芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途的制作方法

專利名稱：芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及從芫根植株中提取得到的芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途，屬于藥用天然產物領域。
背景技術：
大量的流行病學研究表明，血糖異常升高是糖尿病發生的一個危險因素，糖尿病是一種常見的內分泌代謝性疾病，是繼心血管疾病及癌癥之后危害人類健康的第三大疾患。由于糖尿病具有患病率、致殘率及并發癥高的特點，因此已成為醫學界頗為矚目并倍加重視的疾病之一。目前的降血糖藥物多為西藥或中藥的大復方，西藥(包括注射劑和口服降糖藥) 作用強而迅速，過量導致病人低血糖癥而被迫停藥，結果又致停藥癥狀反跳；中藥大復方基本上是都是由天然中草藥經簡單的炮制和提取制成的，不僅成分相當復雜、制備不便，而且難以進行更深入的結構/藥效研究，也不利于藥物質量控制和中藥現代化。我國有著豐富的中草藥資源，如何合理開發這些天然植物資源，利用現代藥物化學分析技術和生物學實驗手段，尋找一類安全有效的天然植物降血糖藥物已經成為醫學、 生物學領域廣泛關注的焦點，也是提升我國降血糖藥物產業競爭力的關鍵。芫根(Brassica rapa L.)，又名蔓菁，二年生草本，現廣泛栽種于青藏高原。芫根生長在海拔高、溫差大、日照強的高原環境中，適應能力強，產量高，營養豐富，通常作為飼料應用于畜牧業，其肉質根還可以作為蔬菜或果品供人食用，具有清熱解毒、滋補增氧的功效。目前開發利用芫根的現有技術中，尚未見關于芫根總皂苷降血糖功效方面的報道。皂苷廣泛存在于自然界，在菌類、蕨類、單子葉、雙子葉植物等中具有分布。大量研究顯示，植物皂苷是植物生長過程中產生的代謝產物，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒、抗生育和降低膽固醇、降低高血脂、抑制血栓形成等作用。因此，開發利用植物皂苷具有巨大的生物學、 醫學意義。本發明通過提取芫根總皂苷并對其進行降血糖活性檢測，拓寬了芫根綜合開發利用的途徑，為探索天然的、有效的降血糖藥物提供了理論依據，符合高原植物資源的有效利用和藏藥新藥開發的需要，有利于推動民族地區經濟的發展。

發明內容
本發明的目的之一是提供以皂苷類化合物為主要成分的芫根總皂苷提取物；本發明還提供上述芫根總皂苷提取物的制備方法；本發明還提供上述芫根總皂苷提取物在治療和/預防血糖異常升高癥的藥物制備中的用途。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為從芫根根塊中提取到總皂苷，得率為2 6重量％，呈固態棕黃色，易溶于乙醇，易溶于熱水。利用四氧嘧啶和腎上腺素所致的糖尿病小鼠模型進行芫根總皂苷降血糖作用功效實驗，除非另有說明，本發明中的％為重量百分比。
本發明芫根總皂苷提取物的制備方法具體為方法A:(1)將芫根原料置于提取釜中，加入3 10倍生藥體積的低級醇，低級醇為Cl C5醇類，其濃度為50 95%，提取溫度為30 80°C，勻速攪拌6 12h，過濾得到濾液，并反復提取1 4次，合并濾液得到粗提液；(2)提取液減壓濃縮后，溶于30 70°C熱水，浸膏與水的體積比為1 2 3，按 1 1 3體積加入石油醚萃取，除去親脂性雜質；C3)按1 1 3體積加入正丁醇進行萃取，減壓濃縮至無有機溶劑味的固體，得到粗制總皂苷；(4)將粗制總皂苷加入少量甲醇至溶解，然后一邊攪拌一邊加入少量乙酸乙酯，混合均勻，析出總皂苷，反復處理3 9次，干燥后即得到精制總皂苷，該芫根總皂苷得率為 3 5重量％，純度為39 70 %。方法B:(1)將芫根原料置于提取釜中，加入3 10倍生藥體積的低級醇，低級醇為Cl C5醇類，其濃度為50 95%，提取溫度為30 80°C，勻速攪拌6 12h，過濾得到濾液，并反復提取1 4次，合并濾液得到粗提液；(2)粗提液濃縮至原來的1/3后，利用大孔吸附樹脂吸附，用1倍柱體積的水洗去水溶性雜質，例如糖等，改用30% 80%乙醇對其進行梯度洗脫，收集洗脫液；(3)將洗脫液減壓濃縮至無有機溶劑味固體，得到粗制總皂苷；(4)將粗制總皂苷加入少量甲醇至溶解，然后一邊攪拌一邊加入少量乙酸乙酯，混合均勻，析出總皂苷，反復處理3 9次，干燥后即得到精制總皂苷，該芫根總皂苷得率為 2 3重量％，純度為65 90%。