳動物給藥的混懸液。這些水性介質有生理鹽水、緩沖生理鹽水、水、緩沖的水性介質、氨基酸溶液、維生素溶液、碳水化合物溶液或類似的介質，以及任何2種以上這些介質的混合物。為得到這種粉末所采用的方法包括冷凍干燥、噴霧干燥，和類似的技術。通過除去其內含的水分，例如，在適宜的溫度-時間范圍內用真空冷凍干燥方法即可進一步轉換成粉末形式。蛋白質(例如，人血清白蛋白)本身起冷凍保護劑作用，不需要使用常規冷凍保護劑如甘露醇、蔗糖、甘油，和類似的化合物，并且這種粉末通過加入水、 生理鹽水或緩沖液可以容易地重組。盡管不需要，但當然可以理解為如十分必要，這些常規的冷凍保護劑可以加入到本發明的配方中。根據本發明一個實施方案，提供了一個形成極為細小的亞微米顆粒(納米顆粒)， 即直徑小于200納米的顆粒的方法。這種顆粒在以液體混懸液方式使用之前能進行無菌過濾。本發明配制過程所得最終產品(即藥物顆粒)能無菌過濾是有重要意義的，因為不可能用常規方法如壓熱器對含高濃度蛋白質(例如，人血清白蛋白)的混懸液進行滅菌。所述包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒在制藥中的應用，該蛋白納米顆粒可以用于胃腸道給藥和非胃腸道給藥所用。該蛋白納米顆粒的制劑形式可以是固體劑型、半固體劑型、液體劑型以及氣體劑型，包括凍干粉、膠囊劑、顆粒劑、軟膏劑、糊劑、混懸劑、注射劑、噴霧劑、吸入劑等。計劃用于本發明實施的難溶性藥物包括藥理活性藥物，診斷試劑，營養物質等中的一種或多種。
所述藥理活性劑選自止痛藥、退燒藥、麻醉藥、平喘藥、抗生素、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗真菌藥、抗高血壓藥、抗炎藥、抗腫瘤藥、抗焦慮藥、免疫抑制劑、抗偏頭疼藥、鎮靜劑、安眠藥、抗心絞痛藥、抗精神病藥、抗躁狂藥、抗心律失常藥、抗關節炎藥、抗痛風藥、抗凝藥、溶栓藥、抗纖溶藥、血液流變學試劑、抗血小板藥、抗驚厥藥、抗帕金森藥、抗組胺藥、 止癢藥、鈣調節藥、抗菌藥、抗病毒藥、抗微生物藥、抗感染藥、支氣管擴張藥、激素、降糖藥、 降脂藥、蛋白質、核酸、促紅細胞生成藥、抗潰瘍/抗反流藥、止惡心藥、止吐藥、脂溶性維生素、米托坦、更昔洛韋結氨酸酯、亞硝基脲鹽、蒽環類抗生素和玫瑰樹堿。所述的藥物舉例如下鎮痛劑/解熱劑(如阿司匹林，對乙酰氨基酚，布洛芬，萘普生鈉，磷酸可待因，酒石酸二氫可待因，二氟尼酸，甲芬那酸，環丁嗎喃醇酒石酸鹽，水楊酸膽堿，布他比妥，甲氧異丁嗪，眠爾通等)；麻醉劑(如環丙烷，恩氟烷，氟烷，異氟烷，甲氧氟烷，一氧化氮，普魯泊福(丙酚)，等)；平喘藥(如氮卓斯汀，酮替芬，Traxanox,等)；抗生素(如新霉素，鏈霉素，氯霉素，頭孢菌素，氨比西林，青霉素，四環素等)；抗抑郁藥(如甲苯噁唑辛，奧昔哌汀，阿莫沙平，麥普替林鹽酸鹽，雙羥水楊酸米帕明，去甲替林，異唑胼，等)；抗糖尿病藥(如雙胍類，激素，硫酰脲衍生物類，等)；抗真菌藥(如灰黃霉素，酮康唑，兩性霉素B，制霉素類，殺念菌素，等)；抗高血壓藥(如，普萘洛爾，普羅帕酮，烯丙氧心安，硝苯吡唆，利血平，樟腦磺酸咪噻芬，脫甲氧利血平，二氮嗪，長壓定，蘿芙木堿，硝普鈉，緩脈靈，蛇根混合堿，甲磺酸酚妥拉明，利血平，等)；抗炎藥(如(非甾體類)消炎藥，萘普生，布洛芬，炎痛喜康，(類固醇類)皮質酮，地塞米松，氟噁米松，氫化可的松，強的松龍，強的松，等)；抗腫瘤藥(如環磷酰胺，放線霉素，博來霉素，正定霉素，阿霉素，絲裂霉素，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，卡鉬，卡氮芥(BCNU)，甲基-CCNU，順鉬，鬼臼乙叉甙，干擾素，喜樹堿及其衍生物，苯芥膽留醇，紫杉醇(泰素)及其衍生物，多烯紫杉醇及其衍生物，長春堿，長春新堿，三苯氧胺，哌酰硫烷，等)；抗焦慮藥(如氯羥去甲安定，環丙二氮卓，去甲羥安定，安定羧酸鉀鹽，安定，雙羥萘酸羥嗪，阿普唑侖，氟哌利多，哈拉西泮，芬那露，丹曲林，等)；免疫抑制劑(如環孢菌素，硫唑嘌呤，咪唑立賓，他克莫司[Π(506 (tacrolimus)] 等)；抗偏頭痛藥(如半乳糖二酸異美汀，二氯醛安替比林，等)；鎮靜劑/催眠藥(如巴比妥類(如戊巴比妥，戊巴比妥鈉，司可巴比妥鈉)，苯二氮卓類(如氟西泮鹽酸鹽，三唑侖，托馬西泮，咪達唑侖鹽酸鹽，等))；抗心絞痛藥(如β -腎上腺能拮抗劑，鈣通道阻滯劑(如硝苯吡啶，等))；抗精神病藥(如氟哌啶醇，硫利噠嗪，替沃噻噸，氟奮乃靜癸酸酯，氯奮乃靜庚酸酯，奮乃靜，檸檬酸鋰，丙氯拉嗪，碳酸鋰，等)；抗心律失常藥(如艾司洛爾，乙胺碘呋酮，地高辛，等)；抗關節炎藥(如保泰松，舒林酸，青霉胺，水楊酰水楊酸，炎痛喜康，硫唑嘌呤，消炎痛，甲氯滅酸鈉，硫代蘋果酸金鈉，苯酮苯并酸，金諾芬，硫代葡萄糖金，痛滅定，等)；
抗痛風藥(如秋水仙堿，別嘌醇，等)；抗凝劑(如肝素，肝素鈉，華法令鈉，等)；血栓溶解劑(如尿激酶，鏈激酶，重組纖溶酶原激活劑，等)；抗纖溶劑(如氨基己酸)；血液流變學藥物(如己酮可可堿)；抗血小板藥物(如阿司匹林，安匹林，等)；抗驚厥藥(如丙戊酸，二丙戊酸鈉，苯妥英，苯妥英鈉，氯硝安定，去氧苯比妥，苯巴比妥，苯巴比妥鈉，卡馬西平，異戊巴比妥鈉，甲琥胺，甲基巴比妥，甲基苯巴比妥，美芬妥英苯琥胺，對甲雙酮，乙苯妥英，苯乙酰脲，司可巴比妥鈉，氯氮卓二鉀，三甲雙酮，等)；抗帕金森藥物(如乙琥胺等)；抗組胺藥/止癢劑(如撲爾敏，特非那丁，芐吡二胺，等)；用于鈣調節的藥物(如降血鈣素，甲狀旁腺素，等)；抗菌素(如氨曲南，氯霉素，甲硝唑，等)；抗病毒藥物(如Y干擾素，疊氮胸苷，無環鳥苷，等)；抗微生物藥物(如頭孢菌素類(如頭孢唑林鈉，頭孢拉定，頭孢克羅，頭孢匹林鈉，頭孢唑肟鈉，一水合頭孢羥氨芐，頭孢他啶，頭孢氨芐，頭孢噻吩鈉，鹽酸一水合頭孢氨芐，頭孢孟多鈉，頭孢西丁鈉，頭孢尼西鈉，頭孢雷特，頭孢三嗪鈉，頭孢他啶，頭孢羥氨芐， 頭孢拉定，頭孢呋新鈉，等)，青霉素類(如氨芐西林，阿莫西林，芐星青霉素G，鄰氯青霉素，氨芐青霉素鈉，青霉素G鉀，青霉素V鉀，氧哌嗪青霉素鈉，阿洛西林鈉，羧茚青霉素鈉卡茚西林，青霉素G鉀，普魯卡因青霉素G，甲氧西林鈉，新青霉素III鈉，等)，紅霉素類(如 琥乙紅霉素，紅霉素，無味紅霉素，紅霉素硬脂酸酯，琥乙紅霉素，等))；抗感染劑(如GM_CSF)；支氣管擴張劑(如擬交感神經類(如乙基異丙腎上腺素，舒喘靈，腎上腺素，酒石酸腎上腺素)，抗膽堿能藥(如溴化異丙托品)，黃嘌呤類(如氨茶堿，喘定，硫酸異丙喘寧，氨茶堿)，肥大細胞穩定劑(如色甘酸鈉)，吸入皮質激素類(如氟尼縮松倍氯米松，一水合二丙酸倍氯米松)，舒喘靈，二丙酸倍氯米松(BDP)，溴化異丙托品，喘樂寧，酮替芬，沙米特羅，硫酸特布他林，去炎松，氨茶堿，萘多羅米鈉，硫酸異丙喘寧，舒喘靈，氟尼縮松，等)；激素(如雄性激素類(如達那唑，環戊丙酸睪酮，氟甲睪酮，乙基睪酮，庚酸睪酮，甲基睪酮，氟甲睪酮，環戊丙酸睪酮)，雌激素類(如雌二醇，雌酮，結合雌激素)，皮質類固醇類(如去炎松，倍他米松，地塞米松，強的松，甲基強的松龍懸液，去炎松縮酮，甲基強的松龍，六氯化曲安縮松，氫化可的松，強的松龍，強的松龍叔丁乙酯，強的松龍醋酸酯， 強的松龍磷酸鈉，等)，甲狀腺激素類(如左旋甲狀腺素鈉，等)；降糖藥物(如人胰島素，純化牛胰島素，純化豬胰島素，優降糖，氯磺丙脲，格列吡嗪，甲磺丁脲，甲磺氮卓脲，等)；降脂藥物(如安妥明，右旋甲狀腺素鈉，丙丁酚，美降脂，煙酸，等)；蛋白質(如脫氧核糖核酸酶，藻酸酶，超氧化歧化酶，脂肪酶，等)；核酸(如編碼任何治療用蛋白質的正義或反義核酸，包括這里提到的任何蛋白質，等)；
