專利名稱：一種促肝細胞生長素，其制劑和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種促肝細胞生長素，具體講，涉及一種新的促肝細胞生長素，及其制劑和用途。
背景技術：
促肝細胞生長素是從新鮮乳豬肝臟中提取的小分子量多肽類混合物，分子量在 10,000以下。其藥理作用主要為可刺激正常肝細胞DNA的合成，促進肝細胞再生，對損傷的肝細胞有保護作用，促進肝功能的恢復，還有調節機體的免疫功能和抗肝纖維化作用。臨床上用于治療重型肝炎、慢性活動性肝炎和肝硬化等。目前，針對促肝細胞生長素這一生物制劑類藥物，已經有很多專利和文獻報道。在專利ZL03116052. 2中，公開了一種促肝細胞生長素注射液及制備方法，其中的肝細胞生長素為從乳豬中提取分離獲得的一種活性蛋白質，占總蛋白含量的60%以上，該促肝細胞生長素是通過以下方法制備1)勻漿；幻攪拌加提取液，室溫下低速60轉/min 攪拌一個小時；幻加熱，水浴加熱提取罐，液體溫度達到95°C時停止加熱，保持15 20分鐘；4)過濾力)提純將過濾液上樣至DEAE Sepharose FF柱中，采用含有氯化鈉的PBS溶液進行洗脫，再用超濾膜除鹽。該制備方法的缺點有攪拌時間過長、在高溫條件95°C下加熱時間過長，很容易造成促肝細胞生長素中活性多肽的分解和失活；另外，其提取工藝繁瑣，還需要加鹽的洗脫液洗脫后再脫鹽，這些操作步驟都會損失活性物質的含量，造成提取物活性低，提取率低。專利ZL200610047371. 0公開了一種促肝細胞生長素水針劑制劑的制備方法，其中公開了一種促肝細胞生長素溶液的制備方法，包括以下步驟1)選材；幻組織處理；3) 勻漿低溫勻漿2分鐘；4)凍融反復凍融3次；5)熱變性去除大分子蛋白升溫至85°C，恒溫5分鐘；6)離心；7)分級超濾及病毒滅活一級超濾收集分子量30，OOODa以下的組分； 二級超濾收集分子量為10，OOODa以下的多肽組分，60°C保溫10小時，滅活病毒。該提取方法中采用了反復凍融的工藝，反復凍融這一工藝方法極易產生降壓物質，并且該工藝方法中熱變性的溫度過高，同樣會造成多肽類物質的失活。為此，發明人提出了一種生物活性大幅度提高的促肝細胞生長素及其制劑。
發明內容
本發明的首要發明目的在于提供一種促肝細胞生長素；本發明的第二發明目的在于提供這一促肝細胞生長素的制劑；本發明的第三發明目的在于提供這一促肝細胞生長素的用途。為了完成本發明的第一發明目的，采用的技術方案為本發明涉及一種促肝細胞生長素，制備方法包括以下步驟(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；
(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，勻漿液冷凍至-20 -;35°C ；(4)將-20 _35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的 1/3 1/2，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝，-18°C以下保存。本發明的第一優選技術方案為所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(3)中， 勻漿液以10 18°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以4 8°C /min的速度冷凍至-20 -35°C，優選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 -5°C，再以3 60C /min的速度冷凍至-20 -;35°C /min。在步驟(5)中，超濾液以10 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以 2 6V /min的速度冷凍至_20 _30°C，優選超濾液以12 15°C的速度從室溫冷凍至 0 -5°C，再以3 5°C /min的速度冷凍至-20 _30°C /min ；本發明的第二優選技術方案為在步驟(3)中，質量比為水豬肝1.1 1.3 1， 優選為質量比為水豬肝1.1 1。本發明的第三優選技術方案為在步驟(3)中，勻漿的時間為3 10分鐘，優選為 5分鐘。本發明的第四優選技術方案為在步驟⑷中，解凍和加熱的速度為1 10°C / min，優選以1 2°C /min的速度升溫至0 5°C，再以4 8°C /min的速度加熱至83°C 85 "C。本發明的第五優選技術方案為在步驟(5)中，中空纖維柱過濾的壓力不超過 2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo本發明的第六優選技術方案為步驟(6)中，解凍的速度為1 10°C /min，優選以 1 4°C /min的速度升溫至室溫。本發明還涉及一種促肝細胞生長素的制劑，包括凍干粉針。本發明還對提取得到的促肝細胞生長素進一步制備成了制劑，其中包括水針劑和粉針劑；凍干粉針劑的配方為促肝細胞生長素10重量份，賦形劑1 100重量份；優選促肝細胞生長素10重量份，賦形劑10 00重量份；賦形劑選自葡萄糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇、左旋糖酐等，所述的凍干粉針中還可以包括穩定劑、防腐劑、抗氧化劑等，輔料的選擇可依據本領域技術人員的常規選擇進行，也可以通過處方篩選實驗獲得。凍干粉的制備采用本領域的常規方法制備。本發明制備的針劑，通過動物體內實驗、體外實驗的檢測，其活性與所提取的促肝細胞生長素的活性相同。本發明還涉及促肝細胞生長素在制備治療重型肝炎、慢性活動性肝炎或肝硬化藥物中的應用。下面對本發明的內容做進一步的解釋和說明。
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本發明涉及一種促肝細胞生長素，本發明的促肝細胞生長素的生物活性高，有效活性成分的含量高，降壓物質含量低。(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個的完整在骨干不得超過140 克，實驗證實，乳豬的肝臟的促肝細胞生長素的含量更高，大大高于成年豬的含量；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5分鐘，比例優選為水豬肝質量比為1. 1 1 ；勻漿液冷凍至-20 -35°c ；勻漿液以10 18°C / min的速度從室溫冷凍至0 -5°C，再以4 8°C /min的速度冷凍至_20 _35°C，優選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以3 6°C /min的速度冷凍至-20 -35°C/min。本發明此處采用了分步快速速凍的方式，發明人通過反復試驗發現， 通過分步冷凍的勻漿液，促肝細胞生長素的得率會有所提高。