專利名稱：二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及二甲雙胍的新用途，具體地說，是二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。
背景技術：
淋巴瘤是一種起源于淋巴結或結外淋巴組織的惡性腫瘤。隨著環境污染的加重、 生活節奏的加快及人口老齡化，淋巴瘤的發病率越來越高，并且呈現年輕化趨勢。據世界衛生組織統計，惡性淋巴瘤發病率年增長率為7. 5%，是目前發病率增長最快的惡性腫瘤之一。全球每年約有35萬新發病例，死亡人數超過20萬。我國惡性淋巴瘤發病率為0.02%。， 每年新增病例2. 5萬人，死亡2萬人，呈上升趨勢。惡性淋巴瘤的發病年齡以兒童和青壯年最為多見，是兒童最常見的惡性腫瘤之一。死于淋巴瘤的患者平均年齡為49. 9歲，明顯低于所有惡性腫瘤平均死亡年齡58. 2歲。惡性淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤 (Non-Hodgkin Lymphoma, NHL)兩類，其中，以NHL為主，大約占到80_90%。NHL常常采用聯合化療、放療、免疫靶向治療及骨髓移植等綜合治療方案。CHOP方案一直是NHL治療的標準方案，雖然對60% 70%患者有效，但是仍有30%-40%的淋巴瘤患者對治療無效或治療后迅速復發，疾病進展快，預后差。因此尋找新的治療方法就顯得猶為重要，尤其是特異性靶向淋巴瘤細胞生存相關的信號傳導途徑藥物的研究已成為目前淋巴瘤研究的熱點。AMPK是一個主要的細胞能量感應器，近來研究發現AMPK是mTOR上游信號分子，成為新陳代謝和腫瘤相互關系中的一個關鍵的因子。AMH(是一異源三聚體，包括α催化亞單位和β、Y調節亞單位。在人類各有2到3個不同的基因編碼各亞單位(α 1，α 2，β 1， β 2, γ 1, γ2, Y 3)，因此有12種可能的組合。AMPK是一個能量感應器，處于非激活狀態。 當細胞內能量耗竭，ΑΜΡ/ΑΤΡ比例升高時，ΑΜΡΚ172位蘇氨酸殘基被上游激酶磷酸化而激活。比如葡萄糖缺乏、缺氧、氧化應激、高滲、組織缺血、肌肉收縮等情況下ATP消耗，AMP上升，激活AMPK。ΑΜΗ(—旦被激活，即通過增加葡萄糖攝取、糖酵解、脂肪酸氧化等分解代謝過程，減少脂肪酸、膽固醇、蛋白質合成等ATP消耗過程而恢復細胞內能量水平。當細胞內存在足夠的能量資源，細胞才進行有絲分裂，因此ΑΜΗ(可以作為一個理想的能量監視器。二甲雙胍是一個雙胍類抗糖尿病藥物，用于臨床已有50年歷史。流行病學資料顯示使用二甲雙胍的糖尿病的患者癌癥的發生率低，如乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌等，這一現象促進了大家對AMPK/mTOR途徑的認識。研究發現服用二甲雙胍的糖尿病患者與服用磺脲類降糖藥的糖尿病患者相比，癌癥的發生率降低23%。在另一個研究中，10309 個糖尿病患者分2組，一組用二甲雙胍，另一組用磺脲類藥物，后一組腫瘤相關死亡率明顯高于二甲雙胍組。研究資料顯示，二甲雙胍對這些瘤細胞有顯著的抑制作用。最新的臨床資料表明，患有糖尿病的乳腺癌患者接受化療及二甲雙胍聯合用藥有一個更高的病理學完全緩解率。二甲雙胍通過提高肝和肌肉對胰島素敏感性而控制血糖。二甲雙胍通過胰島素受體增強其信號，減少糖尿病患者胰島素耐受，成為胰島素增敏器。二甲雙胍也通過抑制肝糖異生而降低胰島素水平。另外，肥胖、胰島素耐受、高胰島素血癥及其相關的雄激素增多癥參與乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌等惡性腫瘤的起動，這與二甲雙胍使用者癌癥低發生率相符合。在分子水平，二甲雙胍通過激活AMPK，AMPK調節下游控制細胞增殖的信號通路。 在上皮細胞二甲雙胍活化AMPK，抑制mTOR活性，進而抑制mRNA翻譯，蛋白合成及細胞增殖。 