用于刺激紅細胞生長的藥物(如紅細胞生長素)；抗潰瘍/抗返流藥物(如法莫替丁，甲睛咪胍，等)；抗惡心/止吐藥物(如大麻隆，丙氯拉嗪，乘暈寧，硫乙哌丙嗪，東莨菪堿，等)；脂溶性維生素(如維生素A，D，E，K，等)；還有其他藥物如米托坦，更昔洛韋纈氨酸酯(visadine)，亞硝脲鹽，蒽環類抗生素，甲基羥基玫瑰樹堿，等。計劃用本發明實施診斷藥劑的實例包括制備如超聲診斷造影劑、放射造影劑(如碘化辛烷、鹵烴、腎造影素等)、核磁共振造影劑(如碳氟化物、脂溶性的順磁化合物等)及其如果不經物理或化學修飾改變其實際上難溶于水的特性就難以輸送的診斷藥劑。計劃用于本發明實施的營養性藥品的實例包括氨基酸、糖、蛋白質、碳水化合物、 脂溶性維生素(例如維生素A、C、D、K等)、或脂肪、或它們的任意兩種或多種物質的混合物。本項發明的實施中，許多生物相容性的蛋白質類物質可以用來制備蛋白納米顆粒的載體外殼，包裹于難溶性藥物的外部。實際上任何一種蛋白質類物質，天然的或是人工合成的，只要能根據需要在其結構內含有巰基或二硫鍵，就可以用于在難溶性藥物的周圍形成一層二硫鍵交聯外殼。巰基或二硫鍵可預先存在于聚合物結構中或可以通過適當的化學修飾導入，例如天然存在的聚合物如蛋白質、肽、多核苷酸、多聚糖(如淀粉、纖維素、葡聚糖、褐藻膠、脫乙酰殼多糖、果膠、透明質酸等)、蛋白多糖、脂蛋白等均是用這種修飾的候選者ο本發明中的蛋白質類包括白蛋白(含有35個半胱氨酸)、免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血紅蛋白(每一個α 2β2單位含有6個半胱氨酸殘基)、溶菌酶(含有8個半胱氨酸殘基)、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶等。其中蛋白質、肽、酶、抗體及其它們的混合物是本發明常規應用的蛋白質類物質。目前用于本發明的優選的蛋白質類物質是白蛋白。例如α-2-巨球蛋白(一種周知的調理素)，可以用于增強巨噬樣細胞對載體包裹的難溶性藥物的攝取，或可以促進這種載體包裹的難溶性藥物進入到肝臟和脾臟。同樣，含有半胱氨酸殘基的合成多肽也是在難溶性藥物的外周形成外殼的蛋白質類物質的良好的候選者。另外，聚乙烯醇、聚羥乙基異丁烯酸酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、 聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮等均是化學修飾(如引入巰基和/或二硫鍵)，和形成外殼 (如引起交聯)的良好候選者。所以，計劃用于本發明實施的這些材料的例子是，含有半胱氨酸殘基和/或二硫鍵的合成多氨基酸；聚乙烯醇，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵； 聚羥乙基異丁烯酸酯，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚丙烯酸，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚乙噁唑啉，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚丙烯酰胺，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚乙烯吡咯烷酮，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵； 聚二醇，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚交酯、聚乙交酯、聚己酸內酯，或它們共聚物，經修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；以及上述材料的任何兩種或多種的混合物。本發明的有益效果本發明提供一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的制備方法，該方法將混懸的難溶性藥物顆粒包封于一種由可生物相容的復合聚合物殼體內，其直徑為納米級。該方法不