方法C (1)將芫根原料置于提取釜中，加入3 10倍生藥體積的低級醇，低級醇為Cl C5醇類，其濃度為50 95%，提取溫度為30 80°C，勻速攪拌6 12h，過濾得到濾液，并反復提取1 4次，合并濾液得到粗提液；(2)將粗提液濃縮，加入30°C 70°C熱水，浸膏與水的體積比為1 2 3，2000 3000rp離心20 30min得到沉淀和上清液兩部分；(3)將沉淀物加入50 95%乙醇進行回流提取，將過濾液濃縮、干燥得到一部分總皂苷；(4)將上清液減壓濃縮，2000 3000rpm離心20 30min，用水洗沉淀物，干燥得到另一部分總皂苷；(5)合并以上兩個部分得到總皂苷，該芫根總皂苷得率為4 6重量％，純度為 42 75%。所述制備方法中的芫根原料均為芫根的塊根，經切片后自然風干，然后粉碎得到粉狀物，粉碎細度達到40 200目；上述方法B中所用的大孔吸附樹脂為DlOl或SA-3或AB_8 ；上述方法A、B中所用的甲醇為無水或含水甲醇，所用乙酸乙酯濃度為100%。所述干燥方法為減壓真空干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
采用制備藥物制劑的常規方法和助劑，將芫根總皂苷制備成各種制劑，例如粉劑、 片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋片、緩釋膠囊、滴丸或液體制劑等。上述制劑應用于臨床治療肥胖癥、高血脂癥及制成含芫根總皂苷減肥降脂保健品。本發明用Liebermarm反應檢測所提的芫根總皂苷，反應中溶液呈黃一紅一藍一紫一綠色變化，可以確定其為皂苷類化合物。總皂苷的定量測定是利用苷元與香蘭素的硫酸試劑發生的顯色反應，產生有色物質，以齊墩果酸為標準品繪制標準曲線，利用紫外分光光度法測定總皂苷純度。通過上述方法制備的芫根總皂苷在降血糖方面有顯著的效果。利用四氧嘧啶和腎上腺素所致的糖尿病小鼠模型進行芫根總皂苷降血糖作用功效實驗，結果顯示，芫根皂苷對四氧嘧啶和腎上腺素致糖尿病小鼠具有顯著降血糖作用。本發明方法得到的芫根總皂苷原料易得，方法簡單，生產成本低，產品中總皂苷含量較高，質量穩定、易于控制。
具體實施例方式實施例1、采用方法A，取曬干芫根塊根粉碎至100目，用3倍體積50%乙醇，在30°C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取4次，合并濾液。30°C減壓旋轉蒸發濃縮濾液，將所得浸膏溶于30°C熱水，浸膏體積/水體積為1 2.5，按1 1體積加入石油醚對其進行萃取，除去脂溶性雜質。再用正丁醇反復萃取3次，減壓回收正丁醇后得到粗總皂苷。將得到的粗總皂苷溶于少量無水甲醇，然后滴入乙酸乙酯(體積比為1 0.5)，攪拌混勻，有總皂苷析出。反復處理5次，收集析出的總皂苷，冷凍干燥。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為 4. 95%，純度為39%實施例2采用方法A，取曬干芫根塊根粉碎至40目，用6倍體積75 %乙醇，在80°C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取2次，合并濾液。70°C減壓旋轉蒸發濃縮濾液，將浸膏溶于70°C熱水，浸膏體積/水體積為1 2，按1 2體積加入石油醚對其進行萃取，除去脂溶性雜質。再用正丁醇反復萃取5次，減壓回收正丁醇后得到粗總皂苷。將得到的粗總皂苷溶于少量無水甲醇，然后滴入乙酸乙酯(體積比為1 0.8)，攪拌混勻，有總皂苷析出。反復處理5次，收集析出的總皂苷，45°C減壓真空干燥。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為3.5%，純度為57%實施例3 采用方法A，取曬干芫根塊根粉碎至200目，用10倍體積95 %乙醇，在65 °C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取4次，合并濾液。65°C減壓旋轉蒸發濃縮濾液，將浸膏溶于熱水，浸膏體積/水體積為1 2，按1 1體積加入石油醚對其進行萃取，除去脂溶性雜質。再用正丁醇反復萃取6次，減壓回收正丁醇后得到粗總皂苷。將得到的粗總皂苷溶于少量無水甲醇，然后滴入乙酸乙酯(體積比為1 0.5)，攪拌混勻，有總皂苷析出。反復處理5次，收集析出的總皂苷，45°C減壓真空干燥。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為3. 1%，純度為67%。
