甲基蓮心堿在制備ccl5及ccr5介導糖尿病并發交感神經/心血管疾病藥物中的應用的制作方法

            文檔序號:867444閱讀:357來源:國知局
            專利名稱:甲基蓮心堿在制備ccl5及ccr5介導糖尿病并發交感神經/心血管疾病藥物中的應用的制作方法
            技術領域
            本發明涉及糖尿病并發癥藥物用途發明領域,尤其是涉及甲基蓮心堿可用于在制備防治CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發交感神經/心血管疾病藥物中的應用。
            背景技術
            糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一組代謝性臨床綜合征,隨著社會的發展和人們生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高,在發達國家糖尿病患病率已達3% - 7%,成為僅次于癌癥、艾滋病、心腦血管病之后第4位需要優先考慮的疾病,已成為世界第5位死亡主因。糖尿病分為1型(胰島素依賴性)和2型(非胰島素依賴性)糖尿病,不論是1型 (胰島素依賴性)還是2型(非胰島素依賴性)糖尿病,其最主要的癥狀便是高血糖。我國糖尿病人群的構成以2型糖尿病為主,占糖尿病人群的90%以上,嚴重影響著人民健康和社會發展。糖尿病的主要危害不是糖尿病本身,而是在糖尿病發展過程中出現的各種慢性并發癥。糖尿病心血管并發癥嚴重影響患者的生活質量。慢性高血糖和并發的血脂障礙是導致糖尿病并發心血管疾病的主要因素。糖尿病交感神經病變是常見的糖尿病并發癥之一, 糖尿病并發交感神經病變將導致心臟和血管功能異常。從中樞下行的交感神經通過頸部交感神經節換神經元后支配內臟和血管等。頸上交感神經節不是簡單的信息中繼站,它對各種信息具有整合作用。頸上交感神經節的節后神經纖維可分布至心神經叢支配心臟,分支到心臟的外膜、中膜和內膜,還圍繞著冠脈分布在血管壁平滑肌。交感神經興奮可通過頸上交感節后神經纖維傳遞影響心血管功能的變化。趨化因子是一類具有化學趨化活性的細胞因子,在炎性反應中起重要作用。深入研究發現,趨化因子及其受體在神經系統疾病中發揮了重要的作用。趨化因子配體5 (CCL5),又被禾爾為 RANTES (regulated upon activation normal T cell expressed and secreted)。CCL5主要通過G蛋白偶聯受體發揮其生物學作用,CC類趨化因子受體5 (CCR5) 與CCL5有高親和力。慢性炎癥反應在2型糖尿病的發生、發展中具有重要作用。研究發現趨化因子不僅參與糖尿病的炎癥過程,而且在糖尿病并發癥的發生發展中發揮重要的作用。胰腺組織表達CCL5,CCL5的表達與胰島β細胞功能呈負相關。2型糖尿病患者外周血CCL5濃度增加,應用胰島素治療后血清CCL5水平顯著下降。我們實驗室通過基因芯片檢測觀察到糖尿病大鼠頸上交感神經節和心肌CCL5及其受體CCR5表達增加,表明CCL5及其受體CCR5涉及糖尿病引起的交感神經和心血管并發癥的發病。90%的大鼠基因與人的基因同源,幾乎全部與人類疾病有關的基因與大鼠基因有同源性。因此,大鼠是構建人類疾病模型的重要模式動物。甲基蓮心堿(neferin^Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽(蓮籽芯)中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿。藥理研究表明蓮子心和甲基蓮心堿具有降低血糖及調節血脂作用、降壓和抗心律失常等心血管系統效應。本實驗觀察甲基蓮心堿對2型糖尿病模型大鼠頸上交感神經節和心臟CCL5及 CCR5影響,并同時觀察甲基蓮心堿對2型糖尿病模型大鼠血糖、血脂、血胰島素及血壓等整
            3體水平功能變化的作用,以期從整體與細胞、分子水平相結合的實驗結果了解甲基蓮心堿對2型糖尿病交感神經和心臟損傷的作用及機理。

            發明內容