但是關于二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用目前還未見報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。本發明的再一的目的是，提供一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物。本發明的另一的目的是，提供一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物的應用。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。淋巴瘤細胞為2-8X IO5個細胞/毫升時，二甲雙胍的使用量為10_20mM。二甲雙胍在制備治療Burkitt’ s淋巴瘤藥物中的應用。二甲雙胍在制備治療彌漫大B細胞淋巴瘤藥物中的應用。二甲雙胍在制備治療T細胞急性淋巴母細胞白血病藥物中的應用。二甲雙胍在制備治療耐6巰基嘌呤的T細胞急性淋巴母細胞白血病藥物中的應用。二甲雙胍在制備治療皮膚T細胞淋巴瘤藥物中的應用。二甲雙胍在制備治療Kappas間變大細胞淋巴瘤藥物中的應用。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由二甲雙胍和阿霉素組成。所述的二甲雙胍和阿霉素的比例為1. 25-20 mM: 6. 25_50ng/ml。一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由二甲雙胍和地塞米松組成。所述的二甲雙胍和地塞米松的比例為1.25-20 mM: 1-1000 nM。一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由二甲雙胍和mTOR 抑制劑iTemsirolimus組成。所述的二甲雙胍和Temsirolimus 的比例為 1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是所述的組合藥物在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。所述的組合藥物在制備治療Burkitt淋巴瘤、或彌漫大B細胞淋巴瘤、或T細胞急性淋巴母細胞白血病、或皮膚T細胞淋巴瘤藥物中的應用。本發明優點在于
1、通過使用本發明的藥物，可以抑制惡性淋巴瘤細胞生長增殖，使淋巴瘤細胞株周期阻滯，上調P21，調節AMPK/mTOR信號傳導通路；
2、本發明開拓了傳統降糖藥物二甲雙胍的新用途，二甲雙胍費用低，安全，耐受性好， 易被患者接受，抑制淋巴瘤細胞生長增殖，并且提高淋巴瘤細胞對化療藥物阿霉素和mTOR 抑制劑Temsirolimus的敏感性，為淋巴瘤的治療提供了新的策略。
圖IA =MTT實驗中二甲雙胍處理各種淋巴瘤細胞株(SU-DHL-4、Namalwa, DB、 SU-DHL-5、Daudi、Jurkat、6-TCEM、Kappas、H9、Hut78 ) IC50 結果。圖IB 不同濃度二甲雙胍處理Daudi、SU-DHL_4、Hut78和Jurkat細胞株72小時。 顯示二甲雙胍對4個細胞株都存在增殖抑制作用，且存在劑量依賴性。圖 IC :10mM 二甲雙胍處理 Daudi、SU-DHL_4、Hut78 和 Jurkat 細胞株 24、48、72 小時。顯示二甲雙胍對4個細胞株的增殖抑制作用存在時間依賴性。圖2A 流式細胞分析顯示，IOmM 二甲雙胍處理細胞36小時后，4個細胞株都引起 G0/G1 期阻滯。ClGO/Gl 期，S 期， ■ G2/M 期。圖2B :10mM二甲雙胍處理細胞24、36及48小時后。免疫印跡結果顯示，二甲雙胍上調P21，但不影響P27、P53和CyclinDl。圖3A :10mM 二甲雙胍處理細胞24、36及48小時。免疫印跡結果顯示，二甲雙胍上調 p-AMPK,導致下游 p-mTOR、p_P70S6K、ρ_4Ε_ΒΡ1 水平降低。