實施例4、
采用方法B，取曬干芫根塊根粉碎粉碎至100目，用3倍體積80%乙醇，在40°C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取4次，合并濾液。40°C減壓旋轉蒸發濃縮濾液至原來體積的1/3。將濃縮液經過大孔吸附樹脂D101，使液體中的皂苷吸附于樹脂，棄去流出液，再用1倍柱體積的蒸餾水沖洗樹脂柱，棄去流出液，繼而分別用3倍柱體積的30%、 60%、90%乙醇進行梯度洗脫，并收集洗脫液，減壓濃縮后得到粗總皂苷。將得到的粗總皂苷溶于少量無水甲醇，然后滴入乙酸乙酯(體積比為1 1)，攪拌混勻，有總皂苷析出。反復處理5次，收集析出的總皂苷，40°C減壓真空干燥。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為 2. 97%，純度為 65%。實施例5采用方法B，取曬干芫根塊根粉碎粉碎至100目，用6倍體積95%乙醇，在65°C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取4次，合并濾液。65°C減壓旋轉蒸發濃縮濾液至原來體積的1/3。將濃縮液經過大孔吸附樹脂D101，使液體中的皂苷吸附于樹脂，棄去流出液，再用1倍柱體積的蒸餾水沖洗樹脂柱，棄去流出液，繼而分別用2倍柱體積的20%、 40^^60^^80^^90%乙醇進行梯度洗脫，并收集洗脫液，減壓濃縮后得到粗總皂苷。將得到的粗總皂苷溶于少量無水甲醇，然后滴入乙酸乙酯(體積比為1 0.7)，攪拌混勻，有總皂苷析出。反復處理5次，收集析出的總皂苷，45°C減壓真空干燥。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為2. 56 %，純度為75 %。實施例6、采用方法B，取曬干芫根塊根粉碎粉碎至40目，用10倍體積60%乙醇，在70°C的水浴中攪拌12h，抽濾得到粗提液，反復提取2次，合并濾液。70°C減壓旋轉蒸發濃縮濾液至原來體積的1/3。將濃縮液經過大孔吸附樹脂AB-8，使液體中的皂苷吸附于樹脂，棄去流出液，再用1倍柱體積的蒸餾水沖洗樹脂柱，棄去流出液，繼而分別用2倍柱體積的20%、 40^^60^^80^^90%乙醇進行梯度洗脫，并收集洗脫液，減壓濃縮后得到粗總皂苷。將得到的粗總皂苷溶于少量無水甲醇，然后滴入乙酸乙酯(體積比為1 0.5)，攪拌混勻，有總皂苷析出。反復處理5次，收集析出的總皂苷，45°C減壓真空干燥。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為2. 11%，純度為87%。實施例7、采用方法C，取曬干芫根塊根粉碎至100目，用3倍體積60%乙醇，在40°C的水浴中攪拌12h，抽濾得到粗提液，反復提取4次，合并濾液。濾液經減壓濃縮得到浸膏，溶于 40°C熱水，浸膏與水的體積比為1 2.5，后以3000印111的速度離心201^11，分離上清液和沉淀。將沉淀物用3倍生藥體積的60%乙醇進行回流提取，過濾濃縮，40°C減壓真空干燥得到總皂苷；將上清液減壓濃縮，3000rpm離心20min，用水洗沉淀物，45°C減壓真空干燥得到另一部分總皂苷，合并兩部分總皂苷。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為5. 7%，純度為42%實施例8 采用方法C，取曬干芫根塊根粉碎至100目，用6倍體積75%乙醇，在60°C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取2次，合并濾液。濾液經減壓濃縮得到浸膏，溶于70°C 熱水，浸膏與水的體積比為1 2，后以2500rpm的速度離心30min，分離上清液和沉淀。將沉淀物用3倍生藥體積的95%乙醇進行回流提取，過濾濃縮，45°C減壓真空干燥得到總皂苷；將上清液減壓濃縮，2500rpm離心30min，用水洗沉淀物，45°C減壓真空干燥得到另一部分總皂苷，合并兩部分總皂苷。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為4. 