豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗及其制備方法

專利名稱：豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種豬二聯滅活疫苗，特別是指一種治療和預防豬乙型腦炎和豬細小病毒感染的二聯滅活疫苗，屬于獸用疫苗領域。
背景技術：
豬乙型腦炎病毒(SwineJapanese Encephalitis Virus, JEV)和豬細小病毒(Porcine Parvovirus Virus7PPV)是引起豬繁殖障礙的重要病原體之一,主要表現為母豬流產、不孕、產死胎、木乃伊胎及弱仔，公豬睪丸急性炎癥反應或不育，使養豬業損失巨大。JEV和PPV除單獨感染外，常常混合感染，對四川、重慶、湖北、河南等規模化豬場的混合感染調查，發現混合感染陽性率> 60 %。《豬細小病毒感染癥-乙型腦炎二聯油乳劑滅活疫苗研究》中，公開了將豬細小病 毒滅活油乳劑單苗和豬乙型腦炎滅活油乳劑單苗等量混合獲得的一種二聯滅活疫苗，但實際上，該文獻所提供是在豬細小病毒和豬乙型腦炎病毒的增殖過程中，分別使用了胎豬內臟和小鼠鼠腦，不僅增殖方法繁瑣，且依賴于動物器官組織，不利于擴大生產；而且在病毒液中存在著大量的雜蛋白影響疫苗的安全性和穩定性，特別是容易引起動物的過敏反應。中國專利的“豬細小病毒L株及在制備豬細小病毒病滅活疫苗中的用途”(CN101851609A)、“豬細小病毒病油乳劑滅活疫苗”(CN1706497A)和“豬細小病毒病油乳劑滅活疫苗”(CN 1704119A)使用了轉瓶培養的方式生產豬細小病毒。但這種轉瓶培養的技術方案存在著一些與傳統的轉瓶培養所共有缺點(I)轉瓶細胞培養，不能對培養液的養分、PH及溶氧等培養條件進行實時調整，因此無法保證細胞處于最佳培養狀態；(2)轉瓶細胞培養，操作程序繁瑣，有污染風險的暴露點多，生產工藝難放大；(3)轉瓶細胞培養，批間差異大，生產質量難以控制，產品質量不穩定。中國專利“應用生物反應器工業化生產豬乙型腦炎疫苗的方法”(CN 102038943A)和“應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法”(CN 102038945A)使用了微載體生物反應器培養豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒，進一步提高了生產的規模，但是由于用于增殖病毒的大多數傳代細胞，如BHK-21或ST細胞等，均為動物細胞，細胞外層為質膜，脆性大，因此在反應器中應務必減少剪切力。而上述專利中病毒培養方式使用的為攪拌式生物反應器，這種攪拌式的培養方式所產生的高剪切力會導致細胞損耗率高，進而影響到生物反應器的生產效率及細胞產量，特別會形成不必要的細胞碎片，容易引起動物過敏反應，影響疫苗的質量。因此，由于上述困難，目前市場上未有豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的生產和銷售，預防這兩種病毒引起的疫病時，需單獨接種JEV和PPV單苗，免疫程序復雜、成本較高。而且，由于二種病毒引起的疾病常常同時發生，單苗免疫效果也不盡如人意。因此，現實中迫切需要開發一種免疫性高、安全性好、免疫程序簡便的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗，特別是需要一種簡單方便、工藝易于放大的二聯滅活疫苗的制備方法。