圖3B IOmM 二甲雙胍處理Jurkat細胞24、36及48小時。AKT和P-AKT無明顯變化。圖3C 二甲雙胍對AKT過表達的Jurkat細胞抗增殖效應和Jurkat細胞類似。圖3D 二甲雙胍和AKT特異性抑制劑MERCK124005共同作用于Jurkat細胞，二甲雙胍的抗增殖效應未受影響。圖4A 二甲雙胍提高B淋巴瘤細胞Daudi、SU-DHL_4對化療藥物阿霉素、地塞米松和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性。圖4B 二甲雙胍提高T淋巴瘤細胞Hut78和Jurkat對化療藥物阿霉素、地塞米松和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性。圖 5A =AMPK siRNA 轉染 Jurkat 細胞，AMPK siRNA Jurkat 細胞 AMPK 表達下調。圖 5B =AMPK siRNA Jurkat 細胞與 Con siRNA Jurkat 細胞相比，P21 的誘導上升和mTOR的抑制效應也被削弱。圖5C:Con siRNA Jurkat 細胞存在G0/G1 期周期阻滯效應，而 AMPK siRNA Jurkat 細胞G0/G1期周期阻滯效應被取消。圖5D =AMPK siRNA Jurkat細胞二甲雙胍的抑制作用被減弱，同時，也削弱了二甲雙胍對阿霉素和Temsirolimus增敏作用。圖6A:10 mM二甲雙胍應用48小時后原代白血病/淋巴瘤細胞生長抑制為33. 5%。圖6B 不同劑量二甲雙胍應用48小時對造血干細胞的影響。圖6C 腹腔注射二甲雙胍抑制小鼠Daudi移植瘤生長，分小劑量組(2 mg/kg)和大劑量組(4 mg/kg)。
圖6D 腹腔注射二甲雙胍抑制小鼠Jurkat移植瘤生長，分小劑量組(2 mg/kg)和大劑量組(4 mg/kg)。圖6E 二甲雙胍治療組Daudi細胞P21表達明顯上調。圖6F 二甲雙胍治療組Jurkat細胞P21表達明顯上調。圖6G 二甲雙胍聯合阿霉素治療Daudi組，明顯抑制小鼠移植瘤生長。圖6H 二甲雙胍聯合阿霉素治療Jurkat組，明顯抑制小鼠移植瘤生長。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。 實施例一、實驗方法
(一)試劑
二甲雙胍購自Sigma公司，用PBS溶解。MTT，碘化丙啶(PI)，蛋白酶抑制劑，抗GAPDH 抗體購自Sigma公司。P21、P27、cyclin Dl抗體，辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠二抗， 羊抗兔二抗和鼠抗羊二抗均購自Santa Cruz公司。P53、AMPK、P-AMPK、mTOR、p-mTOR、 P70S6K、p-P70S6K、4EBP-l、p-4EBP_l、AKT、p-AKT，購自 Cell Signaling 公司。AKT 抑制劑 MERCK124005 購自 Merck 公司。( 二 )細胞培養
本研究應用了以下幾種人淋巴瘤細胞株Burkitt’ s淋巴瘤細胞株Namalwa、Daudi，該病即Burkitt淋巴瘤(BL)；彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株SU-DHL-4、SU-DHL-5、DB, T細胞急性淋巴母細胞白血病細胞株Jurkat，耐6巰基嘌呤的T細胞急性淋巴母細胞白血病細胞株 6T-CEM，皮膚T細胞淋巴瘤細胞株Hut78和H9，Kappas間變大細胞淋巴瘤。所有細胞株均購自美國ATCC，均用含10%熱滅活胎牛血清(Hyclone or Gibco)的RPMI1640培養液培養， 置于37°C、95%空氣、5%C02濕度培養箱中培養。隔日換液，調整細胞濃度為3-5X105/ml。 用臺盼藍計數計算細胞存活率。瑞氏染色法觀察細胞形態學改變。(三)MTT 實驗