13需要引入任何除乙醇之外的其他有機溶劑，甚至根本不需要引入有機溶劑，避免了有機溶劑(如氯仿，二氯甲烷等)在制劑中的殘留，并且不會產生因添加助溶劑或乳化劑而引起的過敏反應，大大提高臨床用藥的安全性；該方法也不需要使用常規的表面活性劑。該方法提供一種更易形成和更加穩定的難溶性藥物納米顆粒，該方法工藝簡單、成本低、操作性強。 該方法本發明同時提供一種能無菌過濾的納米顆粒的制備方法。同時，本發明提供一種蛋白納米顆粒，該蛋白納米顆粒對于難溶性藥物的載藥量高，可以顯著降低蛋白質類物質的用量；該蛋白納米顆粒還具備良好的體內外穩定性，液體制劑在室溫條件下可長時間穩定保存，提高用藥方便性和安全性。該方法所獲得的難溶性藥物的納米顆粒具有明顯的血液長循環和組織、器官靶向性，因此具備更加良好的藥效學性質。綜上所述，本發明提供一種制備工藝更簡單、性質更穩定以及更佳的臨床應用性質的蛋白納米顆粒。該蛋白納米顆粒具有載藥量高、粒徑均勻、穩定性好、安全性高等特征。


圖1是熔融法制備紫杉醇白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。(縱坐標是強度百分比(％ )，橫坐標是粒徑(nm)，圖2、圖7-圖11均類同。)圖2是熔融-溶劑揮發法制備紫杉醇白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖3是WAXD圖。其中樣品a 紫杉醇粉末，樣品b 凍干人血清白蛋白粉末，樣品 c 紫杉醇和白蛋白的物理混合物，樣品d 紫杉醇制劑樣品。圖4是DSC圖。其中樣品a 凍干人血清白蛋白粉末，樣品b 紫杉醇粉末；樣品 c 紫杉醇和白蛋白的物理混合物；樣品d 紫杉醇制劑樣品。圖5是透射電鏡圖。其中樣品a:人血清白蛋白凍干粉末，樣品b:聚乙二醇白蛋白粉末，樣品c 紫杉醇白蛋白納米制劑凍干粉末。圖6是熒光掃描圖。圖中隨著曲線a —h方向，聚乙二醇濃度增加。圖7是多烯紫杉醇白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖8是羥基喜樹堿白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖9是尼莫地平白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖10是維生素E白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖11是碘化辛烷白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖12是環孢菌素白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖13是Y-干擾素白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。圖14是伊曲康唑白蛋白納米制劑強度粒徑分布圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。實施例1通過熔融法作用制備紫杉醇白蛋白納米顆粒將500毫克紫杉醇溶解于9. 0毫升乙醇。1200毫克聚乙二醇于60°C油浴加熱完全熔融后，將紫杉醇溶液加入其中，磁力攪拌直至其完全混合均勻，旋轉蒸發除去乙醇后， 在劇烈攪拌條件下迅速冷卻。真空干燥過夜后，將固體分散體加入85毫升人血清白蛋白水溶液中(4. 5% w/v, g/ml，下同)。混合物經高速分散器(XHF-1，上海金達生化儀器廠)預混1分鐘以形成粗乳，然后轉移到高壓均質機(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin公司)中。 高壓均質在5000-30，000磅/英寸2的條件下進行，將乳劑重復循環至少5次，得蛋白納米顆粒混懸液，獲得的產品有較濃的乳光。經激光粒徑儀(NanO-ZS90，英國Malvern公司)測定，結果得到的紫杉醇白蛋白納米顆粒一般直徑在130-220納米，結果如圖1所示。