專利名稱：促造血的藥物組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種促造血的藥物組合物及其應用，特別涉及一種促進以粒系為主的造血細胞增殖分化，同時又能夠抑制腫瘤細胞生長的促造血的藥物組合物及其應用。
背景技術：
腫瘤壞死因子超家族包括將近19個成員，例如APRIL、BAFF、CD27L、CD30L、CD40L、LIGHT、TNF- a和TRAIL等等；腫瘤壞死因子受體超家族包括27個成員。腫瘤壞死因子超家族成員的生物學作用主要包括參與免疫系統的發育、功能調節和維持；參與炎癥反應；參與造血調控及參與調節骨代謝。細胞因子LIGHT基因于1995年被鑒定為腫瘤壞死因子超家族成員。1998年，LIGHT CDNA被成功克隆并且LIGHT蛋白被確認為腫瘤壞死因子受體超家族成員TR2/HVEM 和LT-P R的配體。就其細胞學分布而言，LIGHT蛋白主要表達于激活的T細胞、不成熟樹突狀細胞、粒細胞、單核細胞、激活的NK細胞和血小板；HVEM主要表達于T細胞，B、NK、DC和髓系細胞也有HVEM表達；LT-PR廣泛表達于肝細胞、胃腸道上皮細胞、淋巴組織基質細胞、單核細胞和樹突狀細胞，而成熟淋巴細胞缺乏LT- ^ R表達。就其組織學分布而言，LIGHT蛋白在脾臟高表達，在淋巴結、心臟、胎盤、肝臟、肺臟、闌尾和腎臟低表達；HVEM主要在肺臟、肝臟和腎臟表達，腦部有低表達。LT-PR在肺臟、肝臟和腎臟高表達，在淋巴結、心臟、脾臟和睪丸低表達。目前，細胞因子LIGHT已知的生物學功能主要在于免疫調控作用，如誘導樹突狀細胞成熟及T細胞激活過程中的輔助刺激等。此外，細胞因子LIGHT可誘導某些類型的腫瘤細胞凋亡以及B型慢性淋巴細胞白血病細胞凋亡，并可通過增強免疫反應抑制腫瘤生長。細胞因子LIGHT亦是一種促炎因子，細胞因子LIGHT可誘導血管內皮細胞上表達粘附分子和趨化因子，并可促進血液中的單核細胞和樹突狀細胞遷移。當前細胞因子LIGHT的研究主要集中在外周血終末分化成熟細胞，因而對其功能的了解也主要局限于與外周血終末分化成熟細胞相關的免疫調節和炎癥反應，而有關細胞因子LIGHT對干細胞的調控作用以及與之相關的生物學功能卻知之甚少。最近發現細胞因子LIGHT能夠促進胚胎干細胞分化，然而，細胞因子LIGHT對成體干細胞，尤其是對造血干細胞的生物學作用尚不清楚，從而限制了該因子在臨床醫學中的應用。腫瘤壞死因子(TNF- a )體外可以抑制造血干細胞向早幼紅系祖細胞和粒系單核系祖細胞分化，體內可抑制晚期紅系造血。TNF- a可以抑制多種生長因子刺激下的造血干、祖細胞的增殖，并抑制循環造血干細胞的穩定，毒副作用很大。從TNF-a和細胞因子LIGHT之間的關系分析，細胞因子LIGHT很可能也具有調控造血的作用。現有的實驗認為，細胞因子LIGHT在體內體外均可以促進粒系為主的小鼠造血細胞的增殖和分化。目前腫瘤發病率日益增高，臨床上主要采用放療、化療治療惡性腫瘤，但其伴有的嚴重副作用，如骨髓抑制或損傷，會造成造血功能低下，白細胞減少和免疫力下降，從而限制了放化療劑量的提聞和療效；所以促進腫瘤患者造血功能恢復，對于提聞腫瘤治愈率，降低感染發生率，腫瘤復發率和死亡率非常關鍵。臨床上主要應用重組人粒系集落刺激因子(rhG-CSF)和/或重組人粒單系集落刺激因子(rhGM-CSF)促進造血功能的恢復，但是rhG-CSF和rhGM-CSF也可以刺激殘余的腫瘤細胞增殖，增加腫瘤的復發率。因此，特別需要能夠促進造血同時又能夠抑制腫瘤細胞增殖的新型細胞因子和藥物，已解決上述現有存在的問題。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種促造血的藥物組合物及其應用，促進以粒系為主的造血細胞增殖分化，而同時又能夠抑制腫瘤細胞生長。本發明的第二個目的在于提供一種通過上述促造血的藥物組合物中促造血細胞因子進行促進粒單系祖細胞生長的方法。本發明的第三個目的在于提供一種應用MOFLO XDP系統從骨髓單個核細胞中分離 造血干細胞、共同髓系祖細胞(CMP)和粒-單系祖細胞(GMP)的方法。為了實現上述目的，本發明的技術方案如下本發明的第一方面，提供了一種促造血的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中包含有細胞因子LIGHT。