檢測不同濃度的二甲雙胍對各淋巴瘤細胞株的增殖抑制作用，計算半數生長抑制濃度 (IC50)o各淋巴瘤細胞株，以每孔20000個細胞接種于96孔板中，分別用終濃度為1、10、20 和40mM的二甲雙胍處理細胞。72小時后，向每孔中加入0. Img MTT, 37°C孵育4小時，在分光光度計490nm處檢測標本吸光度值。每個藥物濃度設3復孔，并重復3次實驗。(四)流式細胞儀檢測細胞周期
收集1-2 X IO6細胞，PBS洗滌，_20°C下75%乙醇固定過夜。檢測前加50mg/L的RNA酶 37°C孵育30分鐘，50mg/L的PI染色，流式細胞儀檢測。(五)免疫印跡分析
收集各處理組細胞 6X106，用 100μ1 RIPA 裂解液(50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl，0. 1% SDS, 1% Nonidet P-40,0. 5% Na-deoxycholate)，加入終濃度各為 ImM 的 PMSF、 NaF、Na3VO4和lPg/ml cocktail蛋白酶抑制劑置于冰上，裂解30分鐘，12000rpm離心20 分鐘后，收集上清即為總蛋白；再加入1/5體積的6XLoading Buffer (0. 35mM Tris-HClpH6. 8,10% SDS, 5% β -mercaptoethanol, 36% glycerol, 0. 012% Bromophenol Blue)煮沸 10分鐘，分裝-80°C凍存。取蛋白在含SDS的89Γ15%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，然后轉移至 PVDF膜上；PVDF膜用 TBS(20mM Tris-Hcl PH7. 4,150mM NaCl)配制的 5%脫脂牛奶室溫封閉1小時，之后與一抗在4°C孵育過夜。經TBS-T(20mM Tris-Hcl PH7. 4,150mM NaCl, 0. 1% Tween20)漂洗3次，每次10分鐘后，在搖床上與辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育 1 小時。再用 TBS-T 漂洗 3 次 X 10 分鐘。用 Chemiluminescent Western Detection System (Cell Signaling Technology，USA)進行化學發光顯影，X光片記錄影像。GAPDH作為內參調整不同樣品的上樣量。條帶的信號強度用Quantity One version 4. 4.0 software軟件分析。(六)免疫組化染色
用superfrost玻璃片撈片，60°C烘烤30分鐘后，在Vatana半自動免疫組化儀上進行抗原修復及染色。(七)AMPKsiRNA轉染淋巴瘤細胞
(1)取Jurkat細胞2 X 106，離心后棄上清，盡可能吸棄上清。(2)配轉染液solution ν 82μ1 + supplement 1 18μ1 + 質粒。(3)用轉染液重懸細胞，轉入電轉杯，加蓋。(4)電轉，選擇程序X-001。(5)取出電轉杯后，加500μ1預熱培養基后，小心轉入12孔板，終體積^iil。(6) 24小時后加嘌呤霉素，篩選濃度ml, 10-14天后濃度減半維持。(A)建立Daudi，Jurkat細胞淋巴瘤小鼠模型
雌性裸鼠(5-6周)購自上海實驗動物中心，在無菌條件下飼養。注射Daudi細胞的裸鼠接種M小時前進行300c Gy照射。每只小鼠右側肩部皮下注射l*107Daudi細胞， 4*107Jurkat細胞，3周左右在注射部位可及可測量的腫瘤，開始注射藥物治療。小鼠隨機分組，一組為對照組，對照組注射相同量的PBS，二甲雙胍腹腔注射治療組分二組，小劑量組 (2 mg/kg)和大劑量組(4 mg/kg)，每日一次；連續治療21天。二甲雙胍聯合阿霉素組分四組對照組，阿霉素組，二甲雙胍口服治療組，二甲雙胍聯合阿霉素組。對照組注射相同量的 PBS ；阿霉素組ang/kg，每周二次，連續二周；二甲雙胍口服治療組，口服:3mg/kg，二甲雙胍聯合阿霉素組，二甲雙胍口服:3mg/kg和阿霉素ang/kg，每周二次，連續二周。每組6只小鼠，每2天記錄小鼠腫瘤的長徑(a)和短徑(b)。第35天處死小鼠，取出腫瘤分3部分，一部分做電鏡，一部分瞬時冰凍-80°C保存，另一部分中性甲醛固定，石蠟包埋。(九)統計分析