蛋白納米顆粒混懸液在不添加任何冷凍保護劑的情況下進一步凍干48小時，得到的粉狀物可通過添加無菌水或生理鹽水很容易重構成蛋白納米顆粒混懸液。重構后顆粒的大小與凍干前大致相同。實施例2通過熔融-溶劑揮發法制備紫杉醇白蛋白納米顆粒將300毫克紫杉醇溶解于6. 0毫升乙醇。900毫克聚乙二醇溶于1. 5毫升無水乙醇，在45°C油浴加熱完全熔融后，將紫杉醇溶液加入其中，磁力攪拌直至其完全混合均勻， 旋轉蒸發除去乙醇后，在劇烈攪拌條件下迅速冷卻。真空干燥過夜后，將固體分散體加入 65毫升人血清白蛋白水溶液中G.5%w/V)。混合物經高速分散器(XHF-1，上海金達生化儀器廠)預混1分鐘以形成粗乳，然后轉移到高壓均質機(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin 公司)中。乳化在5000-30，000磅/英寸2的條件下進行，將乳劑重復循環至少6次，得蛋白納米顆粒混懸液，獲得的產品有較濃的乳光，經激光粒徑儀(NanO-ZS90，英國Malvern公司)測定，結果得到的紫杉醇白蛋白納米顆粒一般直徑在120-200納米，結果如圖2所示。蛋白納米顆粒混懸液在不添加任何冷凍保護劑的情況下進一步凍干48小時，得到的粉狀物可通過添加無菌水或生理鹽水很容易重構成蛋白納米顆粒混懸液。重構后顆粒的大小與凍干前大致相同。實施例3小于200納米的可無菌過濾的紫杉醇白蛋白納米顆粒的制備將500毫克紫杉醇溶解于9. 0毫升乙醇。800毫克聚乙二醇溶于1. 5毫升無水乙醇，在45°C油浴加熱完全熔融后，將紫杉醇溶液加入其中，磁力攪拌直至其完全混合均勻， 旋轉蒸發除去乙醇后，在劇烈攪拌條件下迅速冷卻。真空干燥過夜后，將固體分散體加入97 毫升人血清白蛋白水溶液中(4. 5 % w/v)。混合物經高速分散器(XHF-1，上海金達生化儀器廠)預混1分鐘以形成粗乳，然后轉移到高壓均質機(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin公司)中。乳化在10000-40，000磅/英寸2的條件下進行，將乳劑重復循環至少6次，得蛋白納米顆粒混懸液，獲得的產品有較濃的乳光，經激光粒徑儀(NanO-ZS90，英國Malvern公司)測定，結果得到的紫杉醇白蛋白納米顆粒一般直徑在120-170納米。蛋白納米顆粒混懸液通過一個0. 22微米的微孔濾器進行過濾，混濁性或顆粒大小沒有任何改變。紫杉醇含量的HPLC分析顯示超過95%的紫杉醇過濾后可回收，結果如表 1所示。此方法可提供一種無菌的紫杉醇白蛋白納米混懸液。無菌混懸液在不添加任何冷凍保護劑的情況下進一步凍干48小時，得到的粉狀物可通過添加無菌水或生理鹽水很容易重構成蛋白納米顆粒混懸液。重構后顆粒的大小與凍干前大致相同。表 1
樣品平均粒徑(nm)多分散系數含量(％)
過0.22 μ m膜前135.4±2.80.1±0.0498.4±1.0過0.22 μ m膜前142.7±4.00.2±0.0296.2±2.3 實施例4通過X射線粉末衍射判斷納米顆粒形式中紫杉醇的物理狀態
X射線粉末衍射可以用來判定在凍干粉末制劑中紫杉醇的結晶或非結晶特性。根據X射線衍射(X-ray diffraction)原理，衍射峰的峰形主要與晶體的不完整性和晶體結構有關，即晶粒尺寸的大小、晶體中的缺陷和畸變等。根據謝樂公式(Scherrer Equation)， 晶粒尺寸與衍射峰的平方根成反比，而晶粒尺寸的大小反映其結晶度高低，即越寬的衍射峰對應較低的結晶度。稱取少量樣品a_紫杉醇粉末；樣品b_凍干人血清白蛋白粉末；樣品C-紫杉醇和白蛋白的物理混合物；和樣品d-紫杉醇白蛋白納米顆粒凍干粉末(按本發明實施例制備)，)(D-3A粉末衍射儀進行粉末X射線衍射測試。在衍射角5 40°，掃描速度1° /min, 工作電壓40kV，工作電流50mA條件下進行粉末X射線衍射測試，結果如圖3所示。