專利名稱：醋酸艾塞那肽多囊脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，確切地說涉及一種醋酸艾塞那肽多囊脂質體及其制備方法。
背景技術：
Exendin-4是一種含有39個氨基酸的人胰高血糖素樣多肽-1 (Glucagon-Iike ρ印tide-Ι，GLP-I)類似物，分子量為4186. 6，其結構與GLP-I有53%的同源性，且其N-端不被二肽基肽酶-IV (Dip印tidyl ρ印tidaSe-IV，DPP-IV)分解，因此血漿半衰期(tl / 2)更長，穩定性更高，藥效作用更好(Arulmozhia DK, Portha B. GLP-1 based therapy for type 2 diabetes. Eur J Pharm Sci，2006，28 (1-2) :96-108. Nielsen LL, Young AA, Parkes DG.Pharmacology of exenatide(synthetic exendin-4):a potential therapeutic for improved glycemic control of type 2 diabetes. Regul Pept,2004, 117(2):77-88. Iltz JL, Baker DE,Setter SM, etal. Exenatide:an incretin mimetic for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Clin Ther，2006，28 (5) :652-665)。研究表明，Exendin—4 具有促進胰島素分泌，延遲胃排空、降低食欲，減少食物攝取，保護β細胞并刺激其增生等作用(Lovshin JA, Drucker DJ. Incretin-based therapies for type 2 dia 一 betes mellitus. Nat Rev Endocrinol, 2009, 5 (5) :262-269.)。美國 Eli Lilly 公司和 Amylin Pharmaceuticals公司在體外大量合成了 Exendin-4，并將其命名為Exenatide (醋酸艾塞那肽)。2005年4月，美國食品藥品管理局批準Exenatide(Byettats)在美國上市，用于使用二甲雙胍、磺脲類藥物不能理想控制血糖的II型糖尿病患者的治療(Kendall DM, Cuddihy RM, Bergenstal RM. Clinical application of incretin-based therapy:therapeutic potential, patient selection and clinical use. Am J Med, 2009, 122 (6) :S37-S50)。 但其需要每天皮下注射兩次，給病人帶來較大痛苦。因此，研制醋酸艾塞那肽的緩釋給藥系統具有顯著的社會意義和經濟價值。近年來，多囊脂質體(Multivesicular Liposomes, MVLs)因其獨特的結構而被廣泛用于各種藥物傳遞系統中。MVLs是采用貯庫泡沫技術(D^ofoam technology, Depo Foam )于1983年研制(英國Sky印harma PLC公司)成功的一種新型脂質體，主要用于運載親水性藥物(KIM S, TURKER MS, CHI ΕΥ, et al. Pi^paration of multivesicular liposomes [J], Biochim Biophys Acta, 1983， 728 (3) : 339-348; SANJAY KJ, RAJESH KJ, MANISH K, et al. Design and development of multivesicular liposomal depot delivery system for controlled systemic delivery of acyclovir sodium [J]· AAPS Pharmscitech, 2005，6(1) : E35-E41; ZHONG HJ, DENG YJ, WANG XM, et al. Multivesicular liposome formulation for the sustained delivery of breviscapine [J], Int J Pharm, 2005，301(1-2): 15-24; DAI CY, WANG BC, ZHAO HW, et al. Preparation and characterization of liposomes-in-alginate(LIA) for proteindelivery system[J], Colloids Surf B Biointerfaces, 2006, 47(2): 205-210 )。