實驗結果采用三次獨立實驗的平均值和標準差表示，用t檢驗比較差異。P值小于0. 05 認為有統計學差異。所有統計采用SPSS16.0軟件。二、實驗結果
(一)二甲雙胍抑制淋巴瘤細胞株生長
用MTT法檢測二甲雙胍對人淋巴瘤細胞株生長的影響。二甲雙胍對所有細胞株的半數生長抑制濃度(IC5tl)在8. 5 21. 2mM之間(圖1A)。不同濃度的二甲雙胍對所有被檢測的細胞株均有生長抑制作用。Daudi細胞顯示對二甲雙胍的抑制作用最敏感，其余B細胞如 Namalwa、SU-DHL-5，DB 和 T 細胞如 Jurkat、6T_CEM、Kappas、Hut78 和 H9 的 IC5tl 介于 15 20mM之間。SU-DHL-4和Jurkat對二甲雙胍相對不敏感。圖IB為Daudi, SU-DHL-4和Hut78、 Jurkat的劑量效應曲線。圖IC為4個細胞株的時間效應曲線，表明二甲雙胍對淋巴瘤細胞株生長抑制作用存在劑量和時間依賴性。淋巴瘤細胞2-8X IO5個細胞/毫升時，二甲雙胍的使用量為10-20mM。(二)二甲雙胍對人類淋巴瘤細胞株有周期阻滯
我們用IOmM 二甲雙胍分別處理Daudi、SU-DHL-4、Hut78和Jurkat 4個細胞株，36小時后檢測細胞周期(圖2A)。結果顯示，對照組Daudi和SU-DHL-4的G0/G1期的比例分別為 32. 6%士 1. 0%、33. 5%士4. 6%, 二甲雙胍(IOmM)治療組分別為 54. 6%士2. 3%,47. 8%士 1%。 兩組相比均有顯著統計學意義(P < 0. 001 ；P < 0.01)。T細胞淋巴瘤/白血病細胞株 Hut78 和 Jurkat 也有相似的結果。(45. 9%士5. 9%,62. 3%士9. 5%, P < 0. 05 ；44. 5%士 1. 9%, 51. 2%士 1. 1%，P < 0. 01)。(三)二甲雙胍上調P21，但不影響P27、P53和CyclinDl
細胞周期由周期蛋白如CyclinDl，周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21，P27及抑癌蛋白P53 (圖2B)。P21蛋白在腫瘤細胞中幾乎不表達或弱表達，經二甲雙胍處理后，其表達水平隨處理時間的延長而顯著升高。這說明二甲雙胍通過P21上調阻滯腫瘤細胞進入細胞周期，抑制腫瘤細胞的增殖和生存。已有研究表明，P27在許多人類腫瘤中是低表達甚至檢測不到其活性。在淋巴瘤細胞株，我們檢測到P27的表達。但用二甲雙胍處理細胞后，未檢測到P27的顯著上調，說明二甲雙胍并不通過P27這條信號通路來發揮作用。抑癌蛋白 P53負調節細胞周期，我們發現P53在Daudi和SU-DHL-4兩個B淋巴瘤細胞株中高表達， 而在Hut78和Jurkat兩個T淋巴瘤細胞株中弱表達，當用二甲雙胍處理細胞后，P53未有明顯變化。D型的周期蛋白在Gl期特別重要，有三種D型周期蛋白(Dl、D2、D3)，CyclinDl 在調節所有類型細胞的Gl期中起核心作用。在細胞Gl期，有絲分裂信號如生長因子，激活 CyclinDl基因的轉錄，增加了 CyclinDl-⑶K4/6復合物的濃度，促進細胞通過調控點，進入下一個調控節點。但是二甲雙胍對CyclinDl未有明顯的影響。因此二甲雙胍能使4個細胞株的P21明顯上調，而CyclinDl，P27，P53不變。二甲雙胍所致的腫瘤細胞生長抑制是由于P21上調阻滯細胞周期引起的。(四)二甲雙胍上調AMPK活性