在本發明的一個實施例中，細胞因子LIGHT通過結合造血干、祖細胞表面的LIGHT受體HVEM和LT- ^ R，上調髓系轉錄因子PU. 1，促進GM-CSF和GM-CSFR表達。本發明的第二方面，提供了一種通過上述促造血的藥物組合物中促造血細胞因子進行促進粒單系祖細胞生長的方法，其特征在于，進行體外促進粒單系祖細胞生長的方法包括如下步驟在適合粒單系祖細胞生長的甲基纖維素培養基中培養粒單系祖細胞，所述的培養基含有100ng/ml的細胞因子LIGHT。在本發明的一個實施例中，進行體外促進粒單系祖細胞生長的方法包括如下步驟注射包含細胞因子LIGHT的促造血的藥物組合物。在本發明的一個實施例中，細胞因子LIGHT溶解于0. 1%的BSA溶液/鹽水。本發明的第三方面，提供了一種應用MOFLO XDP系統從骨髓單個核細胞中分離造血干細胞、共同髓系祖細胞(CMP)和粒-單系祖細胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步驟步驟一、分離骨髓單個核細胞，并重懸于含2% FCS的PBS溶液中；步驟二、加入適量FCS，冰浴封閉15分鐘；步驟三、取8只FALCON管，其中I只為同型對照染色管，6只為單染管，最后I只為分選細胞管，加入6種突光標記的抗體FITC_conjugated Lineageantibody Cocktail(BioLegend, San Diego, USA) ；PerCP/Cy5. 5-conjugated Sca-Iantibody (BioLegend, San Diego, USA) ；APC-conjugated c-kit antibody(BioLegend,San Diego, USA) ；PE/Cy7-conjugated IL-7Ra antibody(BioLegend, San Diego, USA)；V450-conjugated Fe y R lll/ll antibody(BD Horizon ) ；Alexa Fluor 700-conjugated0)34 antibody (eBioscience, San Diego, USA);同型對照染色管加入6種相對應的同型對照抗體，6只單染管分別加入其中一種熒光標記抗體和其余5種同型對照抗體，渦旋振蕩器混勻，冰浴避光染色15分鐘；
步驟四、用含有2mM EDTA的2 % FCS/PBS溶液洗滌、離心、去上清，重懸于2% FCS/PBS 溶液中，上 Moflo XDP cell sorter 分選，設定 LirTSca-l+c-kit+細胞群為 HSC，IL-7Ra -LirTSca-rc-kit+CD34+Fc y Rlow 細胞群為 CMP，IL-7R a Xin-Sca-rc-kit+CD34+Fc y Rhi 細胞群為GMP。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明首次成功的應用細胞因子LIGHT促進體內造血，提供了細胞因子LIGHT的新用途，可用于開發能夠促進造血同時又能夠抑制腫瘤細胞增殖的新型細胞因子和藥物，對于促進臨床腫瘤放化療患者造血功能恢復，提高腫瘤治愈率，降低感染發生率，腫瘤復發率和死亡率具有重大意義。此外，本發明還首次成功的應用美國Beckman公司的新型MOFLO XDP系統從骨髓單個核細胞中一步法分離出造血干細胞、共同髓系祖細胞(CMP)和粒-單系祖細胞(GMP)；相較于之前應用免疫磁珠聯合BD公司的流式細胞分選儀兩步法分離造血干、祖細胞，大大節省了時間和試劑成本，提高了細胞的活性和得率，并且降低了細胞污染的風險。本發明的 方法簡便，成本低廉，可操作性強。本發明的特點可參閱本案圖式及以下較好實施方式的詳細說明而獲得清楚地了解。