9%，純度為60%實施例9采用方法C，取曬干芫根塊根粉碎至200目，用10倍體積90%乙醇，在70°C的水浴中攪拌他，抽濾得到粗提液，反復提取4次，合并濾液。濾液經減壓濃縮得到浸膏，溶于70°C 熱水，浸膏與水的體積比為1 2，后以3000rpm的速度離心30min，分離上清液和沉淀。將沉淀物用5倍生藥體積的90%乙醇進行回流提取，過濾濃縮，45°C減壓真空干燥得到總皂苷；將上清液減壓濃縮，3000rpm離心30min，用水洗沉淀物，45°C減壓真空干燥得到另一部分總皂苷，合并兩部分總皂苷。所得芫根總皂苷為棕黃色，得率為4. 1%，純度為70%。實施例10片劑取芫根總皂苷50g，加入50g可壓淀粉和40g羧甲基淀粉鈉，混合均勻，以 70%的乙醇為潤濕劑，制軟材，18目篩制粒，烘干，16目篩整粒，加入3g硬脂酸鎂為潤滑劑， 混合均勻，壓片、包衣，制成1000片包衣片。實施例11膠囊取芫根總皂苷50g，加入80g可壓淀粉和20g羧甲基纖維素鈉，混合均勻，以 70%的乙醇為濕潤劑，制軟材，24目篩制粒，烘干，20目篩整粒，加入3g硬脂酸鎂，混合均勻，裝膠囊，制成1000粒膠囊。實施例12顆粒劑取芫根總皂苷100g，加入450g蔗糖粉、IOOg梭甲基纖維素鈉、IOOg微晶纖維素和50g檸檬酸，混合均勻，以3% PVP為潤濕劑制軟材，20目篩制粒，烘干，18目篩整粒，分裝，制成粒徑為830 880 μ m的1000袋顆粒劑。每袋重0. 72 0. 78g。實施例13 粉針劑取芫根總皂苷12g，羥丙基-ρ-環糊精135g，加注射用水3L，攪成糊狀，再加70°C 85°C的注射用水3L，溶解時溫度控制在70°C 85°C，加甘露醇450g溶解，再用 ImoL/L鹽酸溶液調pH值至5. 6，加入針用炭后室溫攪拌，過濾脫炭，精濾.濾液按每只2ml 進行分裝，采用速凍法干燥，將制品取出，進行封口，即得到性狀為白色疏松塊狀物或粉末， 即得粉針劑。實施例14滴丸將150g聚乙二醇4000在水浴上加熱得熔融液，趁熱加入芫根總皂苷50g， 攪拌均勻，65°C保溫1小時，用滴丸機滴制，滴速120滴/分鐘，滴制溫度65 75°C，在15°C 左右的液體石蠟中冷卻，制得丸重約60mg，干燥，包衣，即得滴丸。實施例15口服液取蒸餾水適量，加入20g芫根總皂苷、180g蔗糖粉、20g檸檬酸，攪拌溶解， 過濾，濾液補充蒸餾水至10000ml，加入香精適量，攪拌均勻，分裝，每支10ml，壓蓋，100°C 消毒1小時，檢查合格，即得口服液。實施例16粉劑取芫根總皂苷30g，粉碎成粒徑為20 μ m粉狀物，加入500g蔗糖粉、IOOg梭甲基纖維素鈉、IOOg微晶纖維素混合均勻，分裝，制成1000袋粉劑。每袋重0. 68 0. 73g。 添加量為食品或飼料的0. 01 1%。將上述實施例1制備所得的芫根總皂苷進行如下藥效學實驗
將本發明實施例1制備所得的芫根總皂苷對四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的降血糖作用實驗1.實驗材料與方法 取雄性昆明種小鼠60只，28-32g,適應性飼養后隨機分組，禁食12小時；每只小鼠尾靜脈注射85mg/kg的四氧嘧啶，7 后眼眶取血測定血糖，血糖達到界定值 16. 9mmol/L)的則確定為糖尿病小鼠，按血糖的高低隨機分組，分別為模型組、陽性組和總皂苷1(0. 5g/kg)、總皂苷II(lg/kg)和總皂苷III(2g/kg)組；對模型組每日給予 0. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液0. 4ml,陽性組給予50mg/kg格列本脲，總皂苷各組給予相應劑量的總皂苷提取物，給藥持續7天，第八天眼眶取血，以葡萄糖氧化酶法測定血清血糖。小鼠第八天眼眶取血后處死，解剖分別取肝、腎、胸腺和脾臟，稱重，計算臟器指數。實驗數據用SPSS10. 0統計軟件進行統計學處理，實驗數據均以均數士標準差表示，采用t檢驗進行組間比較。2.實驗結果表1芫根總皂苷對實驗鼠血糖的影響
組別與劑量初始血糖(dl)給藥7天后血糖(d7)模型組-24. 0±2. 823. 2±2. 1陽性組(50mg/kg)24. 0±2. 519. 9±3. 4*總皂苷 1(0. 5g/kg)24. 0±2. 419. 7±2. 0*總皂苷II(lg/kg)23. 9±2. 617. 6 ±3. 4林總皂苷 III(2g/kg)24. 0±3. 018. 7±3. 6林注與模型組比較，“*”Ρ<0·5，“**”Ρ<0·01表2芫根總皂苷對實驗鼠臟器指數的影響