注射后，作為藥物貯庫隨時間釋放被包封的藥物(MM S. DepoFoam-mediated drug delivery into cerebrospinal fluid [J], Methods Neurosci, 1994，21(18) : 118—131·)。多囊脂質體注射途徑廣泛，可用于敏感部位的注射如眼部，硬膜外或關節腔等，人體研究表明安全性較高。另外，D印oi^oarn技術經證明可用于工業化大生產(PEPPER CP, HART0UNIAN Μ. cGMP manufacturing scale-up of a multivesicular lipid based drug delivery system [J], Pharm Eng, 1999，19(2) : 8-18.) 0經研究報道，多囊脂質體不同于傳統脂質體的同心囊結構，而具有不連續的藥物溶液囊泡，這些囊泡被連續的非同心類脂雙分子磷脂膜所分隔，具有更多的包封容積和較大粒徑，特別是當某個囊泡破裂時，活性物質從破裂的囊泡釋出，而完整的囊泡仍然可以保持原狀，因此具有很好的緩釋效果(KATRE NV, ASHERMAN J, SCHAEFER H, et al. Multivesicular liposome (DepoFoam) technology for the sustained deliver of insulin-like growth factor- I (IGF- I ) [J]· J Pharm Sci, 1998，87(11) : 1341-1346.)。更有研究證明，多囊脂質體通過調節脂質和水相的比例，選擇不同中性油脂的鏈長，調節內水相滲透壓等，經非靜脈注射后，緩釋效果可達到幾天甚至幾周。(SANKARAM M. A lipid based depot (DepoFoam technology) for sustained release drug delivery [J]· Prog Lipid Res, 2002, 41 (5): 392-406.)而以多囊脂質體作為藥物載體并不會引起藥物生物活性的降低及改變。現有技術中對于采用多囊脂質體作為藥物的緩釋載體已有報道，例如感覺神經肽P物質制成多囊脂質體(郭文治.P物質多囊脂質體的制備工藝優化及相關性質考察[ J ]中國藥房，2009，10 (20) 767-769)；酪絲亮肽制成多囊脂質體(陶斐.酪絲亮肽多囊脂質體的制備和體外釋放研究[J ]中國新藥雜志，2008，3(17) 2觀-232)；胸腺五肽緩釋制成的多囊脂質體(焦玉煥.胸腺五肽緩釋多囊脂質體的制備及大鼠藥物代謝動力學的初步研究[J ]藥學學報，2008，43(7) 756-760)。本發明創造性地將醋酸艾塞那肽制備成多囊脂質體以提高它的緩釋效果。經文獻檢索，目前尚未見有關通過制備醋酸艾塞那肽多囊脂質體以提高其緩釋效果的報道。
發明內容
現有技術中雖然已經報導了肽類可制成多囊脂質體以獲得顯著的緩釋特性，但是不同的肽類是否能制成多囊脂質體是難以預料的，并且獲得多囊脂質體的處方也需要創造性的勞動。針對醋酸艾塞那肽半衰期短，本發明提供一種醋酸艾塞那肽多囊脂質體及其制備方法，以延長其半衰期，提高緩釋效果。本發明的醋酸艾塞那肽多囊脂質體，所述磷脂包括大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂或合成磷脂，平均分子量為700 800，優選平均分子量為750的大豆卵磷脂。其中，醋酸艾塞那肽與磷脂的質量比為1 :0. 5 100，優選的質量比為1 :0. 5 10。本發明的醋酸艾塞那肽多囊脂質體，所述中性類脂包括三油酸甘油酯等中性類脂。
其中，醋酸艾塞那肽與中性類脂的質量比為1 :0. 05 10，優選的質量比為1 0. 05 1。本發明的醋酸艾塞那肽多囊脂質體，所述乳化劑包括吐溫-80、普朗尼克F68、聚氧乙烯蓖麻油、賣澤-52、賣澤-53、賣澤-59、Solutol HS15及含有上述乳化劑的各種比例的混合乳化劑，優選賣澤-52 =Solutol HS15 = 2 :3的混合乳化劑。其中，醋酸艾塞那肽與乳化劑的質量比為1 :0. 05 10，優選的質量比為1 0. 05 1。本發明進一步提供了一種制備醋酸艾塞那肽多囊脂質體的方法，包括以下步驟
(1)將用于形成脂質體的脂類物質和中性油脂溶于有機溶劑形成油相；
(2)將醋酸艾塞那肽溶于水中形成內水相；
(3)將油相和內水相混合并乳化形成初乳；
(4)將初乳與適當的水溶液混合并乳化形成復乳；
