專利名稱：新城疫病毒ndv py毒株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗腫瘤微生物技術領域，具體涉及一種新城疫病毒NDV PY毒株及其應用。
背景技術：
新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)新城疫樣病毒(Avulavirus)屬，其自然宿主為禽類、火雞，其引起的疾病新城疫(Newcastle disease)能在多種禽類中傳播,通常表現為呼吸道、消化道炎癥,或伴有腦部病變。NDV偶有感染人的情況出現，感染后可引起輕微流感樣癥狀或結膜炎，最嚴重者也只是引起喉炎，通常都能自愈。研究發現，NDV在人腫瘤細胞中的復制效率遠比在大多數正常 細胞中高。根據對禽類的致病力不同NDV分為強、中、弱三種毒株。新城疫病毒F蛋白的裂解與毒力密切相關，強毒株的F蛋白前體F。均能裂解為F1和F2兩部分，具有融合性和較強的感染力。弱毒株的Ftl蛋白不能裂解為F1及F2,因此融合性和感染力較弱。序列分析認為，新城疫病毒F蛋白剪切位點的序列與病毒致病力直接相關(參見 Collins MS, Bashiruddin JB, Alexander DJ. Deduced amino acidsequences at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease virusesshowing variation in antigenicity and pathogenicity[J].Arch Virol,1993,128(3-4) :363_370 ;以及 Millar NS, Chambers P, Emmerson PT. Nucleotide sequence ofthe fusion and haemagglutinin—neuraminidase glycoprotein genes of Newcastledisease virus, strain Ulster molecuar basis for variations in pathogenicitybetween strains [J]. J Gen Virol, 1988,69 (Pt3) :613_620)。該F 蛋白剪切位點位于112 117位氨基酸處，強毒株和中毒株裂解位點氨基酸組成為112R/K-R-Q-K/R-R-F117,即由Q隔開的兩對堿性氨基酸，所以強毒株的裂解位點易被廣泛分布于多種宿主細胞的堿性成對氨基酸蛋白酶和PC6所識別和裂解。而弱毒株則為112g/e-k/r-q-g/e-r-l117，只能被胰蛋白酶樣蛋白酶和雞胚尿囊液中的特殊因子水解，這類蛋白酶通常只由呼吸道和消化道分泌，因此弱毒株在大多數細胞中不發生裂解，以非活性前體H)蛋白的形式傳遞到子代，感染活性降低或喪失。世界動物健康組織(World organisation for animal health)目前已接受NDV分離株F蛋白裂解位點序列報告作為毒力標準(參見Berinstein A, SellersHS, King DJ, et al. Use of a heteroduplex mobility assay to detect differences inthe fusion protein cleavage site coding sequence among Newcastle disease virusisolates[J], J Clin Microbiol,2001,39(9) :3171_3178)。根據殺傷腫瘤細胞的方式不同NDV又可分為裂解株和非裂解株，其中裂解株感染可導致腫瘤細胞在較短時間內裂解；非裂解株感染往往導致腫瘤細胞凋亡。不同株的NDV其抗腫瘤效果不同，即使同一株NDV對不同腫瘤細胞的殺傷效果也存在差異。因此，需要通過一系列手段對野生NDV毒株進行篩選或修飾以培育出抗腫瘤效果好、抑瘤譜廣、安全性高的NDV毒株。
已有的一些抗腫瘤NDV毒株多為強毒力的裂解株。這類毒株殺傷腫瘤細胞的效率較高，但對禽類致病力很強，應用過程中如稍有不慎導致病毒外泄就可能對環境如養殖業等造成生物危害。此外，這類NDV裂解株殺死腫瘤細胞后短時間內即釋放大量子代病毒，在體內應用時容易刺激機體產生抗病毒中和抗體，抗病毒中和抗體的存在將阻斷NDV的抗腫瘤效應。因此臨床應用時往往需對病毒進行一些修飾，或制備瘤苗，應用成本較高。
發明內容