            本發明的第一個目的在于提供甲基蓮心堿的第一個新用途,即甲基蓮心堿在制備防治CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發交感神經病變的藥物中的應用。本發明的第二個目的在于提供甲基蓮心堿的第二個新用途,即甲基蓮心堿在制備防治CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發心血管疾病的藥物中的應用。甲基蓮心堿在防治糖尿病并發交感神經和心血管疾病的作用機理涉及降低頸上神經節和心肌組織CCL5和CCR5蛋白及mRNA的表達產生抗炎作用,對慢性炎癥反應引起的糖尿病并發心血管和交感神經損傷產生防治作用。本發明用本技術領域公知的方法,可制成適用于CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發交感神經病變的預防治療的口服、注射或外用的甲基蓮心堿制劑。本發明用本技術領域公知的方法,可制成適用于CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發心血管病變的預防治療的口服、注射或外用的甲基蓮心堿制劑。本發明實驗發現糖尿病模型大鼠頸上交感神經節和心肌組織CCL5和CCR5的mRNA 及蛋白表達較對照組明顯增加,表明頸上交感神經節和心肌組織CCL5和CCR5參與糖尿病并發心血管疾病的病理生理過程。實驗還發現與糖尿病組相比經甲基蓮心堿處理后糖尿病模型大鼠頸上神經節和心肌組織CCL5和CCR5 mRNA及蛋白表達均明顯減少,甲基蓮心堿的作用與糖尿病防治藥物羅格列酮相近。結合甲基蓮心堿具有降低糖尿病模型大鼠加快的心率和升高的血壓的作用、降低2型糖尿病模型大鼠血糖、血脂、血胰島素水平的效應,表明甲基蓮心堿的作用與影響頸上神經節和心肌組織CCL5和CCR5的mRNA及蛋白的表達有關。 實驗結果表明甲基蓮心堿可通過降低2型糖尿病模型大鼠頸上交感神經節和心臟CCL5及 CCR5的表達對糖尿病并發交感神經和心血管損傷產生保護作用。本發明為防治糖尿病并發交感神經和心血管病變探明新方法,同時還表明甲基蓮心堿具有CCL5及CCR5拮抗作用,這將有助于CCL5及CCR5所涉及神經系統疾病的藥物防治應用。


            圖1為免疫組化檢測甲基蓮心堿對糖尿病大鼠頸上交感神經節趨化因子5及其受體CCR5免疫反應性的影響圖,其中A 對照組;B 糖尿病模型組;C 糖尿病模型羅格列酮處理組;D 糖尿病模型甲基蓮心堿處理組。圖2為原位雜交檢測甲基蓮心堿對糖尿病大鼠頸上交感神經節趨化因子5及其受體CCR5的mRNA表達影響圖,其中A 對照組;B 糖尿病模型組;C 糖尿病模型羅格列酮處理組;D 糖尿病模型甲基蓮心堿處理組。圖3為RT-PCR檢則甲基蓮心堿對糖尿病大鼠頸上交感神經節趨化因子5及其受體CCR5的mRNA表達影響圖,其中從左至右為A 對照組(Con) ;B 糖尿病模型組(DM) ; C 糖尿病模型羅格列酮處理組(Ros) ;D 糖尿病模型甲基蓮心堿處理組(Nef)。圖4為蛋白印跡檢測甲基蓮心堿對對糖尿病大鼠頸上交感神經節趨化因子5及其受體CCR5蛋白表達的影響圖,其中A:對照組(Con) ;B 糖尿病模型組(DM) ;C 糖尿病模型羅格列酮處理組(Ros) ;D 糖尿病模型甲基蓮心堿處理組(Nef)。圖5為RT-PCR檢則甲基蓮心堿對糖尿病大鼠心肌趨化因子5及其受體CCR5的 mRNA表達影響圖,其中從左至右為A 對照組(Con) ;B 糖尿病模型組(DM) ;C 糖尿病模型羅格列酮處理組(Ros) ;D 糖尿病模型甲基蓮心堿處理組(Nef)。圖6蛋白印跡檢測甲基蓮心堿對對糖尿病大鼠心肌趨化因子5及其受體CCR5蛋白表達的影響圖,其中A 對照組(Con) ;B 糖尿病模型組(DM) ;C 糖尿病模型羅格列酮處理組(Ros) ;D 糖尿病模型甲基蓮心堿處理組(Nef)。
            具體實施例方式下面結合實施例并對照附圖對本發明作進一步詳細說明。為了更好地理解本發明的實質,下面以甲基蓮心堿對糖尿病大鼠模型頸上神經節和心肌組織CCL5和CCR5蛋白及mRNA的表達影響及對大鼠血糖、血脂、血胰島素及血壓等作用的實驗和結果來證明甲基蓮心堿的上述用途。實施例。一、材料和方法。 1.動物和分組。SD雄性大鼠,體重200g左右,分籠飼養,每籠飼養7只,溫度20_25°C,相對濕度 40%-70%,晝夜明暗交替12h/12h,自由飲水,適應1周后禁食不禁水1 剪尾采血測血糖。