樣品a顯示樣品在5. °、8. 84°和12. 36°處有三個強衍射峰，在15 25°間有若干小衍射峰。樣品b顯示了無定形物質典型的寬帶隆起。樣品c顯示了無定形物質典型的寬帶隆起，但另外可見到5. °、8.84°和12. 36°處的特征峰。樣品d紫杉醇制劑沒有顯示出紫杉醇具有晶化特性的證據，而是與樣品b的無定形物質寬帶隆起極為相似，提示紫杉醇在納米制劑中實際上是以分子狀態或無定型狀態存在的，從而表明藥物紫杉醇經高壓均質后確實存在于白蛋白納米載體中。實施例5紫杉醇白蛋白納米顆粒的DSC圖譜差示掃描量熱法(DifferentialScanning Calorimetry, DSC)是在程序控溫下測量輸入到試樣和參比樣品的功率差與溫度關系的一種技術。晶體熔融時要吸收能量(J) 以破壞晶格，吸收能量的多少與晶體結構有關，分子特定晶型的特征常數熱焓(ΔΗ，單位 J · g"1)可表征其晶型特征。稱取樣品a_凍干人血清白蛋白粉末；樣品b_紫杉醇粉末；樣品C-紫杉醇和白蛋白的物理混合物；和樣品d-紫杉醇白蛋白納米顆粒凍干粉末(按本發明實施例制備)各 2 ;3mg，經NETZSCH-DSC 204分析儀以10°C /min的升溫速率加熱，溫度范圍50 300°C， 氮氣氛進行DSC分析。結果如圖4所示。由圖可知，曲線a顯示白蛋白在67. 4°C有小的脫水放熱峰，222. 3°C左右有緩慢的熔融峰；曲線b中，2 . 2°C吸熱峰和M4. 5°C放熱峰分別為紫杉醇的熔融峰和降解峰，這兩個特征峰同時存在于紫杉醇和白蛋白的物理混合物(曲線c)中，而不存在于紫杉醇白蛋白納米制劑(曲線d)中。以上圖譜數據表明藥物以無定型或固態溶液的形式存在于膠束骨架中。實施例6紫杉醇白蛋白納米顆粒的形態學研究稱取樣品a_人血清白蛋白凍干粉末、樣品b_聚乙二醇白蛋白粉末和樣品C-紫杉醇白蛋白納米顆粒凍干粉末(按本發明實施例制備)適量，以5%葡萄糖溶液充分水合，得淡藍色乳光膠束溶液，磷鎢酸負染法染色，即取1滴待測膠束溶液滴于點滴反應瓷板的凹槽內，并將噴碳銅網放于試液上，1 anin后取出銅網，用濾紙小片從銅網邊緣吸去殘余液體；將該銅網放在染液滴磷鎢酸溶液，PH 7.0)上約30s，吸干多余染液、干燥，經日立 H-7000透射電鏡觀察形態，結果如圖5所示。如圖所示，人血清白蛋白不能形成球形結構，而是分散成均勻溶液狀態；加入聚乙二醇后的人血清白蛋白顯示出較規則的球形結構，粒徑為IOOnm左右；而載藥白蛋白制劑形成更加規則而密集的球形結構，粒徑為120nm左右，粒徑大小分布均勻。同時可知，樣品b、樣品c的透射電鏡粒徑結果分別小于動態光散射實驗所得的粒徑(分別為122nm和 138nm)，這可能是由于TEM樣品制備過程中的干燥過程引起膠束表面的塌陷所致。實施例7聚乙二醇與人血清白蛋白相互作用的熒光光譜法研究人血清白蛋白中含有色氨酸殘基，色氨酸在紫外光激發下可以產生較強烈的熒光。熒光掃譜結果可知，人血清白蛋白的熒光最佳激發波長在^5nm，最大發射波長在 350nm左右。許多小分子藥物或者水溶性載體都可以與白蛋白發生相互影響，從而引發熒光猝滅。根據此原理，我們可以做一系列實驗證明其他物質與白蛋白之間的相互作用。向IOml比色管中依次加入1. OmL的1. OX 10、o 1 .L—1的人血清白蛋白溶液和不同體積的1. 0 X 1 ΟΛιο 1 ·L—1聚乙二醇溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，于恒溫水浴中恒溫1 Omin 孵化，固定Kex = 285nm、Kem = 350nm，測定相對熒光強度"F = F0-F (F,F0分別表示在聚乙二醇存在和無聚乙二醇存在時體系溶液熒光強度)，結果如圖6所示(IF是熒光強度的單位，下標F是熒光fluorescent的意思)。根據熒光結果可知，在25°C的條件下，聚乙二醇對人血清白蛋白內源熒光產生猝滅效應。隨著聚乙二醇濃度的升高(曲線a —h)，白蛋白的熒光發射波長發生藍移，熒光強度同時減弱。