圖I為小鼠造血干細胞表達LIGHT受體HVEM和LT-@ R的示意圖；圖2為LIGHT體外促進粒單系祖細胞集落(CFU-GM)生長的示意圖；圖3為LIGHT促進BMMNC和造血干細胞表達GM-CSF和GM-CSFR的示意圖；圖4為LIGHT上調BMMNC和造血干細胞表達PU. I的示意圖；圖5為應用MOFLO XDP系統從小鼠骨髓單個核細胞中一步法分離出共同髓系祖細胞(CMP)和粒單系祖細胞(GMP)的示意圖；圖6為共同髓系祖細胞(CMP)和粒單系祖細胞(GMP)表達HVEM的示意圖；圖7為共同髓系祖細胞(CMP)和粒單系祖細胞(GMP)表達LT-P R的示意圖；圖8為LIGHT輕度抑制共同髓系祖細胞(CMP)和粒單系祖細胞(GMP)終末髓細分化的示意圖；圖9為LIGHT促進小鼠體內粒單系祖細胞集落(CFU-GM)生長并上調血清中GM-CSF水平的示意圖；圖10為LIGHT抑制SDFl誘導的造血干細胞遷移的示意圖；圖11為LIGHT促進CMP表達GM-CSF和PU. I的示意圖；圖12為LIGHT抑制GMP表達GM-CSF并輕度上調GM-CSFR和PU. I表達的示意圖。
具體實施例方式為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明。本發明的第一方面，提供了一種促造血的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中包含有細胞因子LIGHT。
在本發明中，細胞因子LIGHT通過結合造血干、祖細胞表面的LIGHT受體HVEM和LT- P R，上調髓系轉錄因子PU. 1，促進GM-CSF和GM-CSFR表達。本發明的第二方面，提供了一種通過上述促造血的藥物組合物中促造血細胞因子進行促進粒單系祖細胞生長的方法，其特征在于，進行體外促進粒單系祖細胞生長的方法包括如下步驟在適合粒單系祖細胞生長的甲基纖維素培養基中培養粒單系祖細胞，所述的培養基含有100ng/ml的細胞因子LIGHT。在本發明中，進行體外促進粒單系祖細胞生長的方法包括如下步驟注射包含細胞因子LIGHT的促造血的藥物組合物。在本發明中，細胞因子LIGHT溶解于0. 1%的BSA溶液/鹽水。本發明的第三方面，提供了一種應用MOFLO XDP系統從骨髓單個核細胞中分離造血干細胞、共同髓系祖細胞(CMP)和粒-單系祖細胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步驟 步驟一、分離骨髓單個核細胞，并重懸于含2% FCS的PBS溶液中；步驟二、加入適量FCS，冰浴封閉15分鐘；步驟三、取8只FALCON管，其中I只為同型對照染色管，6只為單染管，最后I只為分選細胞管，加入6種突光標記的抗體FITC_conjugated Lineageantibody Cocktail(BioLegend, San Diego, USA) ；PerCP/Cy5. 5-conjugated Sca-Iantibody(BioLegend, San Diego, USA) ；APC-conugated c-kit antibody(BioLegend,San Diego, USA) ；PE/Cy7-conjugated IL-7Ra antibody(BioLegend, San Diego, USA)；V450-conjugated Fe y R lll/ll antibody(BD Horizon ) ；Alexa Fluor 700-conjugatedQ)34antibody (eBioscience, San Diego, USA);同型對照染色管加入6種相對應的同型對照抗體，6只單染管分別加入其中一種熒光標記抗體和其余5種同型對照抗體，渦旋振蕩器混勻，冰浴避光染色15分鐘；步驟四、用含有2mM EDTA的2 % FCS/PBS溶液洗滌、離心、去上清，重懸于2% FCS/PBS 溶液中，上 Moflo XDP cell sorter 分選，設定 LirTSca-l+c-kit+細胞群為 HSC，IL-7Ra -LirTSca-rc-kit+CD34+Fc y Rlow 細胞群為 CMP，IL-7R a Xin-Sca-rc-kit+CD34+Fc y Rhi 細胞群為GMP。實施例I細胞因子LIGHT對正常小鼠造血系統的作用步驟一、將6周雄性BALB/c小鼠分為實驗組(3只)和對照組(3只)，分別予以每天一次尾靜脈注射lmg/kg細胞因子LIGHT (溶解于0. I % BSA溶液/鹽水)，或相同劑量的0. I % BSA溶液/鹽水，連續注射12天；步驟二、最后一次注射完畢72小時后，用眼眶取血法收集每只小鼠外周血約Iml于含有肝素的抗凝管中，取0. 5ml作血細胞計數，剩余0. 