將大鼠隨機分成對照組(Con) (10只)和模型組(40只),對照組始終喂養普通飼料(由南昌大學醫學院實驗動物科學部提供),模型組喂養高糖高脂飼料(基礎飼料66. 5%,蔗糖20%,豬油 10%,膽固醇2. 5%,膽酸鈉1%,加水做成條狀放在恒溫鼓風干燥箱中80° C干烤3小時)。第5 周末(即模型組喂高糖高脂飼料4周后),所有大鼠禁食不禁水Ia1測血糖。模型組大鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ) 30mg/kg (臨用前將STZ溶解于4° C冰箱預冷的pH為4. 2的 0. lmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中,配制成2.5g/L的STZ溶液)。第6周末,空腹血糖小于7. 8mmol/L的個體再注射STZ 30mg/kg 一次,第7周末測空腹血糖大于7. 8mmol/L為成模標準,血糖仍低于7. 8mmol/L為耐受組。成模大鼠隨機分為糖尿病組(DM)、甲基蓮心堿組(Nef)和羅格列酮組(Ros)。糖尿病組腹腔注射(i. p.)生理鹽水,甲基蓮心堿組腹腔注射甲基蓮心堿^ig/kg. d,羅格列酮組腹腔注射:3mg/kg. d,連續注射4周,實驗期間,大鼠自由飲水,除對照組外其余各組均以高糖高脂飼料喂養。第11周末實驗結束,取血樣和標本。2.藥物與試劑。甲基蓮心堿(純度98%),華中科技大學同濟醫學院藥理學教研室;硫噴妥鈉,上海新亞藥業有限公司(生產批號050101);羊源性CCL5多克隆抗體(Santa Cruz公司);兔源性CCR5多克隆抗體(Abcam公司);鏈脲佐菌素(Sigma公司);1125-胰島素放免分析試劑盒(北京北方生物技術研究所);即用型SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);RANTES原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);CCR5原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);β-actin抗體(北京中杉生物技術有限公司)等。3.主要儀器。羅康全活力型血糖儀(德國羅氏公司);Softron智能無創血壓計-鼠記測儀(Gene&I公司);消毒紗布、手巾、棉簽等,碘酒及75%酒精,手術器械包剪刀、眼科小彎鑷、 血管鉗、絲線、有齒鑷等。4.空腹血糖、血胰島素、血脂的測定。各組大鼠分別于適應1周、第5周末和第11周末禁食不禁水1 后剪尾取血,用羅康全活力型血糖儀測定空腹血糖(FBG),1%戊巴比妥鈉(0.04g/kg,i.p.)麻醉條件下眼眶取血,3000rpm離心lOmin,取血清,用放射免疫分析法測空腹血胰島素(FINQ,應用自動生化分析儀檢測空腹血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)05.血壓、心率測定。各組大鼠分別于適應1周、第5周末和第11周末通過無創法血壓計檢測糖尿病模型組、甲基蓮心堿組、羅格列酮組及對照組大鼠血壓的變化情況。將大鼠于清醒狀態下,放入固定器中,僅留尾巴在固定器外。在尾部上三分之一處系好大鼠專用袖帶,直至大鼠適應固定器而保持安靜狀態下,對其進行血壓檢測,記錄各組大鼠血壓狀況,同時測定心率變化。所有的測量工作由同一人,在一個安靜的房間內進行。6.糖尿病大鼠頸上神經節實驗。6. 1免疫組織化學(CCL5及其受體CCR5 )。各組大鼠于第11周末(每組10只)在雙側頸上神經節被取出后用PBS沖洗,并迅速用4%多聚甲醛固定Mh,然后將組織浸入20%蔗糖脫水,4° C冰箱過夜。恒冷切片機將心肌切成15 μ m厚的薄片,用PBS沖洗3次,放入4%的多聚甲醛中保存。采用卵白素-生物素-辣根過氧化酶復合物法(ABC)技術檢測頸上神經節趨化因子5 (CCL5)及其受體趨化因子受體5 (CCR5)的表達。操作步驟按試劑盒說明書進行。切片置0.3%的H2O2中作用 5分鐘,常規0. OlM的PBS沖洗。分別放入封閉液中孵育30分鐘,轉入羊抗大鼠CCL5 (1 100)及兔抗大鼠CCR5 (2 48/!111)抗體,4°(過夜。