專利名稱：一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法
技術領域：
本發明屬于天然產物有效成分的分離純化領域，具體的講是涉及一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法。
背景技術：
葛根別名鹿藿、雞齊，為野葛或粉葛的干燥根，是常用的中藥材，歷代以來本草均有記載，味甘、辛、性平，具有解肌退熱、生津、透疹、溫陽止瀉、提高機體免疫力等功能。目前，葛根廣泛用于改善心腦血管。治療腹瀉、糖尿病等重要復方制劑中，用量極大，是制劑的重要成分。《中華人民共和國藥典》和《衛生部藥品標準》中收錄大約有140余種葛根復方制劑，其中主要有葛根片劑、針劑等。實際上葛根主要有效成分為葛根總黃酮，尤其野葛含葛根總黃酮較多，主要作為葛根制劑、藥品、保健品等的原料。黃酮類化合物具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗過敏、抗輻射、抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗突變、以及增強免疫能力等廣泛的生理活性。能防治心腦血管系統的疾病和呼吸系統的疾病等，如對治療冠心病、 心絞痛、高血壓等有顯著效果，對防治心肌梗塞、心肌缺血，心律失常等也起重要療效。葛根黃酮廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等工業中，且因其毒性較低及顯著獨特的生物活性，還被應用到保健食品方面，即用作食品、化妝品的天然添加劑，如食用色素、甜味劑、抗氧化劑等。葛根多糖由于獨特的生理活性也備受人們青睞。葛根中含有的黃酮類化合物多以糖苷的形式存在，一般提取時多采用水、甲醇、乙醇溶液做提取溶劑，用正丁醇做萃取劑。另據報道，有人采用大孔吸附樹脂的方法提取分離黃酮類化合物，采用正丁醇萃取，使用的溶劑毒性較大，而且需重復三次，操作繁瑣；采用大孔吸附樹脂，前處理方法復雜，而且提取率較低，費時。雙水相萃取技術(Aqueous two-phase extraction, ATPS)又稱水溶液兩相分配技術，是近年來出現的引人注目，極有前途的新型分離技術。ATPE技術始于20世紀60年代，從1956年瑞典倫德大學Albertsson發現雙水相體系到1979年德國GBF的Kula等將雙水相萃取分離技術應用于生物產品分離，雖然只有二、三十年的歷史，但由于其條件溫和， 質量傳輸快，成本低，易操作，可調節，容易放大，可連續操作等特點，與傳統的有機溶劑萃取體系相比較，雙水相萃取體系在生物物質的分離中有獨到的優越之處。迄今，雙水相體系已經在生物化學、細胞生物學、生物化工等有機物分離提純方面得到了較為廣泛的應用。傳統的高聚物/高聚物或高聚物/無機鹽雙水相體系，已經成功用于分離和提取各種蛋白質 (多肽和酶)，分離和提取各種抗生素、氨基酸、金屬和中藥的有效成份等領域。在生物物質分離過程中得到應用的雙水相系統有兩類，一類是聚合物和聚合物雙水相體系，一類是聚合物和無機鹽雙水相體系。因為所用的聚合物無毒性，已被許多國家的藥典所收錄，而且其多元醇、多元糖結構能使生物大分子穩定，但在實際應用中這兩類雙水相系統各有優缺點，這兩種體系對生物活性物質變性作用低，界面吸附少，但是所用的聚乙二醇(簡稱PEG)和葡聚糖(簡稱Dextran)成本太高，而且體系黏度大，影響工業規模應用的進展，目前真正工業化的例子還很少。因此，開發廉價的雙水相體系則成了雙水相萃取分離技術發展的方向。當能與水混溶的普通的有機溶劑，如乙醇、異丙醇、丙酮等，加入到某些電解質水溶液中，利用鹽離子的水化作用，使鹽離子奪取原來與有機溶劑水合的水分子而釋放出有機溶劑分子，可形成有機溶劑/無機鹽雙水相體系。當生物物質或天然產物中的有效成分進入雙水相體系時，由于表面性質、電荷作用和各種力(憎水鍵、氫鍵和離子鍵)的存在和環境因素(濃度、溫度、PH值以及離子的種類和強度等)的影響，生物物質或天然產物中的有效成分易在兩相間形成選擇性的分配。利用這一點，可以實現生物物質和天然產物中有效成分的提取、濃縮和分離。這類新型的萃取體系，在眾多領域中表現出廣闊的應用前景，中草藥有效成分分子中多具有疏水性結構，因此雙水相萃取技術在中草藥有效成分分離純化中應用是當前研究的熱門。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術而提供了一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，其不但避免了有毒溶劑的使用，提高了葛根中總黃酮的提取率，且能將粗提品中的黃酮與多糖進行分離，達到純化葛根黃酮的目的，且方法本身操作簡單經濟。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，包括有以下步驟