為解決上述問題，本發明提供一種新城疫病毒株。本發明提供的新城疫病毒NDV PY株，其微生物保藏號CGMCCNo. 4804 ;保藏時間2011年5月2日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；該毒株抗腫瘤效果好，能特異性地殺傷腫瘤細胞且對正常細胞影響小，其為弱毒力毒株，對外界生物環境不存在安全威脅，可用于制備良好的抗腫瘤生物制劑用于治 療包括肝癌、小細胞肺癌、喉癌、結腸癌等多種惡性腫瘤。本發明提供的新城疫病毒NDV PY株以分離自江西鄱陽湖野鴨的若干株NDV野生毒株為基礎，進行篩選、純化、培養，通過蝕斑法篩選增殖能力強的毒株并檢測其抗腫瘤能力及安全性，選育出一株新的NDV毒株，經過血凝試驗、血凝抑制試驗鑒定，證明并被命名為新城疫NDV PY毒株，其抗腫瘤效果好、對正常細胞影響小。本發明NDV PY毒株病毒顆粒的收集、保存方法將病毒接種于9日齡SPF雞胚，35°C培養48小時，培養期間每隔24小時觀察雞胚活性一次，若發現雞胚死亡即放入冰箱，可疑死亡的雞胚留待第36小時觀察，確定死亡后放入冰箱；培養結束后，將接種的雞胚放入4°C冰箱冷凍過夜；然后收取尿囊液做血凝試驗，測定其HA效價，若< I : 1024，則取病毒尿囊液再次雞胚接種擴增病毒，直至HA效價達到彡I 1024 ;收集尿囊液，低速離心(3000rpm,30min,4°C )，取上清液超離心(50000g，60min,4°C ), PBS重懸沉淀并加至35 %鹿糖溶液頂部超離心洗漆兩遍(97000g, 60min,4°C )，用含O. I % EDTA的PBS重懸病毒沉淀，直接分裝或冷凍干燥，置_80°C冰箱保存。本發明NDV毒株的特性該病毒株在SPF雞胚中生長良好，病毒接種于9日齡雞胚尿囊腔37 °C培養60小時后，取尿囊液檢測血凝效價，其HA效價可達I : 2048;將含病毒尿囊液直接接種雞胚，每日照蛋2次，連續觀察7天，雞胚死亡率不超過6% ；I日齡雞腦內致病指數(ICPI)為O. O ;6周齡雞靜脈內致病指數(IVPI)為O. O -M胚感染I個最小致死劑量病毒的平均死亡時間(MDT) > 120小時；病毒在Vero-E6單層細胞上作用90小時左右后出現直徑約為I. Omm左右的空斑。注一般地，ICPI> I. 60 為速發型，ICPI = I. 20 I. 60 為中發型，ICPI < I. 20為緩發型；IVPI >2.0為速發型，IVPI < 2. O為中發型或緩發型；MDT < 60h為速發型，MDT=60 90h為中發型，MDT > 90h為緩發型。三個指標不一定一致，一種指數往往難以確定病毒毒力的強弱，此時應結合3種指數綜合判定。該株病毒進行了全基因組測定，其基因組序列如SEQ ID No. I所示。NDV PY毒株全基因組序列由15186個堿基組成(參見SEQ IDNo. I)，與其他GenBank上公布的24株毒株的基因組序列進行比較，核苷酸同源性在72. 8% 95. 8%之間，氨基酸同源性在51. 2% 90. 3%之間，屬于基因I型弱毒力病毒株，與基因I型國際標準弱毒株Ulster株在系統發生進化樹同一分支上，具有親緣關系。通過對NDVPY株F基因裂解位點的序列分析，NDV PY株F蛋白裂解位點的氨基酸序列為112G-K-Q-G-R-L117,與文獻發表的NDV弱毒株在F基因裂解位點的氨基酸特征序列112g/e-k/r-q-g/e-r-l117相符合(參見“副粘病毒包膜糖蛋白分子生物學研究進展”，任桂杰，王志玉，《病毒學報》，2005, 21 (I) 72-75)，從而確定該毒株為弱毒力毒株，對外界生物環境不存在安全威脅，可用于制備良好的抗腫瘤生物制劑。本發明還提供一種藥物組合物，其包含上述新城疫病毒NDVPY毒株和藥學上可接受的載體。本發明的藥物組合物可采用現有制藥領域中的常規方法生產，可根據需要添加各種藥學上可接受的載體如藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解齊U、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。該藥物組合物可以口服、鼻吸入或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。進一步地，所述藥物組合物中包含的新城疫病毒NDV PY病毒濃度為IXlO6 lX108PFU/ml。上述的新城疫病毒NDV PY毒株在制備抗腫瘤藥物中的應用。 進一步地，在上述制備抗腫瘤藥物的應用中，所述腫瘤為肝癌、小細胞肺癌、喉癌、