(5)將復乳中的溶媒除去形成醋酸艾塞那肽多囊脂質體。其中，步驟(1)所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙醚及含有上述溶劑的各種比例的混合溶劑；優選二氯甲烷乙醚=1 :1的混合溶劑。其中，步驟C3)所述的初乳中油相和內水相的體積比大于1 ；步驟(4)中所述復乳中初乳與外水相的體積比小于1。初乳中油相和內水相的優選體積比為1 :0. 8 ；復乳中初乳與外水相的優選體積比為1 :2. 5。其中，步驟(3)和步驟(4)所述的乳化方法包括攪拌、漩渦振蕩、剪切、乳勻、高壓乳勻、超聲的機械操作及上述操作分別結合的混合操作。步驟(3)優選剪切；步驟(4)優選漩渦振蕩。其中，步驟⑵和步驟(4)所述的水溶液中的滲透調節劑選自蔗糖、葡萄糖及二者各種比例的混合物，滲透調節劑與脂類物質的質量比大于1。步驟( 優選蔗糖，其與脂類物質的質量比為1 :1 3 ；步驟(4)優選葡萄糖，其與脂類物質的質量比為1 :0. 2 2。其中，步驟( 所述去除溶媒的方法包括攪拌揮發、氮氣吹除、旋轉蒸發法，優旋轉蒸發法。本發明以多囊脂質體為醋酸艾塞那肽藥物載體。多囊脂質體脂粒具有不連續的囊泡，粒徑大小一般在1 100 μ m之間，每個囊泡內部含有相連的水腔，腔外由脂薄膜包裹形成一個內部水腔遠大于脂腔的體積，其體積比甚至可以達到95 5,因此特別適合于包封水溶性的蛋白質多肽類藥物。同時，由于它水腔體積較傳統脂質體大，所以包封水溶性藥物時對其包封率有顯著性提高。同時，由于多囊脂質體的獨特的非同心囊泡結構，其中一個囊泡的破裂并不影響整個囊泡的完整性，因此制劑具有良好的穩定性，表現出藥物的釋放具有很好的緩釋效果， 提高了患者的順應性。本發明制備的醋酸艾塞那肽多囊脂質體，其粒徑范圍在1 50 μ m，平均粒徑在 1 15μπι，能夠用于非靜脈給藥，如皮下、肌內、關節內、硬膜內、眼內等途徑注射給藥。其制備方法具有操作簡單易行，輔料易得的特點。同時，醋酸艾塞那肽多囊脂質體單位體積中的醋酸艾塞那肽含量高，說明本發明的配方和工藝既能達到較高的包封率，又有穩定的載藥量。實驗證明醋酸艾塞那肽在多囊脂質體中的包封率能達到60% 100%，最佳為80% 100%。藥物在多囊脂質體中能持續釋放，體外釋放實驗表明其具有明顯的緩釋效果，延長了藥物在血液中的循環時間。以下通過實施例的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作出進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明的上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
將本發明實施例醋酸艾塞那肽多囊脂質體(實施例1，2和3)混懸液滴在載玻片上，于光學顯微鏡下觀察并照相(X400)，結果見圖1。實驗結果表明通過實施例1，2，3的方法，可成功制得大小較均勻，外觀較圓整，大脂質體內部含有較多緊實小囊泡的載藥多囊脂質體。將本發明制備的醋酸艾塞那肽多囊脂質體的進行體外釋放實驗，方法詳見實施例 5，釋放曲線結果見圖2。實驗結果表明制備的醋酸艾塞那肽多囊脂質體具有明顯的緩釋作用，132 h上的累積釋放率達到91. 53%。將釋放數據用不同的釋放模型進行擬合，最終確定其最佳擬合模型為零級釋放模型，方程為Y=O. 4978t+21. 226，(r2=0. 9769)。
具體實施例方式
實施例1
精確稱取大豆磷脂40mg、膽固醇20mg、大豆油5mg于5 mlEP管中，加入0. 5 ml氯仿 乙醚=1 1的混合有機溶劑使其完全溶解，形成油相；滴加溶有5mg醋酸艾塞那肽的含50 mmol L—1精氨酸的5%蔗糖溶液(內水相)，用Fluka液體乳化機內部剪切形成初乳；后取 0. 4ml初乳快速加入到1 ml含40 mmol L—1賴氨酸的3. 4%葡萄糖溶液(外水相)中，漩渦振蕩IOs形成復乳。將復乳轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去有機溶劑，即得醋酸艾塞那肽多囊脂質體混懸液。 實施例2
精確稱取蛋黃卵磷脂40mg、膽固醇20mg、大豆油5mg于5 mlEP管中，加入0. 5 ml氯仿乙醚=1 :1的混合有機溶劑使其完全溶解，形成油相；滴加溶有IOmg醋酸艾塞那肽的含 50 mmol L—1精氨酸的5%蔗糖溶液(內水相)，用Fluka液體乳化機內部剪切形成初乳；后取0. 4ml初乳快速加入到1 ml含40 mmol L—1賴氨酸的3. 4%葡萄糖溶液(外水相)中，漩渦振蕩IOs形成復乳。將復乳轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去有機溶劑，即得醋酸艾塞那肽多囊脂質體混懸液。 實施例3