經PBS常規沖洗后放入生物素標記的兔抗羊(CCL5)和羊抗兔(CCR5)IgG液作用30分鐘,PBS沖洗后轉入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(SABC液)30分鐘,DAB顯色15分鐘,放入PBS中終止顯色反應,梯度酒精脫水, 二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下拍照,用Image-Pro Plus圖像分析系統觀察分析反應密度。比較糖尿病模型組、甲基蓮心堿組、羅格列酮組及對照組大鼠頸上神經節免疫組化反應結果。6. 2原位雜交(CCL5及其受體CCR5 )。各組大鼠于第11周末(每組10只)在雙側頸上神經節被取出后用PBS沖洗,并迅速用4%多聚甲醛固定2h,然后將組織浸入20%蔗糖脫水,4° C冰箱過夜。恒冷切片機將標本切成15 μ m厚的薄片,用PBS沖洗3次,放入4%的多聚甲醛中保存。雜交前所用液體和器皿都經0. 1 %的DEPC水嚴格處理。冰凍切片在0. 05 %的H2A室溫作用30分鐘,以去除內源性過氧化物酶,胃蛋白酶消化2分鐘,37° C預雜交液中孵育2小時,棄去預雜交液,轉入雜交液于37° C水浴過夜。次日,用梯度枸櫞酸鹽水(2 X SSC, 0. 5 X SSC, 0. 2 X SSC)沖洗切片各15分鐘,入封閉液37° C 30分鐘,轉入生物素酰化的地高辛中37° C孵育30分鐘,0. 05M 的PBS沖洗15分鐘,相繼在SABC-POD和生物素化的過氧化物酶中各孵育30分鐘。DAB顯色15分鐘,放入PBS中終止顯色反應,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下拍照,實驗結果用Image-Pro Plus圖像分析系統觀察分析反應密度。比較糖尿病模型組、甲基蓮心堿組、羅格列酮組及對照組原位雜交反應結果。6.3逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)。6. 3. 1.總RNA的提取(1)取糖尿病模型組、甲基蓮心堿組、羅格列酮組及對照組大鼠頸上神經節,提前用DEPC處理過的PBS中清洗;(2)把神經節轉移到用DEPC處理過的勻漿器,加入Iml的Trizol充分研磨;(3)轉移到經DEPC水處理的1. 5ml EP管中,靜置 5分鐘,使完全變性;(4)每管加入0.2 ml氯仿充分混勻后,冰浴15分鐘;( 4°C離心 12000gX15 min,可見管中的液分為上(無色液相含總RNA中(白色乳狀含蛋白質)和下(紅色含DNA)三相;(6)將上層液相移入另一經DEPC水處理的1. 5 ml的EP管中,加等體積異丙醇,顛倒混勻數次,置-20 °(約20分鐘,沉淀1 織;(7) 4 °C離心12000gX15 min,棄上清,管底可見少許白色沉淀物(為RNA) ; (8)每管加75%乙醇1 ml,充分洗滌RNA沉淀,4 °C離心IOOOOgX 15 min,棄上清X2次;(9)棄上清液,靜置2分鐘,使之干燥,加50μ1無 RNase水重懸沉淀,取10μ1 RNA用于定量和純度檢測,余下_20°C保存。6.3.2.總 RNA 的鑒定。(1)分光光度計檢測(RNA濃度、純度測定):用0. 1%DEPC水給比色儀調零,取2 μ RNA樣品,用98 μ 0. 1%DEPC水稀釋50倍后,測RNA樣品的OD 260nm和OD 280nm,按以下公式計算RNA濃度和純度。RNA 濃度(Pg/^l) =OD 260nmX 50 X 0. 04。RNA純度=0擬60nm/0D 280nm,比值接近或大于1. 8,說明RNA純度較高,沒有蛋白質的殘余;比值小于1. 6,說明RNA樣品中有蛋白質、酚等污染。(2)甲醛變性凝膠電泳鑒定RNA質量配制甲醛變性膠,取RNA樣品5 μ 與 RNA上樣緩沖液1 :1混勻后,65° C水浴變性5min,在1XM0PS電泳緩沖液中電泳至滿意為止(50v),紫外燈下觀察,可見^S、18S、5S三條帶。6. 3. 3 .RT — PCR。(1)引物設計引物采用I^rimer Priemer 5. 0軟件設計,并經blast進一步驗證。 本研究選用β-actin作為內參,引物序列如下。Primer CCL5 (產物長度為 207 bp)
            S 5' - ATCCCTCACCGTCATCCTCGTTG - 3' A 5’ 一 TTGGCACACACTTGGCGGTTC 一 3’。Primer CCR5 (產物長度為 435bp)
