專利名稱：披針葉黃華總生物堿和幾種高純度藥用物質的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥活性成分分離純化技術領域，具體涉及一種披針葉黃華總生物堿和幾種高純度藥用物質的制備工藝。
背景技術：
披針葉黃華(SeiTBOASi1S h/^eohte)，別名牧馬豆，蒙古語“他日巴干-希日”， 為多年生草本，屬豆科野決明屬。分布于東北、北及陜西、甘肅、青海、寧夏、四川等省區，披針葉黃華主要化學成分為喹諾里西啶類生物堿，并因部位不同總生物堿含量差異也較大， 以種子含量最高，其次為花、果實、葉、莖、根，該類生物堿具有抗癌、抗心律失調、抗微生物、 抗潰瘍、升高白細胞等多方面的藥理作用。披針葉黃華生物堿單體，目前已經分離得到金雀花堿、黃華堿、鷹爪豆堿、臭豆堿、 菱葉野決明堿、羽扇豆堿、N-甲基金雀花堿等10多種生物堿單體，其毒性大小不同，披針葉黃華單體的用途也很廣泛。如金雀花堿對呼吸系統的作用類似煙堿，毒性比煙堿小；能反射性地興奮呼吸；對大腦循環有增壓作用；對云杉卷葉蛾的產卵有較好的抑制作用等。黃華堿對動物的神經節有中度抑制作用，對延髓及大腦皮質亦有作用，作用于中樞和外周神經系統，特別是呼吸和血管運動中樞，也作用于腦，小劑量有麻痹作用，對真菌有抑菌活性，對杉炭疽菌的EC5tl為0. lmg/ml。鷹爪豆堿在體外有興奮子宮的作用，具有催產素和麥角生物堿的全部催產性能，有抗心律失常作用，能降低心肌應激性和傳導性，減慢心律，抑制心臟收縮力，對骨骼肌有明顯的興奮作用，不降低膽堿酯酶活力，興奮作用不是通過抑制膽堿酯酶活力而造成乙酰膽堿堆積的結果，而是直接興奮骨骼肌。目前文獻報道的從披針葉黃華中分離總生物堿的方法主要有超臨界二氧化碳萃取(蔡智慧，倪傳根，賈瑞琴，等.超臨界二氧化碳萃取披針黃華總生物堿工藝的研究.林產化學與工業.2006，沈(4) :70-72.)，該方法萃取率低。亦有文獻采用有機溶劑提取、酸化、堿化、溶劑萃取(李勇，晁向陽，張永康.披針葉黃華的研究進展.農業科學研究.2007， 28 (3) :80-84.)，該方法使用大量酸堿和毒性較大的有機溶劑，環境污染嚴重，不適宜大生產。現有文獻中，有關披針葉黃華中生物堿單體成分的分離純化，魏啟華等采用氧化鋁柱分離，氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脫(魏啟華，趙博光.披針葉黃華生物堿及其生物活性.南京林業大學學報.2000，M (5):73-76.)。中國專利申請號200910023485. 5公開的方法是將披針葉黃華種籽粉碎后，經提取、濃縮得浸膏，用有機溶劑萃取浸膏，酸水溶液反萃取、凈化萃取溶劑，同時得到含黃華堿的酸水溶液，此酸水溶液加入堿性試劑堿化，析晶，重結晶，可得到黃華堿；萃取過的浸膏溶液堿化后用有機溶劑萃取，濃縮，結晶，重結晶，得到純度金雀花堿，該方法使用大量酸堿溶液，不利于成分的穩定性，并使用苯等毒性強的溶劑，操作不安全。中國專利申請號2009102065 . 3公開的方法是通過提取、濃縮，調堿，溶劑萃取，連續中壓柱層析等步驟分離得到金雀花堿。中國專利申請號201010M0158. 8公開的方法是通過提取、濃縮、酸水酸化、堿化、有機溶媒萃取，得到總生物堿，將總生物堿溶于水，用有機溶媒萃取得到金雀花堿，該方法僅通過有機溶媒從總生物堿中萃取即得到金雀花堿，實際生產中不易實現。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的不足及缺陷，提供一種披針葉黃華總生物堿和幾種高純度藥用物質的制備工藝。本發明不僅可以得到披針葉黃華總生物堿，還可分離得到高純度的單體成分，包括金雀花堿、黃華堿、鷹爪豆堿和N-甲基金雀花堿。為實現上述目的，本發明的技術方案如下 它包括以下步驟
(1)取披針葉黃華藥材粉碎，加入PH1-3的酸水溶液動態提取，提取1-3次，合并提取
液；
(2)將上述提取液濃縮后過強酸性陽離子交換樹脂，水洗樹脂至水洗液為中性，樹脂中加入堿水堿化，乙醇洗脫，得乙醇洗脫液；
(3)將上述乙醇洗脫液濃縮至無醇味，過大孔吸附樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫， 收集乙醇洗脫液，濃縮、干燥，得總生物堿提取物；