結果表明聚乙二醇與白蛋白之間產生了以范德華力為主的相互作用，從而使白蛋白發生了有規律的熒光猝滅，其猝滅機理符合動態猝滅。實施例8藥物濃度對紫杉醇白蛋白納米顆粒粒徑大小的影響改變紫杉醇的濃度，保持其他參數與實施例2中描述相同，制備了一系列紫杉醇白蛋白納米制劑。經激光粒徑儀測定發現較低的藥物濃度可生成直徑大約為160納米的顆粒，而較高濃度則生成較小的顆粒，直徑大約為120納米。當紫杉醇在人血清白蛋白溶液中的濃度為1毫克/毫升時，顆粒直徑為250納米左右；當紫杉醇在人血清白蛋白溶液中的濃度為2毫克/毫升時，顆粒直徑為180納米左右；當紫杉醇在人血清白蛋白溶液中的濃度為 5毫克/毫升時，顆粒直徑為130納米左右。實施例9常用輸液劑的配伍穩定性考察了紫杉醇白蛋白納米凍干制劑(按本發明實施例制備)與常用輸液劑(如， 5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水)的配伍穩定性，為臨床使用提供參考。一般而言，稀釋穩定性只需達到他即能滿足臨床應用，因此本實施例以粒徑、紫杉醇含量為指標評價其他內配伍穩定性。實驗結果表明，紫杉醇白蛋白納米凍干制劑以5 %葡萄糖或0. 9 %生理鹽水復溶后均可得到乳光均一的溶液，且如表2顯示，8h內各指標均無顯著變化。因此，臨床使用時 5%葡萄糖和0. 9%生理鹽水均可以作為紫杉醇白蛋白納米顆粒凍干制劑的復溶介質。表權利要求
1.一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟a.將難溶性藥物與水溶性載體材料制成含有難溶性藥物的水溶性載體固體分散體；b.將所得的固體分散體加入含蛋白質類物質的水性介質中，混合均勻，混合物經高剪切條件處理得到包裹了難溶性藥物的蛋白納米顆粒的混懸液；c.將混懸液進行干燥或先經過無菌過濾再干燥，按所需劑型制成包裹了難溶性藥物的蛋白納米顆粒的固體制劑、半固體制劑或氣體制劑；或者將步驟b得到混懸液直接作為液體制劑或進一步制備成其他類型的液體制劑、或將混懸液干燥或先經過無菌過濾再干燥后再復溶制成液體制劑。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述難溶性藥物指在每ml水中溶解度小于Img或1 μ 1的物質；優選藥理活性物質、診斷試劑或者營養物質中的一種或多種。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述藥理活性物質選自止痛藥、退燒藥、麻醉藥、平喘藥、抗生素、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗真菌藥、抗高血壓藥、抗炎藥、抗腫瘤藥、抗焦慮藥、免疫抑制劑、抗偏頭疼藥、鎮靜劑、安眠藥、抗心絞痛藥、抗精神病藥、抗躁狂藥、抗心律失常藥、抗關節炎藥、抗痛風藥、抗凝藥、溶栓藥、抗纖溶藥、血液流變學試劑、抗血小板藥、抗驚厥藥、抗帕金森藥、抗組胺藥、止癢藥、鈣調節藥、抗菌藥、抗病毒藥、抗感染藥、支氣管擴張藥、激素、降糖藥、降脂藥、核酸、促紅細胞生成藥、抗潰瘍、抗反流藥、止惡心藥/止吐藥、米托坦、更昔洛韋結氨酸酯、亞硝基脲鹽、蒽環類抗生素和玫瑰樹堿中的一種或多種；診斷試劑選自超聲造影試劑、放射造影試劑或磁造影試劑中的一種或多種；營養物質選自氨基酸、糖、蛋白質、碳水化合物、脂溶性維生素或脂肪中的一種或多種。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的抗腫瘤藥選自環磷酰胺、放線菌素、博來霉素、正定霉素、阿霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、卡鉬、卡氮芥、甲基-卡氮芥、順鉬、鬼白乙叉甙、干擾素、喜樹堿及其衍生物、苯芥膽留醇、紫杉醇及其衍生物、多烯紫杉醇及其衍生物、阿霉素及其衍生物、長春堿、長春新堿、三苯氧胺、哌酰硫烷；所述的免疫抑制藥選自環孢菌素、硫唑嘌呤、咪唑立賓或他克莫司；所述的抗病毒藥物選自Y-干擾素、疊氮胸苷、金剛烷胺；所述的抗真菌藥選自灰黃霉素，酮康唑，兩性霉素B，制霉素類，殺念菌素；所述的抗高血壓藥選自普萘洛爾、普羅帕酮、尼莫地平、烯丙氧心安、硝苯地平、利血平、帕吉林鹽酸鹽、脫甲氧利血平、二氮嗪、長壓定、蘿芙木堿、硝普鈉、緩脈靈、蛇根混合堿、甲磺酸酚妥拉明。