1)固液浸提將葛根藥材粉碎，加入浸取劑，葛根藥材與浸取劑固液比為Ig 5ml-Ig 30ml，加熱回流提取三次，每次1小時，合并三次提取后的濾液，得到葛根粗提液；
2)雙水相萃取取步驟1)所得葛根粗提液，濃縮至原濾液體積的1/5-1/4，加入無水乙醇/磷酸二氫鉀形成的雙水相體系，加水，使系統中無水乙醇質量為系統總質量的 16%-30%，磷酸二氫鉀質量為系統總質量的17%-22%，混勻，靜置后分為上下兩相，其中，分相溫度為300C -800C，分相時間為5-20分鐘，控制pH為5. 0-9. 0 ；
3)減壓蒸餾，真空干燥取出含有大量葛根總黃酮的乙醇上相，對其進行減壓蒸餾，減壓蒸餾的溫度為70°C -80°C，最后在70°C -80°C下真空干燥，得到葛根總黃酮提取物。按上述方案，所述的浸取劑為質量百分比濃度為50-90%甲醇溶液或者乙醇溶液。按上述方案，所述的無水乙醇與磷酸二氫鉀質量分數比為1:1-2:1。與現有技術相比，本發明所提供的雙水相萃取葛根黃酮的方法的優點在于1)分相迅速，回收率高，在實驗中觀察到，采用雙水相萃取法，約10分鐘即可分相，并且沒有乳化層，縮短了實驗周期，且回收率高；2 )過程集成，雙水相萃取既達到了純化的目的，又濃縮了料液，濃縮倍數達到4倍以上；3)避免了有毒溶劑正丁醇的使用，采用了低度的無水乙醇，利用環保且節約了試劑；4)界面張力小，有助于兩相之間的質量傳遞；5)大量雜質可與固體物質一同除去，有利于純化樣品；6)易于工藝放大和連續操作，與后續純化工序可直接相連，無需進行特殊處理。
圖1為乙醇/磷酸二氫鉀相圖； 圖2為葛根素對照品紫外吸收光譜圖； 圖3葛根黃酮的標準曲線。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例1
1)固液浸提
取粉碎的葛根藥材約50. 0g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇加熱回流提取lh，固液比為1 g:10 ml，重復3次后過濾，合并濾液即得到葛根粗提液，加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得葛根樣品溶液；
2)雙水相萃取
取上述葛根樣品溶液，加入無水乙醇，磷酸二氫鉀分別為100 ml和53 g，加水，控制無水乙醇和磷酸二氫鉀的質量分數在乙醇/磷酸二氫鉀相圖(圖1)曲線的上方，使其中無水乙醇質量分數為25%，磷酸二氫鉀質量分數為17%，pH為5. 8，30°C放置5分鐘，靜置分相，分別測量上下相中總黃酮的含量；
3)葛根總黃酮測定
精密稱取干燥的葛根素標準品5. 3 mg，置于50 mL容量瓶中，95%乙醇定容，作為標準液。得到0. 106 mg/mL的葛根素標準溶液。依次移取該標準溶液0、0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5、 3.0,3.5 mL于10 mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋定容，得到系列對照品溶液。根據圖2，得到標準品的最佳吸收波長為250 nm，將配置好的系列對照品溶液于250 nm處測其吸光度， 得到吸光度A與葛根黃酮濃度C(mg/mL)的線性關系，如圖3所示。由標準曲線得，線性回歸方程為=A = 56. 5027C + 0. 01957 ； 線性回歸系數為R= 0.99936
步驟2)所得上相稀釋20倍后，測得上相吸光度為1. 508，根據回歸方程計算的濃度為 0. 526 mg/ml,步驟2)所得下相稀釋5倍后，測得吸光度為0. 923，計算得下相為濃度為 0. 08 mg/ml。利用紫外分光光度法測定雙水相萃取體系中葛根總黃酮的濃度，按公式(3)計算回收率Y:
(1)r=V±/VT(1)
(2)K = C 上/C 下(2)
(3)Y=RXK/(1+RXK) X 100%(3)