            S 5' - CGATTATAGTATGTCAGCACCCTGC 一 3' A 5' - ACAGCCACCACCCAAGTGACTAC 一 3’。Primer β-actin (產物長度為 240bp)
            S 5' - TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT 一 3' A 5’ 一 CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC 一 3’。(2) cDNA合成按下列體系建立25 μ 逆轉錄反應DEPC 4. 875μ1,5 buffer 5μ1, Rnasin 0. 625μ1, DNTP 1. 5μ1, Olig DT 2μ1, MMLV μ ,RNA 樣本 10μ1,共 25μ1,稍離心, 37° C 水浴 Ih。(3)CCL5、CCR5 禾口 β-actin 擴增體系分別如下DEPC 6.5 μ , cDNA 4 Pl,CCL5 上下游引物各 μ (或CCR5、β-actin上下游引物各 μ1),2ΧΤεκι酶12. 5μ1。PCR反應條件94。CX3min — 94。CX 45sec,56。CX 45sec,72。CX 45sec,共 35 個循環—72。CX5min。(4) PCR結果分析各組取8μ1擴增產物,進行1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果、拍照,采用凝膠成像系統讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值.將CCL5、CCR5條帶與 β -actin條帶的比值作為CCL5和CCR5 mRNA的相對表達量。6.4蛋白印跡。6.4. 1.蛋白樣品制備將頸上神經節置于2ml勻漿器中球狀部位,加200 μ 1去污裂解液(含PMSF)于勻漿器中進行勻漿,然后置于冰上,幾分鐘后重復碾磨,再置于冰上,需要連續重復碾幾次使組織盡量碾碎,裂解50min后,即可用移液器將裂解液移至1. 5ml離心管中,以12000印111于4°(離心lOmin,取上清分裝于0. 5ml離心管中,取10 μ 1蛋白裂解液用Bradford法進行蛋白質定量余下置于_20°C保存。6. 4. 2.蛋白質定量采用Bradford法測定。分別取lmg/ml的BSA :0、2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20μ1,補實驗用緩沖液(水)至終體積ΙΟΟμΙ,加入Iml Bradford工作液并震蕩混勻,5min后測A595值,測量應在IOmin內完成。繪制標準曲線。以同樣方法取 μ 樣品,分別加入99μ1的水,再補以Bradford工作液1ml,測A595值,在標準曲線上查出的蛋白濃度即是樣品本身的濃度。6. 4. 3. SDS — PAGE 電泳。(1)制備 10% 分離膠1. 5 mM Tris-HCl(pH 8. 8)2. 5 ml, ddH20 4. 0ml, 30% 聚丙烯酰胺3. 3 ml, 10% SDS 100 μ 1,10%過硫酸胺100 μ 1,TEMED 5μ 1 (加入后混勻,快速制膠)。8ml上述混合液快速注入兩層玻璃板間隙,隨即以異丁醇1000ml封膠面,室溫聚合 30 min,傾去異丁醇,ddH20沖洗膠頂面。(2)制備5%積層膠1 mM Tris-HCl(pH 6.8) 0. 63 ml, ddH20 3.4 ml, 30% 聚丙烯酰胺0. 83ml, 10% SDS 50 μ 1,10%過硫酸胺50 μ 1,TEMED 5 μ 1(加入后混勻,快速制膠)。 3ml上述混合液快速注入兩層玻璃板間隙,迅速插入梳子,聚合完全后小心取出梳子。(3)電泳每組各取20 μ g蛋白和5 X上樣緩沖液按4 1體積混勻,100° C水浴5 min,趁熱加樣,加樣后凝膠放置于裝有電泳緩沖液的電泳槽進行電泳。電泳條件積層膠內 90 V X 50 min,分離膠內120 V X lh,待樣品中的溴酚藍遷移至膠的前沿時,結束電泳。(4)轉膜撬開玻璃板之間的凝膠,切取所需的部分,取與膠大小一致的PVDF膜在甲醇中浸泡IOmin后,蓋住凝膠,在凝膠和膜兩面各放四層濾紙,裁剪到與凝膠大小一致。將做好的膜塊放入轉膜器的黑白夾子中,膠在黑面(負極),膜對白面(正極),夾好后,放入轉膜器中,加上轉膜緩沖液轉膜,電流160mV 2小時。(5)檢測轉印膜上的蛋白質。A、將轉印后的PVDF膜浸泡在蒸餾水中洗滌。B、將膜浸在麗春紅S染色液中染色,約1 min可見蛋白質色帶出現。C、將膜浸在蒸餾水中脫色,輕輕搖動數分鐘,然后更換脫色液數次,直至背景色很淡。(6)免疫學檢測。A、封閉轉膜后,將PVDF膜置TBST中,緩搖lOmin,然后膜于封閉液中室溫下孵育 2h。B、結合一抗封閉后將PVDF膜移入一抗反應液(羊源性CCL5多克隆抗體按