5ml于室溫靜置I個小時，3000RPM5分鐘，收集300微升上清(即血清)，-80度凍存備用，以待用GM-CSF ELISA試劑盒(Biolegend)檢測血清GM-CSF水平；步驟三、頸椎脫臼法處死小鼠，分別分離每只小鼠的骨髓單個核細胞，洗滌，離心，并重懸于含2% FCS的IMDM中，調整細胞濃度為2 X 105/ml ；步驟四、取100微升上述2X 105/ml細胞懸液和Iml添加了多種重組細胞因子的甲基纖維素培養基(MethoCult 3434 ；StemCell Technologies, Vancouver, BC)混勻，接種至6孔培養板中，每只小鼠的單個核細胞接種2個復孔；步驟五、37°C 5% CO2培養箱中培養12天以后于倒置顯微鏡下計數造血集落。實施例2細胞因子LIGHT的體外促造血活性步驟一、頸椎脫臼法處死C57小鼠，分離每只小鼠的骨髓單個核細胞，洗滌，離心，并重懸于含2% FCS的IMDM中，調整細胞濃度為2 X 105/ml ；步驟二、在6孔板孔底部預先加入1000X工作濃度的細胞因子LIGHT(溶解于0. 1%BSA/PBS溶液)，即2微克/毫升的細胞因子LIGHT、20微克/毫升的細胞因子LIGHT和100微克/毫升的細胞因子LIGHT，或相同體積的0. 1% BSA/PBS溶液，取100微升上述2X 105/ml骨髓單個核細胞懸液和Iml添加了多種重組細胞因子的甲基纖維素培養基 (MethoCult 3434 ；StemCell Technologies, Vancouver,BC)混勻，接種至 6 孔培養板中，每個處理組接種2個復孔；步驟三、37°C 5% CO2培養箱中培養12天以后于倒置顯微鏡下計數造血集落。實施例3應用M0FL0 XDP從小鼠骨髓單個核細胞中分離造血干細胞、共同髓系祖細(CMP)和粒-單系祖細胞(GMP)步驟一、頸椎脫臼法處死6-12周雄性C57小鼠一只，分離骨髓單個核細胞，洗滌，離心，可得到大約1X108單個核細胞，并重懸于I毫升含2% FCS的PBS溶液中；步驟二、加入100微升FCS，渦旋振蕩器混勻，冰浴封閉15分鐘；步驟三、取8只FALCON管，其中I只為同型對照染色管，6只為單染管，每管中分別加入2X 105單個核細胞，體積調整為100微升。剩余細胞全部放入最后I只分選細胞管，體積調整為I毫升，分別加入6種熒光標記的抗體FITC-conjugated Lineage antibody Cocktail(BioLegend, San Diego, USA)200 微升；PerCP/Cy5.5_conjugated Sca-I antibody (BioLegend, San Diego, USA)10 微升；APC-conjugated c-kit antibody (BioLegend, San Diego, USA)50 微升；PE/Cy7_con jugated IL-7R a antibody (BioLegend, San Diego, USA) 50 微升；V450_con jugatedFe y R lll/ll antibody (BD Horizon ) 50 微升；Alexa Fluor 700-con jugated CD34antibody (eBioscience, San Diego, USA) 50微升；同型對照染色管加入6種相對應的同型對照抗體，6只單染管分別加入其中一種熒光標記抗體和其余5種同型對照抗體，渦旋振蕩器混勻，冰浴避光染色15分鐘；步驟四、用含有2mM EDTA的2 % FCS/PBS溶液洗滌，離心，去上清，重懸于2% FCS/PBS 中，上三色激光(405-nm, 488-nm, and 633-nm laser)Moflo XDP cell sorter (BeckmanCoulter Inc, Brea, USA)分選，先用同型對照染色管和6只單染管設定補償，設門，設定LirTSca-1+c-kit+ 細胞群為 HSC, IL-7R a Xin-Sca-rc-kit+CD34+Fc y Rlow 細胞群為 CMP，IL-7Ra -LirTSca-rc-kit+CD34+Fc y Rhi 細胞群為 GMP。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明的 范圍內。本發明要求的保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.ー種促造血的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中包含有細胞因子LIGHT。