(4)使用高速逆流色譜結合高效制備液相色譜分離純化，根據檢測譜圖接收目標成分流分，分別減壓濃縮至一定體積，真空干燥得到目標化合物。步驟(1)所述酸水為鹽酸、硫酸或醋酸水溶液。步驟(2)所述強酸性陽離子交換樹脂為732、HZ002、HZ016、JK006中的一種。步驟(3)所述大孔吸附樹脂選自X-5、HP20、SIP-1100、HPD300、ME-I等非極性或弱極性大孔樹脂。步驟(3)所述大孔樹脂洗脫劑選用50-75%乙醇洗脫，收集洗脫液。步驟(4)所述高速逆流色譜純化中，以二氯甲烷-異丙醇-0. 02MNa2HP03為溶劑系統，其體積比為(15-23. 5) (7. 5-12. 5) :(3_6)。本發明的有益效果是本發明采用酸水動態提取，提高了提取率；同時采用強酸性陽離子交換樹脂法，避免了酸堿和有機溶劑的使用，使生產操作更加安全，并改善了有效成分的穩定性；再者單體成分的分離純化主要采用了高速逆流色譜法，分離周期短、制備量大。
具體實施例方式下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍并不限于以下實施例。實施例1
取披針葉黃華葉粉碎，加入5倍量pHl. 0的鹽酸水溶液動態提取3次，每次1.證，合并提取液，將提取液濃縮，過732強酸性陽離子交換樹脂，先以水洗至水洗液為中性，再向樹脂中加入氨水堿化，將生物堿游離出來后，用85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，過X-5大孔吸附樹脂柱，先以水洗脫，再用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥得到總生物堿提取物。將體積比為23. 5:12.5:4的二氯甲烷、異丙醇、0. 02MNa2HP03混合，振蕩搖勻，使兩相達到平衡，靜置分層后分離，下相為流動相，上相為固定相，分別對其超聲脫氣40min后冷卻備用；取總生物堿提取物溶解于等體積的上相和下相溶劑中，過濾，得樣品溶液；將配制好的固定相以5ml/min的流速充滿高速逆流色譜儀的螺旋管中，開啟制備型高速逆流色譜儀，調整主機轉速為820rpm，以2ml/min的流速將流動相泵入柱內，待柱內溶劑體系建立動態平衡后，取樣品溶液由進樣閥進樣，然后根據紫外檢測譜圖，分別收集各個流分。分離物的純度檢測與結構鑒定，采用分析性高效液相色譜法對各個峰組分進行純度檢測，HPLC分析條件色譜柱C18 (4. 6mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相:0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:lml/min ；柱溫25°C，檢測波長 306nm。揮干溶劑后進行MS、IR^1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認，分別為鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿。應用制備型液相色譜分離純化鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿流分，色譜條件為色譜柱C18 (30mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:20ml/min ；柱溫25°C，檢測波長:306nm。實施例2:
取披針葉黃華葉粉碎，加入5倍量pH3. 0的硫酸水溶液動態提取2次，每次池，合并提取液，將提取液濃縮，過HZ002強酸性陽離子交換樹脂，先以水洗至水洗液為中性，再向樹脂中加入氨水堿化，將生物堿游離出來后，用85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，過SIP-1100大孔吸附樹脂柱，先以水洗脫，再用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、 干燥得到總生物堿提取物。將體積比為15:11:6的二氯甲烷、異丙醇、0.02MNa2HP03混合，振蕩搖勻，使兩相達到平衡，靜置分層后分離，下相為流動相，上相為固定相，分別對其超聲脫氣40min后冷卻備用；取總生物堿提取物溶解于等體積的上相和下相溶劑中，過濾，得樣品溶液；將配制好的固定相以5ml/min的流速充滿高速逆流色譜儀的螺旋管中，開啟制備型高速逆流色譜儀，調整主機轉速為900rpm，以3ml/min的流速將流動相泵入柱內，待柱內溶劑體系建立動態平衡后，取樣品溶液由進樣閥進樣，然后根據紫外檢測譜圖，分別收集各個流分。