權利要求
1.一種芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途，其特征在于將芫根總皂苷提取物制備成降血糖的藥物，所述芫根總皂苷是通過如下步驟制備的(1)將芫根原料置于提取釜中，加入3 10倍生藥體積的低級醇，低級醇為Cl C5醇類，其濃度為50 95%，提取溫度為30 80°C，勻速攪拌6 12h，過濾得到濾液，并反復提取1 4次，合并濾液得到粗提液；(2)提取液減壓濃縮后，溶于30 70°C熱水，浸膏與水的體積比為1 2 3，按 1 1 3體積加入石油醚萃取，除去親脂性雜質；(3)按1 1 3體積加入正丁醇進行萃取，減壓濃縮至無有機溶劑味的固體，得到粗制總皂苷；(4)將粗制總皂苷加入少量甲醇至溶解，然后一邊攪拌一邊加入少量乙酸乙酯，混合均勻，析出總皂苷，反復處理3 9次，干燥后即得到精制總皂苷，該芫根總皂苷得率為3 5 重量％，純度為39 70%。
2.一種芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途，其特征在于將芫根總皂苷提取物制備成降血糖的藥物，所述芫根總皂苷是通過如下步驟制備的(1)將芫根原料置于提取釜中，加入3 10倍生藥體積的低級醇，低級醇為Cl C5醇類，其濃度為50 95%，提取溫度為30 80°C，勻速攪拌6 12h，過濾得到濾液，并反復提取1 4次，合并濾液得到粗提液；(2)粗提液濃縮至原來的1/3后，利用大孔吸附樹脂吸附，用1倍柱體積的水洗去水溶性雜質，例如糖等，改用30% 80%乙醇對其進行梯度洗脫，收集洗脫液；(3)將洗脫液減壓濃縮至無有機溶劑味固體，得到粗制總皂苷；(4)將粗制總皂苷加入少量甲醇至溶解，然后一邊攪拌一邊加入少量乙酸乙酯，混合均勻，析出總皂苷，反復處理3 9次，干燥后即得到精制總皂苷，該芫根總皂苷得率為2 3 重量％，純度為65 90%。
3.一種芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途，其特征在于將芫根總皂苷提取物制備成降血糖的藥物，所述芫根總皂苷是通過如下步驟制備的(1)將芫根原料置于提取釜中，加入3 10倍生藥體積的低級醇，低級醇為Cl C5醇類，其濃度為50 95%，提取溫度為30 80°C，勻速攪拌6 12h，過濾得到濾液，并反復提取1 4次，合并濾液得到粗提液；(2)將粗提液濃縮，加入30°C 70°C熱水，浸膏與水的體積比為1 2 3，2000 3000rp離心20 30min得到沉淀和上清液兩部分；(3)將沉淀物加入50 95%乙醇進行回流提取，將過濾液濃縮、干燥得到一部分總皂苷；(4)將上清液減壓濃縮，2000 3000rpm離心20 30min，用水洗沉淀物，干燥得到另一部分總皂苷；(5)合并以上兩個部分得到總皂苷，該芫根總皂苷得率為4 6重量％，純度為42 75%。
4.根據權利要求1-3任一所述的用途，其中所述芫根原料均為芫根的塊根，經切片后自然風干，然后粉碎得到粉狀物，粉碎細度達到40 200目。
5.根據權利要求1-3任一所述的用途，其中所述的干燥方法為減壓真空干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
6.根據權利要求1-3任一所述的用途，其中將芫根總皂苷提取物制備成粉劑、片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋片、緩釋膠囊、滴丸或液體制劑。
全文摘要
本發明涉及從芫根植株中提取得到的芫根總皂苷制備降血糖藥物的用途，芫根總皂苷不僅可以降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠的血糖，還能同時改善臟器的病變，同時對腎上腺素所致的動物高血糖也進行了相關藥效試驗，結果顯示也有顯著的降血糖作用。
文檔編號A61K36/31GK102258555SQ201110239059
公開日2011年11月30日 申請日期2011年8月19日 優先權日2011年8月19日
發明者蔣思萍, 高平 申請人:西藏自治區高原生物研究所