這可能是由于通過對冷凍速度的控制，使勻漿液冷凍產生顆粒大小適宜的冰晶，從而在細胞內更加徹底的破壞細胞膜， 釋放出細胞內物質，使得提取液中有效成分含量大大增加。現有技術中，采用速凍的方式冷凍的，都是采用同一速度降溫的，但如果降溫速度一直保持很快，就會產生比較大的冰晶， 也對細胞膜的破壞不完全，從而使細胞內的物質的釋放不完全，造成提取率低下。(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網自然過濾，放入濾布或濾網自然過濾，濾布或濾網的孔徑0. Imm, 濾布或濾網的面積為2 3平方米，速度200ml/min，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；本發明采用了達到83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，從而進一步保證了產品的活性。解凍和加熱的速度為1 10°C /min，并優選階段式升溫的方式，優選以1 2V /min的速度升溫至 0 5°C，再以4 8°C/min的速度加熱至83°C 85°C。階段式升溫的好處為先以較慢的速度升溫至零度左右，對于冷凍體，升溫速度過快，會造成冷凍體內部和外部的溫差增大， 緩慢升溫可以使冷凍體均勻緩慢的解凍。因為在操作過程中一般采用蒸汽加熱，避免了在蒸汽加熱過程中，外層解凍融化溫度增高，內層還未融化，外層的溶液在高溫作用下活性降低的可能。當冷凍體溶解，本發明采用了較快速升溫的過程，這是因為，如果解凍后還采用較慢的速度，冷凍后的勻漿液中由于細胞分解破裂，釋放出大量的具有活性的蛋白分解酶， 此類活性酶物質在一個較長時間內處于一種適于其酶解其他物質的環境中，從而會引起其促肝細胞生長素活性物質的降解。(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；此處的冷凍也采用了分步冷凍，勻漿液以25 40°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以5 10°C / min的速度冷凍至-20 _30°C，優選勻漿液以30 35°C的速度從室溫冷凍至0 _5°C， 再以8 10°C /min的速度冷凍至_20 _30°C /min ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過 2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。在現有技術中，一般采用反復凍融的方式，對促肝細胞生長素進行提取，然而，反復凍融易產生降壓物質，在實際用藥的安全產生隱患。而采用化學提取、酶提取法，由于在提取過程中，PH變化過大或者酶的作用，最終提取得到的促肝細胞生長素的活性偏低，臨床應用的效果也不理想。本發明采用了兩次凍融、低溫長時間冷凍的方式，最終制備得到了一種活性多肽含量高、產品得率高的促肝細胞生長素，經動物實驗和臨床試驗，得到了良好的治療效果。本發明采用的工藝流程為勻漿液分步冷凍、凍存至少7天-溶解、加熱至83 85°C、調pH值-分子量20，000中空纖維柱過濾、分子量10，000超濾膜過濾-分步冷凍、凍存至少7天-溶解、濃縮-分子量20，000中空纖維柱過濾-0. 22 μ m除菌過率；1.本發明的工藝流程中，先將勻漿液分步冷凍，并凍存至少7天后溶解加熱后，濾布易于過濾。凍存7天可使細胞充分破裂，從而使蛋白、多肽等物質釋放，從而可使一次冷凍達到反復凍融的目的，避免了降壓物質的產生。2.本發明熱變性步驟中，僅加熱至至83 85°C并立即撤掉熱源，本發明通過反復試驗確定，采用這種方式即可以使大分子蛋白變性，而加熱至更高的溫度或者在85°C這一度下保溫，都會對降低本發明活性物質的活性。3.本發明對勻漿液采用的是自然過濾的方式，避免了離心等操作對本發明活性物質的活性的影響，節約能源。4.本發明采用了在對溶液進行過濾前就調節PH的做法。5.本發明采用了對溶液先采用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，再采用截留分子量10000的超濾膜過濾，并對中空纖維柱過濾的壓力和超濾膜的壓力進行了控制，可防止極少量的高分子物質通過濾膜，也可防止膜的損壞。6.本發明對超濾液再進行一次冷凍、解凍、過濾，從而進一步去除最終產品中的高分子物質，再經除菌得到一種安全的產品。本發明還對制備得到的促肝細胞生長素的成分做了進一步的分析，經過分析得到本發明制備的促肝細胞生長素的數均分子量為10685道爾頓，重均分子量為 11350道爾頓。本發明制備的促肝細胞生長素具含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0.7%,Try 2. 5%,Lys 1.5%,Arg 9. 1 %，總量占28. 8%。其中，氨基酸的檢測方法采用高效液相色譜檢測。將本發明制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，具體的峰保留時間和峰面積百分比見色譜圖。本發明的促肝細胞生長素的微量元素包括Fe 7. 3 7.6ug/ml，k 0. 04 0. 05ug/ml, Mgl40. 5 140. 7ug/ml, Zn 14. 2 14. 4ug/ml, Na 33. 5 33. 7ug/ml, Ca 0. 3 0. 5ug/ml, MnO. 6 0. 7ug/ml, Co 200. 1 200. 3ug/ml 本發明中微量元素的檢測方法通過原子吸收光譜檢測。本發明制備的促肝細胞生長素的濃度為15. 0 22. 5mg/ml，優選15. 0 21. 7mg/ ml，促肝細胞生長素中活性蛋白質的重量占總蛋白重量的71% 75%。其中，活性蛋白的測量方法為促肝細胞生長素通過凝膠色譜等方法分離，經7721細胞摻入培養，通過MTT法測定活性組份，并計算活性組份重量的占總質量的比例。本發明的有益效果為1.提取物的有效組份含量濃度提高。原工藝生產的濃度為5. 7 7. Omg/ml，現有工藝生產產品的濃度為15. O 21. 7mg/ml，其中，氨基酸的含量占提取物總質量的觀.8%， 活性蛋白質的重量占總蛋白重量的71% 75%。2.生物活性增加。現有技術中提取物的生物活性值(增殖倍數)為2. 5 3. 5， 本發明中提取物同量的生物活性值提高到4. 5 6. O。3.安全性提高。現工藝提取物的高分子量組份(分子量大于10000道爾頓)的百分比由5%降低到不超過3%，從而對人的過敏反應基本消除；降壓物質的含量降低，現有技術中0. lmg/kg的用量即產生副反應，本發明的提取物0. 5mg/kg的用量條件下不會產生副反應。