在乳腺癌，結腸癌，前列腺癌，胰腺癌，二甲雙胍通過激活AMPK發揮抗腫瘤活性。因此我們推測二甲雙胍的抗淋巴瘤增殖活性涉及的是相同的信號通路。免疫印跡分析顯示，二甲雙胍能刺激AMPK磷酸化，并明顯地下調下游的效應分子mTOR，P70S6K, 4E-BP1的磷酸化 (圖3A)。以上結果表明，二甲雙胍通過活化AMI3K來干擾淋巴瘤細胞生長。mTOR的抑制可能會促發負反饋調節，導致AKT信號的活化。而AKT是細胞內重要的促存活分子。若負反饋激活AKT會削弱二甲雙胍的抗腫瘤效應。然而我們發現二甲雙胍未引起總AKT和P-AKT的增加(圖;3B)。同時二甲雙胍對AKT過表達的Jurkat細胞抗增殖效應和Jurkat細胞類似(圖3C)。而且二甲雙胍和AKT特異性抑制劑MERCK124005共同作用于Jurkat細胞，二甲雙胍的抗增殖效應未受影響(圖3D)。以上資料表明二甲雙胍未引起 AKT信號的活化。(五)二甲雙胍提高淋巴瘤細胞對化療藥物和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性二甲雙胍聯合化療藥物如阿霉素、地塞米松及mTOR抑制劑"Temsirol imus處理Daudi、SU-DHL-4、Hut78和Jurkat 4個細胞株，72小時后通過MTT檢測細胞生長抑制率。結果顯示二甲雙胍顯著增加這些藥物對淋巴瘤的細胞毒作用，即使在一個相對小的濃度1. 25mM 時也能發揮作用。因此二甲雙胍能提高化療藥物的敏感性(圖4A、B)。二甲雙胍與阿霉素作為具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物時，二甲雙胍和阿霉素的比例為1. 25-20 mM: 6. 25-50ng/ml ；二甲雙胍與地塞米松作為具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物時，二甲雙胍和地塞米松的比例為1.25-20 mM: 1-1000 nM ； 二甲雙胍與Temsirolimus作為具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物時，二甲雙胍和 Temsirolimus 的比例為1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。為了檢測二甲雙胍的抗增殖效應是否為AMPK依賴的，我們使用了 AMPK小干擾RNA 轉染Jurkat細胞。圖5A顯示AMPK siRNA Jurkat細胞與Con siRNA Jurkat細胞相比， AMPK的表達下調。圖5B顯示P21的誘導上升和mTOR的抑制效應也被削弱了。同時二甲雙胍處理AMPK siRNA Jurkat細胞，G0/G1期周期阻滯效應也被取消(圖5C)。Jurkat細胞 AMPK- α亞單位下調后，部分抵消了二甲雙胍對Jurkat細胞的抑制作用。同時也削弱了二甲雙胍對阿霉素和Temsirolimus增敏作用(圖5D)。因此二甲雙胍對淋巴瘤的的抗增殖效應為AMPK依賴性。(六)二甲雙胍對患者原代細胞的作用
為了進一步確定二甲雙胍對原代細胞的作用，我們收集了 3例T-細胞白血病/淋巴瘤患者的骨髓標本。MTT結果顯示，IOmM 二甲雙胍應用48小時后腫瘤細胞生長抑制為33. 5% (圖6A)。另外，我們也觀察了二甲雙胍對正常人造血干細胞的影響，結果發現二甲雙胍應用 48小時后，對從外周血分離的⑶34+造血干細胞沒有明顯生長抑制作用(圖6B)。(七)二甲雙胍抑制移植小鼠中腫瘤生長
我們通過小鼠移植瘤模型研究了二甲雙胍在體內的抗白血病/淋巴瘤活性。在所用的四種細胞株中，接種Daudi和Jurkat細胞后，裸鼠接種部位出現瘤塊，并且，所有裸鼠在皮下接種細胞觀天后，接種部位都出現了瘤塊。二甲雙胍腹腔注射治療組，小劑量組(2 mg/ kg)和大劑量組(4 mg/kg)裸鼠的瘤體積明顯小于對照組裸鼠的瘤體積(圖6C、D)。為了進一步證實體外P21在細胞周期阻滯中的作用，我們通過免疫組化方法檢測了瘤組織切片中P21表達情況，結果顯示治療組腫瘤細胞P21表達明顯高于對照組(圖6E、 F)。體外試驗中，二甲雙胍增加阿霉素的化療敏感性，在小鼠移植瘤模型中，我們進一步驗證了該結果。二甲雙胍聯合阿霉素治療組裸鼠的瘤體積明顯小于對照組及單一藥物治療組裸鼠的瘤體積，進一步在體內證實了二甲雙胍的增敏作用(圖6G、H)。三、討論