分離物的純度檢測與結構鑒定，采用分析性高效液相色譜法對各個峰組分進行純度檢測，HPLC分析條件色譜柱C18 (4. 6mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相:0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:lml/min ；柱溫25°C，檢測波長 306nm。揮干溶劑后進行MS、IR^1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認，分別為鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿。應用制備型液相色譜分離純化鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿流分，色譜條件為色譜柱C18 (30mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:20ml/min ；柱溫25°C，檢測波長:306nm。實施例3
取披針葉黃華葉粉碎，加入5倍量pH2. 6的醋酸水溶液動態提取1次，每次1.證，合并提取液，將提取液濃縮，過JK006強酸性陽離子交換樹脂，先以水洗至水洗液為中性，再向樹脂中加入氨水堿化，將生物堿游離出來后，用80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，過HP20大孔吸附樹脂柱，先以水洗脫，再用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥得到總生物堿提取物。將體積比為18. 5:7. 5:3的二氯甲烷、異丙醇、0. 02MNa2HP03混合，振蕩搖勻，使兩相達到平衡，靜置分層后分離，下相為流動相，上相為固定相，分別對其超聲脫氣40min后冷卻備用；取總生物堿提取物溶解于等體積的上相和下相溶劑中，過濾，得樣品溶液；將配制好的固定相以5ml/min的流速充滿高速逆流色譜儀的螺旋管中，開啟制備型高速逆流色譜儀，調整主機轉速為850rpm，以1. 5ml/min的流速將流動相泵入柱內，待柱內溶劑體系建立動態平衡后，取樣品溶液由進樣閥進樣，然后根據紫外檢測譜圖，分別收集各個流分。分離物的純度檢測與結構鑒定，采用分析性高效液相色譜法對各個峰組分進行純度檢測，HPLC分析條件色譜柱C18 (4. 6mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相:0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:lml/min ；柱溫25°C，檢測波長 306nm。揮干溶劑后進行MS、IR^1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認，分別為鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿。應用制備型液相色譜分離純化鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿流分，色譜條件為色譜柱C18 (30mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:20ml/min ；柱溫25°C，檢測波長:306nm。實施例4