式中r為相比；V±和Vt*上下相的體積(ml) ;C±，C〒分別是上、下相中目標分離物的質量濃度(mg/ml) ；K為分配系數。當r為1時，計算得總黃酮在乙醇相的收率為86. 8%; 3)濃縮萃取液
取出含有大量葛根總黃酮的乙醇上相，置于70°C減壓蒸餾，70°C真空干燥后得到葛根總黃酮提取物。實施例2: 1)固液浸提
取粉碎的葛根藥材約50. 0g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇加熱回流提取lh，固液比為1 g:15 ml，重復3次后過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，既得葛根樣品溶液。2)雙水相萃取取上述葛根樣品溶液，加入無水乙醇，磷酸二氫鉀分別為100 ml和55 g，加水，其中無水乙醇質量分數為27. 8%，磷酸二氫鉀質量分數為19. 4%，pH為6. 5，30°C放置10分鐘，靜置分相，經計算，同實施例1，得總黃酮在乙醇相的收率為92. 8%。3)濃縮萃取液
取出無水乙醇相，置于70°C減壓蒸餾，70°C真空干燥后得到葛根總黃酮提取物。實施例3: 1)固液浸提
取粉碎的葛根藥材約50. 0g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇加熱回流提取lh，固液比為1 g:20 ml，重復3次后過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，既得葛根樣品溶液。2)雙水相萃取
取上述葛根樣品溶液，加入無水乙醇，磷酸二氫鉀分別為100 ml和50 g，加水，其中無水乙醇質量分數為28. 3%，磷酸二氫鉀質量分數為17. 9%，pH為5. 3，30°C放置15分鐘，靜置分相。經計算，同實施例1，得總黃酮在乙醇相的收率為87. 1。3)濃縮萃取液
取出無水乙醇相，置于70°C減壓蒸餾，70°C真空干燥后得到葛根總黃酮提取物。
權利要求
1.一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，包括有以下步驟1)固液浸提將葛根藥材粉碎，加入浸取劑，葛根藥材與浸取劑固液比為Ig 5ml-Ig 30ml，加熱回流提取三次，每次1小時，合并三次提取后的濾液，得到葛根粗提液；2)雙水相萃取取步驟1)所得葛根粗提液，濃縮至原濾液體積的1/5-1/4，加入無水乙醇/磷酸二氫鉀形成的雙水相體系，加水，使系統中無水乙醇質量為系統總質量的 16%-30%，磷酸二氫鉀質量為系統總質量的17%-22%，混勻，靜置后分為上下兩相，其中，分相溫度為300C -800C，分相時間為5-20分鐘，控制pH為5. 0-9. 0 ；3)減壓蒸餾，真空干燥取出含有大量葛根總黃酮的乙醇上相，對其進行減壓蒸餾，減壓蒸餾的溫度為70°C -80°C，最后在70°C -80°C下真空干燥，得到葛根總黃酮提取物。
2.按權利要求1所述的雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，其特征在于所述的浸取劑為質量百分比濃度為50-90%甲醇溶液或者乙醇溶液。
3.按權利要求1或2所述的雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，其特征在于所述的無水乙醇與磷酸二氫鉀質量分數比為1:1-2:1。
全文摘要
本發明涉及一種雙水相萃取葛根中總黃酮的方法，包括有以下步驟1)固液浸提將葛根藥材粉碎，加入浸取劑，加熱回流提取，合并濾液，得到葛根粗提液；2)雙水相萃取取步驟1)所得葛根粗提液，濃縮加入無水乙醇/磷酸二氫鉀形成的雙水相體系，加水，混勻，靜置后分為上下兩相；3)減壓蒸餾，真空干燥得到葛根總黃酮提取物。本發明優點在于1)分相迅速，回收率高；2)過程集成，雙水相萃取既達到了純化的目的，又濃縮了料液；3)避免了有毒溶劑正丁醇的使用；4)界面張力小，有助于兩相之間的質量傳遞；5)有利于純化樣品；6)易于工藝放大和連續操作，與后續純化工序可直接相連，無需進行特殊處理。
文檔編號A61P9/06GK102319282SQ20111028067
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月21日 優先權日2011年9月21日
發明者余軍霞, 張越非, 池汝安 申請人:武漢工程大學