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述水溶性載體材料選自下列物質中的一種或多種聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚乙烯氧化物、混合脂肪酸酯、甘露醇、尿素、海藻酸鈉、羥丙基纖維素鈉、聚丙烯酸樹脂、明膠、羧甲基纖維素鈉；所述蛋白質類物質是能夠通過巰基和/或二硫鍵交聯的下列物質天然存在或合成的蛋白質及其衍生物、合成的蛋白聚合物及其衍生物、天然的或合成的類蛋白及其衍生物，或是它們的混合物。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述天然存在的蛋白質包括白蛋白、 免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、 纖維蛋白原、脂肪酶；所述合成的蛋白聚合物選自含有游離巰基和/或二硫基修飾的下列物質中的一種或多種聚乙醇、聚乙基惡唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚二醇、聚乙交酯、聚己酸內酯或其共聚物、合成聚氨基酸。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述水性介質選自注射用水，純水，甘露醇溶液，磷酸鹽水溶液，右旋糖酐溶液，葡萄糖水溶液，氯化鈉水溶液，氨基酸溶液，維生素溶液，碳水化合物溶液，或它們的任意兩種或兩種以上的混合物。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于制備含有難溶性藥物的水溶性載體固體分散體的方法為熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法、溶劑-噴霧(冷凍)干燥法、研磨法、或雙螺旋擠壓法；且這些方法不引入任何有機溶劑或者任何除乙醇之外的其他有機溶劑；優選采用溶劑-熔融法；所述高剪切條件是指應用同時具備高壓和高切變力的設備，使混合物達到高效的混合、粉碎、分散及乳化目的；其中，高壓是指壓力范圍在5000至30000磅/ 英寸2，優選6000 25000磅/英寸2。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于該蛋白納米顆粒的平均粒徑為20 lOOOnm，優選為 20 200nm。
10.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于干燥方法采用冷凍干燥或噴霧干燥； 無菌過濾采用0. 22 μ m濾器過濾。
全文摘要
本發明屬于制藥領域，公開了一種包裹難溶性藥物的蛋白納米顆粒的制備方法。該方法先將難溶性藥物與水溶性載體材料制成含有難溶性藥物的水溶性載體固體分散體；再將所得的固體分散體加入含蛋白質類物質的水性介質中，混合均勻，混合物經高剪切條件處理得到包裹了難溶性藥物的蛋白納米顆粒的混懸液；然后進一步制成所需劑型。該方法不需要引入任何除乙醇之外的其他有機溶劑，甚至根本不需要引入有機溶劑，避免了有機溶劑在制劑中的殘留，大大提高臨床用藥的安全性，該方法工藝簡單、成本低、操作性強。
文檔編號A61K47/18GK102357076SQ20111029980
公開日2012年2月22日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者周建平, 崔蓓, 霍美蓉 申請人:中國藥科大學