圖1為實施例1制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖2為實施例2制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖3為實施例3制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖4為實施例4制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖5為實施例5制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖6為實施例6制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖7為實施例7制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖。本發明的具體實施方式
僅限于進一步解釋和說明本發明，并不對本發明的內容構成限制。
具體實施例方式實施例1促肝細胞生長素的提取(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5min，比例為水豬肝質量比為11 1 ；勻漿液以16°c /min內從室溫冷凍至0°C，再以4°C /min的速度冷凍至-35 °C ；(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5，解凍和加熱的速度為1 2 0C /min ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C。其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖1所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 6ug/ml，Se 0. 04ug/ml，Mg 140. 5ug/ml，Zn 14. 2ug/ml, Na 33. 5ug/ml, Ca 0. 3ug/ml, Mn 0. 6ug/ml, Co 200.lug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 3mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例2(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5分鐘，比例為水豬肝質量比為115 1 ；勻漿液以15°C/min的速度從室溫冷凍至-5°C，再以5°C/ min的速度冷凍至-35 °C。(4)將_35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；解凍和加熱的速度以2°C /min 的速度升溫至0°C，再以8°C /min的速度加熱至85°C ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以3°C / min的速度冷凍至_30°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為TC /min升溫至室溫；過濾， 上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖2所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His
80. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 3ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 6ug/ml，Zn 14. 4ug/ml, Na 33. 7ug/ml, Ca 0. 5ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.2ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 5 ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例3(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5分鐘，水和豬肝質量比為11 1;勻漿液以18°c/min的速度從室溫冷凍至-2°c，再以8°C/min的速度冷凍至；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以10°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖3所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 8mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的72%。實施例4(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；CN 102294014 A (3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5分鐘，水和豬肝質量比為11 1 ；勻漿液以15°c /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖4所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 2mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的73%。實施例5(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5分鐘，水和豬肝質量比為11 1 ；勻漿液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以6°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過
10濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖5所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 5mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占重量的72%。實施例6(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為1000轉/分，時間為5分鐘，水和豬肝質量比為1. 2 1 ；勻漿液以18°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至-32°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至84°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為3°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖6所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；