            81:200、兔源性CCR5多克隆抗體按1 μ g/ml溶于封閉液),4°C過夜或室溫平搖2 h ;回收一抗,膜浸入TBST 10 ml中,平搖lOmin,連續3次,清洗膜上殘余一抗。C、結合二抗將PVDF膜分別移入兔抗羊(CCL5)和羊抗兔(CCR5) IgG-HRP 二抗反應液(二抗按1 :5000溶于封閉液)中,室溫平搖2 h后,PVDF膜浸入TBST IOml中,平搖15 min,連續3次,清洗膜上殘余二抗。D、免疫復合物的檢測膜在ECL中反應1 min后,用保鮮膜包裹,置于X暗盒,暗室中剪大小合適X線膠片,曝光30 s-5 min,顯影、定影,直至出滿意結果,每組樣品進行三次電泳,用于重復驗證結果。(7)光密度分析。通過掃描儀透射掃描膠片,用Image-Pro Plus圖像分析系統觀察分析綜合光密度。以各組β -actin條帶的綜合光密度值標化其相應組CCL5和CCR5的蛋白相對表達量。 比較糖尿病模型組、甲基蓮心堿組、羅格列酮組及對照組蛋白表達結果。7.糖尿病大鼠心肌實驗。7. 1. RT-PCR07. 1. 1.總RNA的提取方法同頸上神經節總RNA提取。7. 1. 2.總RNA的鑒定方法同頸上神經節總RNA鑒定。7. 1. 3. RT 一 PCR 方法和步驟同頸上神經節RT — PCR07.2蛋白印跡。7. 2. 1.蛋白樣品制備將Ig大鼠心肌組織塊置于2ml勻漿器中球狀部位,加Iml 去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中進行勻漿然后置于冰上,幾分鐘后重復碾磨,再置于冰上,需要連續重復碾幾次使組織盡量碾碎,裂解50 min后,即可用移液器將裂解液移至 1. 5ml離心管中,以12000rpm于4° C離心lOmin,取上清分裝于0. 5ml離心管中,取10 μ 1 蛋白裂解液用Bradford法進行蛋白質定量余下置于_20°C保存。7. 2. 2.蛋白印跡的操作步驟和結果分析同頸上神經節蛋白印跡。8實驗數據的統計處理。實驗數據用SPSS11. 5統計軟件進行統計分析,實驗結果以均數士標準差(χ 士 s)表示,免疫組織化學,原位雜交,蛋白印跡和RT - PCR各組數據間的統計采用方差分析, 繼以最小顯著差法(LSD)行兩兩比較,ρ<0. 05為顯著性差異。二、結果。(一)實驗動物特征和體重變化。對照組大鼠毛色光澤、精神狀況良好、動作自如、反應靈敏;糖尿病組大鼠毛發干枯、雜亂、脫落、行動遲緩、精神萎靡、尿量增多(每日尿量較之對照組高約2倍以上)并表現出多飲(每日飲水量較之對照組高約2倍以上)、多食(每日食量較之對照組高約2倍以上)等糖尿病癥狀;糖尿病大鼠經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后以上糖尿病表現均有不同程度減輕。實驗開始時各組大鼠體重比較差異無統計學意義(ρ>0. 05)。模型組大鼠經高糖高脂喂養四周后體重增幅較對照組大(Ρ<0. 05),各模型組之間無明顯差異( >0.0幻。第11 周末(即成模并連續用藥四周后)糖尿病組大鼠體重明顯高于正常對照組大鼠(ρ<0.01),與糖尿病模型大鼠組相比經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后糖尿病模型組大鼠體重均有所減輕,差異有統計學意義(P<0. 05),羅格列酮組與甲基蓮心堿組之間無統計學意義(p>0.05) (見表1)。 表1實驗期間各組大鼠體重的變化(g) (χ士 S)
            注與對照組比較#p<0. 05,##p<0. 01,與糖尿病組比較*ρ<0· 05。(二)空腹血糖、血胰島素和血脂變化