結腸癌。本發明優點本發明采用在腫瘤細胞中連續傳代的方法選育出抗腫瘤能力強的NDV PY毒株，檢測該毒株對正常細胞的毒副作用，通過裸鼠移植瘤來檢測其體內抑瘤效果，并對該毒株進行基因組全序列測定，結果表明該毒株可在多種腫瘤細胞系(HepG-2、SMMC-7721、BEL-7404、NCI-H446、LoVo、Lsl74t和H印-2)中增殖傳代并誘導腫瘤細胞凋亡，培養基中病毒HA效價可達I : 512;在正常細胞(HL-7702、HFL-I、喉及結腸原代細胞)中該毒株不能增殖，對正常細胞殺傷作用較小；用病毒注射移植瘤裸鼠，病毒可特異性地在腫瘤組織中增殖，顯著抑制移植瘤生長，實驗鼠生理狀況良好，無毒副作用表現，除腫瘤組織外實驗鼠體內其他器官未檢測到病毒存在。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。實施例I本發明NDV PY毒株的獲取、篩選和檢測I)標本處理將從江西省鄱陽湖感染NDV發病的野鴨中采集所得標本抑菌處理后接種9日齡SPF雞胚尿囊腔，37°C培養48小時，培養期間每隔24小時觀察雞胚活性一次，若發現雞胚死亡即放入冰箱，可疑死亡的雞胚留待第36小時觀察，確定死亡后放入冰箱。培養結束后，將接種的雞胚放入4°C冰箱冷凍過夜。然后收取尿囊液做血凝試驗，測定其HA效價，HA效價陽性者進行分型鑒定，挑選NDV陽性尿囊液開展后續工作。2)病毒收集將尿囊液低速離心(1500-3000rpm,30min,4°C ),取上清超高速離心(50000g,60min，4°C )，PBS重懸沉淀并加至35 %蔗糖溶液頂部超高速離心洗滌兩遍(97000g，60min,4°C )，含O. I % EDTA的PBS重懸沉淀，得純病毒粒子。3)病毒孵育將病毒原液稀釋成若干濃度如I : 10，1 : IXIO2jI I X IO3等，接種于腫瘤細胞，5% CO2 37°C共同培養，每日檢測細胞上清液中病毒血凝效價無效價者，盲傳一代，若連續兩代均無血凝效價則淘汰相應毒株。有效價者，當細胞90%以上死亡時，收集細胞培養液，繼續接種于腫瘤細胞中，連續傳代數次，直至細胞培養液上清中病毒HA效價> I 256。·收集細胞上清液，1500rpm離心5分鐘后分裝保存待用。4)病毒純化將步驟3)所得待選病毒接種于Veix)-E6細胞，室溫下吸附I小時后，棄去病毒液，每孔加入3ml含O. 5%瓊脂的細胞培養液覆蓋層，冷卻后倒置培養。每日觀察細胞形態變化，48 72小時后，再次覆蓋含中性紅的細胞培養液瓊脂覆蓋層，避光培養，直至出現蝕斑。選取單個較大較早出現的蝕斑，吸管吸取病毒，稀釋于500μ I細胞維持液中，再次接種Vero-E6細胞中進行蝕斑純化，連續純化3次。將純化病毒接種雞胚擴增，并通過步驟2)收集病毒。5)病毒抗腫瘤能力及安全性檢測將步驟4)所得純化病毒(濃度為I X 106PFU/ml)分別與腫瘤細胞和正常細胞共培養，MTT法檢測病毒在體外條件下對腫瘤細胞和正常細胞的殺傷作用。同時將病毒(濃度為lX106PFU/ml)注射給荷瘤裸鼠，檢測病毒在體內環境中的抗腫瘤能力及毒副作用。選擇抗腫瘤能力強同時對正常細胞及組織影響小的毒株作為候選毒株，所得毒株經全序列測定，并作進化樹分析，確定為一種新的亞型株，即NDV PY株。結果表明，該毒株可在多種腫瘤細胞系OfepG-2、SMMC-7721、BEL-7404、NCI-H446、LoVo, Lsl74t和H印-2)中增殖傳代并誘導腫瘤細胞凋亡，培養基中病毒HA效價可達I 512 ;在正常細胞(HL-7702、HFL-1、喉及結腸原代細胞)中該毒株不能增殖，對正常細胞殺傷作用較小(詳見下述表I和表2);用病毒注射移植瘤裸鼠，病毒可特異性地在腫瘤組織中增殖，顯著抑制移植瘤生長，實驗鼠生理狀況良好，無毒副作用表現，除腫瘤組織外實驗鼠體內其他器官未檢測到病毒存在(詳見下述表3)。表I :NDVPY(1 X 106PFU/ml)在體外條件下對腫瘤細胞系的殺傷作用
權利要求
1.一種新城疫病毒NDV PY毒株，其保藏號為=CGMCC No. 4804。
2.一種藥物組合物，其特征在于，包含權利要求I所述的新城疫病毒NDV PY毒株和藥學上可接受的載體。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，包含的新城疫病毒NDVPY毒株病毒濃度為 I X IO6 I X 108PFU/ml。
4.權利要求I所述的新城疫病毒NDVPY毒株在制備抗腫瘤藥物中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述腫瘤為肝癌、小細胞肺癌、喉癌、結腸癌。
全文摘要
本發明涉及一種新城疫病毒NDV PY毒株及其應用。本發明提供的新城疫病毒NDV PY毒株，其保藏號為CGMCC No.4804。本發明采用在腫瘤細胞中連續傳代的方法選育出抗腫瘤能力強的NDV PY毒株，檢測該毒株對正常細胞的毒副作用，通過裸鼠移植瘤來檢測其體內抑瘤效果，并對該毒株進行基因組全序列測定，結果表明，該毒株抗腫瘤效果好，能特異性地殺傷腫瘤細胞且對正常細胞影響小，其為弱毒力毒株，對外界生物環境不存在安全威脅。
文檔編號A61P35/00GK102952783SQ20111023755
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者樊曉暉, 宋德志, 梁瑩, 肖慶, 賴振屏, 高靈茜, 黃川 , 楊建林, 姜艷華 申請人:廣西醫科大學