取披針葉黃華葉粉碎，加入5倍量pH2. 6的醋酸水溶液動態提取1次，每次1.證，合并提取液，將提取液濃縮，過HZ016強酸性陽離子交換樹脂，先以水洗至水洗液為中性，再向樹脂中加入氨水堿化，將生物堿游離出來后，用80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，過ME-I大孔吸附樹脂柱，先以水洗脫，再用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥得到總生物堿提取物。將體積比為16. 5:9:5的二氯甲烷、異丙醇、0. 02MNa2HP03混合，振蕩搖勻，使兩相達到平衡，靜置分層后分離，下相為流動相，上相為固定相，分別對其超聲脫氣40min后冷卻備用；取總生物堿提取物溶解于等體積的上相和下相溶劑中，過濾，得樣品溶液；將配制好的固定相以5ml/min的流速充滿高速逆流色譜儀的螺旋管中，開啟制備型高速逆流色譜儀，調整主機轉速為800rpm，以1. 5ml/min的流速將流動相泵入柱內，待柱內溶劑體系建立動態平衡后，取樣品溶液由進樣閥進樣，然后根據紫外檢測譜圖，分別收集各個流分。分離物的純度檢測與結構鑒定，采用分析性高效液相色譜法對各個峰組分進行純度檢測，HPLC分析條件色譜柱C18 (4. 6mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相:0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:lml/min ；柱溫25°C，檢測波長 306nm。揮干溶劑后進行MS、IR^1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認，分別為鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿。應用制備型液相色譜分離純化鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿和黃華堿流分，色譜條件為色譜柱C18 (30mmX 250mm i. d. 5 μ m)；流動相0. 05mol/L磷酸二氫鈉溶液甲醇高氯酸鈉(85ml :15ml :1. Og)；流速:20ml/min ；柱溫25°C，檢測波長:306nm。
權利要求
1.披針葉黃華總生物堿和幾種高純度藥用物質的制備工藝，其特征在于幾種高純度藥用物質包括金雀花堿、黃華堿、鷹爪豆堿和N-甲基金雀花堿。
2.披針葉黃華總生物堿和幾種高純度藥用物質的制備工藝，其特征在于包括以下步驟(1)取披針葉黃華藥材粉碎，加入PH1-3的酸水溶液動態提取，提取1-3次，合并提取液；(2)將上述提取液濃縮后過強酸性陽離子交換樹脂，水洗樹脂至水洗液為中性，樹脂中加入堿水堿化，乙醇洗脫，得乙醇洗脫液；(3)將上述乙醇洗脫液濃縮至無醇味，過大孔吸附樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫， 收集乙醇洗脫液，濃縮、干燥，得總生物堿提取物；(4)使用高速逆流色譜結合高效制備液相色譜分離純化，根據檢測譜圖接收目標成分流分，分別減壓濃縮至一定體積，真空干燥得到目標化合物。
3.根據權利要求2所述的制備工藝，其特征在于步驟(1)所述酸水為鹽酸、硫酸或醋酸水溶液。
4.根據權利要求2所述的制備工藝，其特征在于步驟(2)所述強酸性陽離子交換樹脂為 732、HZ002、HZ016、JK006 中的一種。
5.根據權利要求2所述的制備工藝，其特征在于步驟(3)所述大孔吸附樹脂選自X-5、 HP20、SIP-1100、HPD300.ME-1等非極性或弱極性大孔樹脂。
6.根據權利要求2所述的制備工藝，其特征在于步驟(3)所述大孔樹脂洗脫劑選用 50-75%乙醇洗脫，收集洗脫液。
7.根據權利要求2所述的制備工藝，其特征在于步驟(4)所述高速逆流色譜純化中，以二氯甲烷-異丙醇-0. 02MNa2HP03為溶劑系統，其體積比為(15-23. 5):(7. 5-12. 5): (3-6)。
全文摘要
本發明提供披針葉黃華總生物堿和幾種高純度藥用物質的制備工藝，屬于中藥有效成分提取技術領域。藥用物質包括金雀花堿、黃華堿、鷹爪豆堿和N-甲基金雀花堿。本發明以披針葉黃華為原料，通過酸水提取、離子樹脂吸附、大孔樹脂富集得到總生物堿，用高速逆流色譜法和制備液相色譜對總生物堿進行分離純化，得到高純度的金雀花堿、黃華堿、鷹爪豆堿和N-甲基金雀花堿。本發明方法具有工藝簡單、快速、重現性好、制備量大等優點，易于產業化。
文檔編號A61P15/04GK102349940SQ20111022555
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月8日 優先權日2011年8月8日
發明者劉東鋒, 郭琴 申請人:南京澤朗醫藥科技有限公司