            實驗開始時各組大鼠空腹血糖、血胰島素和血脂比較差異無統計學意義(Ρ>0. 05),數據未列出。模型組大鼠經高糖高脂喂養四周后空腹血糖和甘油三酯較對照組無明顯變化 (ρ>0. 05),空腹血胰島素、總膽固醇和低密度脂蛋白較對照組增加(ρ<0. 05),但各模型組之間無明顯差異(ρ>0.05)。根據所測空腹血糖和空腹胰島素水平按照國內學者李光偉等 _提出的胰島素敏感性指數(Insulin sensitivity index, ISI)的公式,計算ISI值 ISI=In(l / (FBGXFINS)),即可發現高糖高脂喂養的SD大鼠其ISI水平顯著低于普通飼料喂養的大鼠,差異具有統計學意義(P<0. 05),提示模型組大鼠在注射STZ溶液前已經產生了明顯的胰島素抵抗(見表2)。第11周末(即成模并連續用藥四周后)糖尿病模型組大鼠空腹血糖高于正常對照組大鼠(p<0. 05),與糖尿病組相比經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后大鼠空腹血糖均明顯降低,差異有統計學意義(p<0. 05),羅格列酮組與甲基蓮心堿組之間無統計學意義 (p>0. 05)。糖尿病組大鼠空腹血胰島素、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白較對照組增加 (p<0. 05),與糖尿病組相比經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后大鼠FINS、TC和TG均明顯降低,差異有統計學意義(P<0. 05),但仍高于對照組,而LDL經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后降低不明顯。高密度脂蛋白糖尿病組較對照組降低(P<0. 05),經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后HDL有所升高,羅格列酮組與糖尿病組相比較差異有統計學意義(p<0. 05)。糖尿病組大鼠ISI水平顯著低于對照組,差異具有統計學意義(p<0. 05),經羅格列酮或甲基蓮心堿處理后ISI有所升高(p<0. 05),但仍低于對照組。實驗結果表明,糖尿病模型組大鼠存在嚴重的胰島素抵抗和脂代謝紊亂,甲基蓮心堿具有較好的改善胰島素抵抗和調整脂代謝紊亂作用(見表3)。表2實驗第5周末各組大鼠空腹血糖、血胰島素、血脂等指標的變化(χ士S)
            權利要求
            1.甲基蓮心堿在制備防治CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發交感神經病變的藥物中的應用。
            2.甲基蓮心堿在制備防治CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發心血管疾病的藥物中的應用。
            3.甲基蓮心堿在制備防治CCL5及其受體CCR5介導交感神經和心血管病變的藥物中的應用。
            全文摘要
            甲基蓮心堿在制備CCL5及其受體CCR5介導糖尿病并發交感神經/心血管疾病藥物中的應用。實驗發現經甲基蓮心堿處理后2型糖尿病模型大鼠頸上神經節和心肌組織CCL5和CCR5mRNA及蛋白表達均明顯減少,并降低2型糖尿病模型大鼠加快的心率和升高的血壓、血糖、血脂、血胰島素水平的效應,甲基蓮心堿的作用與糖尿病防治藥物羅格列酮相近。實驗結果表明甲基蓮心堿可通過降低2型糖尿病模型大鼠頸上交感神經節和心臟CCL5及CCR5的表達對糖尿病并發交感神經和心血管損傷產生保護作用。本發明為防治糖尿病并發交感神經和心血管病變探明新方法,同時還表明甲基蓮心堿具有CCL5及CCR5拮抗作用,這將有助于CCL5及CCR5所涉及疾病的藥物防治應用。
            文檔編號A61P3/10GK102335174SQ201110279910
            公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月21日 優先權日2011年9月21日
            發明者劉雙梅, 李桂林, 梁尚棟, 謝金梅 申請人:南昌大學
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