促肝細胞生長素的濃度為21. 7mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例7(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，時間為5分鐘，水和豬肝質量比為115 1 ；勻漿液以17V /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以7°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖7所示。經檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為 Fe 7. 5ug/ml, Se 0. 05ug/ml, Mg 140. 7ug/ml, Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 5mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例8配方為實施例1提取得到的促肝細胞生長素10重量份，甘露醇90重量份，采用常規方法配液、除菌、灌裝，凍干。比較例1 不同的制備工藝處理對生物活性的影響工藝1 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)加熱至85°C并保持15分鐘；工藝2 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)直接以2V /min的速度加熱至83°C 85°C ；工藝3 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)直接以6°C /min的速度加熱至83°C 85°C ；檢測方法同實驗例3，實驗結果如表1所示；表1:
孔數 吸光度平均值 刺激指數 實施例 130.3735.8
エ藝 130. 1393. 5
エ藝 230.1383.4
エ藝 330.1383.4比較例2 不同的制備エ藝處理對產率的影響エ藝1 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以30°C /min的速度 從室溫冷凍至-35 °C ；エ藝2 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以10°C /min的速度 從室溫冷凍至-35 °C ；エ藝4 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以15°C /min的速度 從室溫冷凍至-25 °C ；エ藝5 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以5°C /min的速度 從室溫冷凍至-25 °C /min ；エ藝6 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存48小時；エ藝7 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存72小時；實驗結果見表2:表2:
單位產量(mg/g) 實施例16. 58
エ藝15. 45
エ藝25.34
エ藝35.18
エ藝44. 54
エ藝54. 38
エ藝65.35
エ藝75. 26實驗例1體內實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗雄性Wistar大鼠，1；35 190g，在戊巴比妥鈉(％ig/100g體重)麻醉下進行32% 的肝部分切除，術后4 6小時經腹腔注射生理鹽水細1、本發明實施例1 7制備的促肝細胞生長素20mg，于30小時固定于肝右葉中下1/3處取材，Bouin’ s液固定，包埋切片，6u H. Ε.染色，有絲分裂計數，如表3所示表3:
動物數有絲分裂百分率倍數P值對照組80.9440.166促肝細胞生長素實施例153.1150.5233.3<0.001促肝細胞生長素實施例253.4040.4943.7<0.001促肝細胞生長素實施例353.2570.4273.6<0.001促肝細胞生長素實施例453.3640.4993.6<0.001促肝細胞生長素實施例553.3710.5233.5<0.001促肝細胞生長素實施例653.4120.4873.7<0.001促肝細胞生長素實施例 53.4070.5043.6<0.001實驗例2體外實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗雄性豚鼠200 300G，經心臟采血自私，無菌取出心臟，沖洗后剪碎與100目尼龍網上輕研，過濾，用含10%胎牛血清1640培養液制備肝細胞懸液，細胞計數為5 7 X IO5個 /ml,0. 2%臺盤藍染色活率為81%。當成活率高于70%時進行M孔板培養，每孔加Iml含血清1640培養液，37°C,5% CO2,培育4小時，吸取各孔上清液，正常對照組不加促肝細胞生長素，實驗組每孔加含有40 μ g促肝細胞生長素的無血清1640培養液，24小時每孔加2uci 的3H-dTR, 7°C,5%C02,培育2. 5小時，分別收集各孔的細胞，用0. OlMPBS沖洗3次，涂于玻璃纖維濾紙片上，37°C干燥過夜，將紙片放入閃爍杯中，加閃爍液5ml，閃爍計數器測各樣品的CPM值。表4本發明促肝細胞生長素對體外肝細胞DNA3H-ClTR參入量的影響
孔數CPM值倍數P值對照組36565. 3空白組31579.2促肝細胞生長素實施例1327423.65.5<0.001促肝細胞生長素實施例2329417.45.9<0.001促肝細胞生長素實施例3330414.66.1<0.001促肝細胞生長素實施例4326924.45.4<0.001促肝細胞生長素實施例5328420.25.7<0.001促肝細胞生長素實施例6327423.05.5<0.001促肝細胞生長素實施例 3299166.0<0.001實驗例3體外實驗MTT法1.取實施例1 7制備的促肝細胞生長素，用RPMI-1640培養液制成每Iml中含多肽IOOyg的溶液。2.用10%的小牛血培養液培養SMMC-7721細胞至對數增長期，用0. 25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二鈉消化液消化，加10%小牛血清培養液稀釋至每Iml中含2. 5X IO4 5 X IO4個細胞，將上述細胞懸液在96孔細胞板上鋪板，每孔100 μ 1，其中3孔加10%小牛血清培養液100 μ 1作為空白對照，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養箱中培養3 4小時使其貼壁。供試品組，每孔加供試品溶液100 μ 1，每批供試品均做3個孔，細胞對照組和空白對照組每孔分別加RPMI-1640培養液100 μ 1，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養箱中培養48小時，結束培養前4小時取出培養板，吸去培養液，每孔加入0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液 (Ph7. 3)洗一次，然后再每孔中加入上述磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 3) 100 μ 1和MTT溶液20 μ 1，