本發明顯示，二甲雙胍在體內和體外實驗中對淋巴瘤細胞有抑制作用。首次把二甲雙胍用于淋巴細胞惡性腫瘤的治療。二甲雙胍通過上調P21，細胞周期阻滯于G0/G1期而抑制淋巴瘤細胞生長。文獻也有類似報道，Zhuang等研究顯示，二甲雙胍上調乳腺癌細胞P21 致細胞周期阻滯。除了淋巴瘤細胞株，二甲雙胍還抑制原代T-白血病/淋巴瘤細胞的增殖， 對從外周血分離的⑶34+造血干細胞沒有明顯毒性，保證了二甲雙胍臨床使用的安全性。 而且二甲雙胍顯著抑制小鼠移植瘤的生長，沒有明顯的全身毒性。這預示著二甲雙胍有可能成為治療腫瘤的一個老藥新用的例子。本發明探討了二甲雙胍對細胞周期的影響。本發明發現二甲雙胍可導致G0/G1期阻滯，這個結果與其它文獻報道一致。本發明進一步探討了對細胞周期相關蛋白的影響。細胞周期由周期蛋白如CyclinDl，周期蛋白依賴性蛋白激酶(⑶K)及⑶K抑制劑(CKI)P21， P27等。周期蛋白和相應的蛋白激酶形成復合物，蛋白激酶獲得活性，推動細胞周期不斷運行。而CKI能抑制大多數CDK的激酶活性。既往研究顯示在乳腺癌細胞中二甲雙胍下調 CyclinDl，導致細胞周期阻滯，并且周期阻滯效應依賴P21和P27的存在。在胰腺癌細胞中， 二甲雙胍下調CyclinDl，上調P27致細胞周期阻滯。本發明的研究發現對于淋巴瘤細胞二甲雙胍上調P21，從而阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞增值和生存，但CyclinDl、P27、P53未見明顯變化。在細胞有絲分裂期，AMPK是一個重要的參與者。AMPK是mTOR上游信號分子，具有腫瘤抑制活性，成為新陳代謝和腫瘤相互關系中的一個關鍵的因子二甲雙胍活化能量感受器AMPK，抑制腫瘤細胞生長。本發明研究顯示二甲雙胍激活AMPK而抑制下游的mTOR信號。既往研究顯示在乳腺癌細胞中AMH(上調P21和P53導致細胞周期阻滯。本發明的研究發現對于淋巴瘤細胞二甲雙胍上調P21，但P53未見明顯變化。本發明用AMPK-α si RNA 下調AMPK來進一步研究AMPK的作用。本發明發現，不僅二甲雙胍的G0/G1期周期阻滯效應被削弱，而且對淋巴瘤細胞的抑制作用和對阿霉素和Temsirolimus增敏作用也被削弱。 說明二甲雙胍對淋巴瘤的的抗增殖效應為AMH(依賴性。實際上，AMPKa催化亞單位的活化形式和細胞中間體和中心體的有絲分裂調節因子相互作用協調細胞有絲分裂時基因分開的基本生理過程，而這也與AMPK的腫瘤抑制活性有著直接的關系。mTOR信號控制mRNA翻譯和蛋白合成，在淋巴瘤細胞中持續活化。二甲雙胍不僅能調節細胞周期，它還調節mTOR信號通路。本發明的結果也顯示，二甲雙胍以AMPK依賴的方式抑制mTOR信號，從而抑制淋巴瘤細胞生長。mTORCl特異性抑制劑雷帕霉素及其衍生物CCI779已經作為抗腫瘤藥物應用于臨床試驗。但是臨床試驗表明這兩種化合物的抗腫瘤效應有限。比如在急性髓系白血病AML或與化療藥物聯合使用時抗腫瘤效應有限。其原因有AKT反饋性地激活和P-4EBP1持續高表達。而二甲雙胍未導致AKT反饋性地激活，且能顯著下調P-4EBP1。而且二甲雙胍與mTOR抑制劑CCI779有協同效應，更加提示二甲雙胍在淋巴瘤治療中的有效性。二甲雙胍能增加化療藥物的抗腫瘤效應。二甲雙胍抑制耐藥的卵巢癌細胞的增殖，P21上調，細胞周期阻滯，P-mT0R降低。回顧性分析顯示把二甲雙胍作為乳腺癌一個新的輔助治療可以提高病人病理學完全緩解率。本發明研究顯示小劑量二甲雙胍和化療藥物有協同效應。體內，二甲雙胍顯著加強阿霉素的療效。這些結果表明有必要在以后的臨床試驗中進一步評估二甲雙胍的抗腫瘤效應。