精確稱取大豆磷脂40mg、膽固醇20mg、三油酸甘油酯8mg于5 mlEP管中，加入0. 5 ml 氯仿乙醚=1 :1的混合有機溶劑使其完全溶解，形成油相；滴加溶有20mg醋酸艾塞那肽的含50 mmol L—1精氨酸的5%蔗糖溶液(內水相)，用Fluka液體乳化機內部剪切形成初乳；
6后取0. 4ml初乳快速加入到1 ml含40 mmol L—1賴氨酸的3. 4%葡萄糖溶液(外水相)中， 漩渦振蕩IOs形成復乳。將復乳轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去有機溶劑，即得醋酸艾塞那肽多囊脂質體混懸液。
實施例4 測定包封率
運用生化方法測定樣品含量。精密吸取0. 25ml載藥多囊脂質體混懸液于EP管中，加入兩倍量生理鹽水稀釋后，于2500 r. HiirT1離心lOmin，取上清液進行生化測定其含量。生化測定步驟如下，每孔加入50ul標準肽液、陽性對照品或樣品，和25ul —抗，4°C過夜培養 16-24h,加25ul生物素標記多肽室溫(20-230C )孵育1. 5h，加入350ulX緩沖液，洗板4 次，加入lOOulSA-HRP溶液，室溫(20-23°C)孵育lh，每孔加入350ul X緩沖液，洗板4次， 每孔加入IOOul底物液，室溫(20-23°C)孵育15-20min，加入IOOul終止液測RFU吸收值， 計算結果。載藥多囊脂質體包封率計算公式為En (%) = (Dtot -Dfree)/DtotX 100
權利要求
1.一種醋酸艾塞那肽多囊脂質體，其特征在于由醋酸艾塞那肽、磷脂、中性類脂和非離子型表面活性劑制成。
2.如權利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體中，其中磷脂為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂或合成磷脂中的至少一種，平均分子量為700 800。
3.如權利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體，其特征是，醋酸艾塞那肽與磷脂的質量比為1 :0. 5 100。
4.如權利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體中的中性類脂包括大豆油，不飽和脂肪酸構成的甘油三酸酯。
5.如權利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體，其特征是，醋酸艾塞那肽與中性類脂的質量比為1 0. 05 10。
6.如權利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體中的乳化劑包括吐溫-80、普朗尼克 F68、聚氧乙烯蓖麻油、賣澤-52、賣澤-53、賣澤-59、Solutol HS15及含有上述乳化劑的各種比例的混合乳化劑。
7.如權利要求1所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體，其特征是，醋酸艾塞那肽與乳化劑的質量比為1 0. 05 10。
8.如權利要求1 7所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體的制備方法，包括下述順序的步驟 (1)將用于形成脂質體的脂類物質和中性油脂溶于有機溶劑形成油相；( 將醋酸艾塞那肽溶于水中形成內水相；C3)將油相和內水相混合并乳化形成初乳；(4)將初乳與適當的水溶液混合并乳化形成復乳；( 將復乳中的溶媒除去形成醋酸艾塞那肽多囊脂質體。
9.如權利要求8所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體的制備方法，其特征是，步驟(1)所述有機溶劑指氯仿、二氯甲烷、乙醚及含有上述溶劑的各種比例的混合溶劑。
10.如權利要求8所述醋酸艾塞那肽多囊脂質體的制備方法，其特征是，步驟(3)和步驟(4)所述的乳化方法包括攪拌、振蕩、剪切、乳勻、高壓乳勻、超聲的機械操作及上述操作分別結合的混合操作。
全文摘要
本發明公開一種醋酸艾塞那肽多囊脂質體。該制劑以醋酸艾塞那肽為有效成分，并由磷脂、中性類脂、乳化劑組成。其中醋酸艾塞那肽與磷脂質量比為10.5～100，與中性類脂質量比為10.05～10，與乳化劑質量比為10.05～10。本發明還公開了該醋酸艾塞那肽多囊脂質體的制備方法，利用本方法制備的醋酸艾塞那肽多囊脂質體可有效延長醋酸艾塞那肽半衰期，增加其緩釋作用。
文檔編號A61P3/10GK102309453SQ201110289278
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者張志榮, 陳麗宇, 龔濤 申請人:四川大學