繼續培養。培養結束后，其吸出培養液，每孔加入100μ 1 二甲基亞砜，搖勻，在酶標儀上以 550nm的波長處分別測定其吸收度A值；并計算刺激指數；其中刺激指數為(供試品組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值)與(對照組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值)的比值。
15
刺激指數=供試品組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值對照組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值
表5
孔數吸光度平均值刺激指數對照組30.114
空白組30.060
促肝細胞生長素實施例1 30.3735.8促肝細胞生長素實施例230.3525.促肝細胞生長素實施例330.3575.促肝細胞生長素實施例430.3625.促肝細胞生長素實施例530.3685.促肝細胞生長素實施例630.3735.促肝細胞生長素實施例 30.3685權利要求
1.一種促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素的制備方法包括以下步驟(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結蒂等組織后，用純水洗凈；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉/分，勻漿液冷凍至-20°C -35°C ；(4)將-20°C _35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網自然過濾，濾液用NaOH溶液調節PH值至6. 5 ；(5)將調節至PH為6.5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至_20°C _30°C密封保存；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的1/3 1/2，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0. 22um的濾膜除菌后分裝，-18°C 以下保存。
2.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟⑶，勻漿液以10 18°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以4 8°C /min 的速度冷凍至-20 -35°C，優選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C， 再以3 6°C /min的速度冷凍至-20 -;35°C /min。在步驟(5)中，超濾液以10 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以2 6°C / min的速度冷凍至-20 _30°C，優選超濾液以12 15°C的速度從室溫冷凍至0 _5°C， 再以3 5°C /min的速度冷凍至-20 _30°C /min ；
3.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟⑶中，質量比為水豬肝1. 1 1. 3 1，優選為質量比為水豬肝1. 1 1。
4.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(3)中，勻漿時間為3 10分鐘，優選為5分鐘。
5.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟中，解凍和加熱的速度為1 10°c /min，優選以1 2V /min的速度升溫至0 5°C，再以4 8°C /min的速度加熱至83°C 85°C。
6.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(5)中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo
7.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(6)中，解凍的速度為1 10°C /min，優選以1 4°C /min的速度升溫至室溫。
8.一種含有權利要求1所述的促肝細胞生長素的制劑，其特征在于，所述的制劑包括水針和凍干粉針。
9.根據權利要求8所述的制劑，其特征在于，所述的凍干粉針劑的組成為促肝細胞生長素和甘露醇。
10.權利要求1所述的促肝細胞生長素在制備治療重型肝炎、慢性活動性肝炎或肝硬化藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種促肝細胞生長素，其制備方法包括以下步驟選材；組織處理；室溫下與注射用水混合，勻漿，勻漿液冷凍至-20℃～-35℃；將凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83℃～85℃后立刻撤掉加熱源，過濾，調節PH值至6.5；用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20℃～-30℃密封保存；將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，濃縮，濃縮液經截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經0.22um的濾膜除菌后分裝，-18℃以下保存。本發明還涉及該促肝細胞生長素的制劑、用途。本發明的促肝細胞生長素活性高、產率高，使用安全。
文檔編號A61P1/16GK102294014SQ20111026498
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者孔祥平, 張宜俊, 張海松, 楊富強, 陳光明, 陳陽述 申請人:中國人民解放軍第四五八醫院