總之，淋巴瘤存在mTOR信號通路的失調，故靶向AMPK的治療提供了一個機會。二甲雙胍便宜，安全，耐受性好，為淋巴瘤的治療提供新的策略。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，淋巴瘤細胞為2-8X IO5個細胞/毫升時， 二甲雙胍的使用量為10-20mM。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療Burkitt’s淋巴瘤藥物中的應用。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療彌漫大B細胞淋巴瘤藥物中的應用。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療T細胞急性淋巴母細胞白血病藥物中的應用。
6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療耐6巰基嘌呤的T細胞急性淋巴母細胞白血病藥物中的應用。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療皮膚T細胞淋巴瘤藥物中的應用。
8.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療Kappas間變大細胞淋巴瘤藥物中的應用。
9.一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由二甲雙胍和阿霉素組成。
10.根據權利要求9所述的組合藥物，其特征在于，所述的二甲雙胍和阿霉素的比例為 1.25-20 mM: 6.25-50ng/mlo
11.一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由二甲雙胍和地塞米松組成。
12.根據權利要求11所述的組合藥物，其特征在于，所述的二甲雙胍和地塞米松的比例為 1. 25-20 mM: 1-1000 nM。
13.一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由二甲雙胍和mTOR抑制劑Temsirolimus組成。
14.根據權利要求13所述的組合藥物，其特征在于，所述的二甲雙胍和Temsirolimus 的比例為 1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。
15.根據權利要求9-14任一所述的組合藥物在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。
16.根據權利要求12所述的應用，其特征在于，所述的組合藥物在制備治療Burkitt’s 淋巴瘤、或彌漫大B細胞淋巴瘤、或T細胞急性淋巴母細胞白血病、或皮膚T細胞淋巴瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應用。本發明還提供一種具有協同作用的治療淋巴瘤的組合藥物及其應用。本發明優點在于通過使用本發明的藥物，可以抑制惡性淋巴瘤細胞生長增殖，使淋巴瘤細胞株周期阻滯，上調P21，調節AMPK/mTOR信號傳導通路；本發明開拓了傳統降糖藥物二甲雙胍的新用途，二甲雙胍費用低，安全，耐受性好，易被患者接受，抑制淋巴瘤細胞生長增殖，并且提高淋巴瘤細胞對化療藥物阿霉素和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性，為淋巴瘤的治療提供了新的策略。
文檔編號A61K31/704GK102327256SQ201110282718
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者施文瑜, 王黎, 肖丹, 趙維蒞 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院