2.根據權利要求I所述的促造血的藥物組合物，其特征在于，細胞因子LIGHT通過結合造血干、祖細胞表面的LIGHT受體HVEM和LT-β R，上調髓系轉錄因子PU. I，促進GM-CSF和GM-CSFR表達。
3.ー種通過權利要求I所述的促造血的藥物組合物中促造血細胞因子進行促進粒單系祖細胞生長的方法，其特征在于，進行體外促進粒單系祖細胞生長的方法包括如下步驟在適合粒單系祖細胞生長的甲基纖維素培養基中培養粒單系祖細胞，所述的培養基含有100ng/ml的細胞因子LIGHT。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在干，進行體外促進粒單系祖細胞生長的方法包括如下步驟注射包含細胞因子LIGHT的促造血的藥物組合物。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，細胞因子LIGHT溶解于O.I %的BSA溶液/鹽水。
6.一種應用MOFLO XDP系統從骨髓單個核細胞中分離造血干細胞、共同髓系祖細胞(CMP)和粒-單系祖細胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步驟 步驟一、分離骨髓單個核細胞，并重懸于含2% FCS的PBS溶液中； 步驟ニ、加入適量FCS，冰浴封閉15分鐘； 步驟三、取8只FALCON管，其中I只為同型對照染色管，6只為單染管，最后I只為分選細胞管，加入6種突光標記的抗體FITC_conjugated Lineageantibody Cocktail(BioLegend, San Diego, USA) ；PerCP/Cy5. 5-conjugated bca_lantibody (BioLegend, San Diego, USA) ；APC-conjugated c-kit antibody(BioLegend,San Diego, USA) ；PE/Cy7-conjugated IL-7R a antibody (BioLegend, San Diego, USA)；V450-conjugated Fe y R III/II antibody(BD Horizon ) ；Alexa Fluor 700-conjugated0)34 antibody (eBioscience, San Diego, USA);同型對照染色管加入6種相對應的同型對照抗體，6只單染管分別加入其中ー種熒光標記抗體和其余5種同型對照抗體，渦旋振蕩器混勻，冰浴避光染色15分鐘； 步驟四、用含有2mM EDTA的2% FCS/PBS溶液洗滌、離心、去上清，重懸于2% FCS/PBS溶液中，上 Moflo XDP cell sorter 分選，設定 LirTSca-l+c-kit+細胞群為 HSC, IL-7R α XirTSca-rc-kit+CD34+Fc y Rlow 細胞群為 CMP，IL-7R a Xin_Sca-rc-kit+CD34+Fc y Rhi 細胞群為 GMP。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種促造血的藥物組合物及其應用，所述藥物組合物中包含有細胞因子LIGHT；本發明首次成功的應用細胞因子LIGHT促進體內造血，提供了細胞因子LIGHT的新用途，可用于開發能夠促進造血同時又能夠抑制腫瘤細胞增殖的新型細胞因子和藥物，對于促進臨床腫瘤放化療患者造血功能恢復，提高腫瘤治愈率，降低感染發生率，腫瘤復發率和死亡率具有重大意義，實現本發明的目的。
文檔編號A61P7/06GK102671186SQ201110279039
公開日2012年9月19日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者丁華偉, 劉長龍, 姜少杰, 王繼峰, 鄒剛明, 陳維凱 申請人:上海市腫瘤研究所