發明內容
有鑒于此，本發明的主要目的提供一種豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備方法。本發明以免疫原性好、生長穩定、效價高的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒為毒種，采用潮汐式生物反應器大規模生產JEV和PPV抗原，通過抗原濃縮工藝，輔以高效的進口疫苗佐劑，制備成豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗，至少克服了現有技術中的如下缺點(I)克服了傳統疫苗毒株篩選中單純的細胞適應方法，采用細胞適應、細胞克隆和病毒克隆純化技術相結合，獲得的毒種免疫原性好、生長穩定、效價高，制備的二聯滅活在免疫抗體滴度、免疫持續期、疫苗保存期等方面優于目前市場使用的單苗。(2)克服了傳統的轉瓶培養規模小、質量難控、操作繁瑣的缺點，又克服了攪拌式生物反應器高剪切力弓I起的細胞損耗率高、疫苗質量受損的缺點。(3)克服了豬場為預防豬乙型腦炎和豬細小病毒感染，需單獨免疫JEV和PPV疫苗，簡化了免疫程序，降低豬的臨床應激反應，提高了疫苗的免疫效果。
_2] 技術方案因此，本發明提供了一種豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟I)在潮汐式生物反應器中，接種動物細胞至生物反應器內的微載體上，進行細胞的吸附培養；2)在細胞的吸附培養結束后進行細胞的擴增培養，將豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒分別接種到擴增培養的細胞上，進行病毒的吸附培養；3)在病毒的吸附培養結束后進行病毒的增殖培養；4)在接種的動物細胞病變(Cytopathic effect, CPE)達到75%以上時，收獲病毒液；5)將收獲的病毒培養液于_20°C凍融兩次，濃縮后滅活，獲得滅活的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒混合液；6)進行水相與油相的配置將豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒混合液作為水相，力口入乳化劑，乳化后獲得豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗。優選地，本發明所述微載體由選自聚酯、明膠或多糖的一種或幾種制成。優選地，本發明所述微載體以O. 5X106 5X106Cells/g載體的終密度接種細胞。優選地，本發明所述微載體的添加量為40 80g/L。優選地，本發明所述的豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，保藏號為V201119 ;所述豬細小病毒為HN-2011株，保藏號為V201118。優選地，本發明所述步驟2)中接種時的細胞濃度為O. 5X107 1.0X108cells/g載體。優選地，本發明所述步驟2)中所述豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒接種的感染復數為 O. 0001 I. 5。優選地，本發明所述步驟I)中所述的吸附培養和步驟2)中所述的擴增培養使用含3% 5% (V/V)牛血清的細胞培養液；步驟3)中所述的病毒吸附培養和步驟4)中所述的病毒增殖培養使用1% (V/V)牛血清的細胞培養液，其中所述的細胞培養液為選自DMEM、MEM、a -MEM、EMEM、1640、M199、F10和F12中的一種，所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。優選地，本發明所述在步驟I)至步驟2)的培養過程中控制葡萄糖含量范圍為I. O 4. 5g/L，溫度37. (TC，pH調節7. O 7. 5，溶氧調節40% 80%，二氧化碳濃度為5% 10%的條件下進行。優選地，本發明所述在步驟3)至步驟4)的培養過程中控制溫度36. 5°C，pH調節
7.O 7. 5，溶氧調節30% 80%，二氧化碳濃度為3% 5%的條件下進行。本發明的另一目的在于提供由上述制備方法獲得的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗，以及該二聯滅活疫苗在預防豬乙腦病毒和豬細小病毒感染中的應用。·
優選地，本發明所述的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗中，所用的豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，保藏號為V201119 ;所述豬細小病毒為HN-2011株，保藏號為V201118。本發明的另一目的在于提供一種豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，保藏號為V201119。本發明的另一目的在于提供一種豬細小病毒為HN-2011株，保藏號為V201118。本發明的另一目的在于提供獲得免疫原性好、生長穩定、效價高的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒毒種的培養方法。由上可以看出，首先，本發明采用細胞適應、細胞克隆和病毒克隆純化技術相結合，建立了獲得理想毒種的培養方法，獲得了二種免疫原性好、生長穩定、效價高的病毒株，即豬乙型腦炎病毒 SD-2011 株(Swine Japanese Encephalitis Virus),于 2011 年 6 月 9日保藏在中國典型培養物保藏中心(China Center for Type CultureCollection,簡稱CCTCC)，保藏編號 V201119 ;豬細小病毒 HN-2011 株(Porcine Parvovirus Virus)，于 2011年6月9日保藏在CCTCC，保藏編號V201118。本發明的篩選獲得的二種病毒株，不僅免疫性好，特異性強，而且這二種病毒無相互干擾的問題，從而使這二種病毒株制備的二聯滅活疫苗在免疫抗體滴度、免疫持續期、疫苗保存期等方面優于目前市場使用的單苗，這是別的病毒株不能替代的。其次，本發明還利用潮汐式生物反應器進行多種動物細胞培養，并增殖不同病毒的工藝流程，克服了以往轉瓶或攪拌式生物反應器的工藝不易放大、高剪切力、高成本等缺點。具有細胞培養條件實時可控、病毒產量高、污染率低、操作簡單、穩定性好，無外源因子污染、易于規模化生產的優點。本發明使豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的規模化生產工藝得以顯著提升，使得養殖場能夠應對日益增多的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒混合感染。


圖I為為本發明所使用的Tidecell潮汐式生物反應器結構圖。菌株保藏信息豬乙型腦炎病毒SD-2011株
保藏日期2011年6月9日，保藏地址中國武漢,武漢大學，中國典型培養物保藏中心，保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCCNO V201119 ；豬細小病毒HN-2011株保藏日期2011年6月9日，保藏地址中國武漢,武漢大學，中國典型培養物保藏中心，保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC)， 保藏編號CCTCCNO :V201118。
具體實施例方式以下通過具體實施例進一步說明本發明豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備方法中，使用的豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，于2011年6月9日保藏在中國典型培養物保藏中心(ChinaCenter for Type CultureCollection,簡稱CCTCC),保藏編號 V201119 ;使用的豬細小病毒為HN-2011株，于2011年6月9日保藏在CCTCC，保藏編號V201118。豬乙型腦炎病毒SD-2011株分離自母豬死胎的肝、腸系膜淋巴結、腎、腦等組織，為一種特異性強、免疫性好的病毒株，主要特征如下理化特性檢測將病毒液經56°C 30min滅活，乙醚、鹽酸、氫氧化鈉以及常用消毒劑處理后，接種單層BHK-21細胞，觀察CPE。結果表明，病毒對熱抵抗力弱，56°C 30min可完全滅活；病毒對脂溶劑、酸、堿以及常用消毒劑敏感，均可完全滅活。病毒的電鏡觀察病毒經BHK-21細胞培養72h后，將病變細胞上清經蔗糖梯度超速離心(30，000rmp/h)，純化病毒顆粒經2%磷鎢酸負染后，進行電鏡觀察。結果顯示，病毒顆粒為球形，具有囊膜，直徑40nm 60nm。間接免疫熒光法檢測取分離的毒株接種BHK-21細胞，在5% C02、37°C條件下培養48h，經丙酮固定后，進行間接免疫熒光檢測。結果顯示，病毒液感染的BHK-21細胞出現了特異性熒光，陰性對照無特異性熒光出現。特異性血清中和試驗將病毒液和豬乙型腦炎特異性血清(南京農業大學提供)中和后，接種BHK-21細胞，在5% C02、37°C條件下培養72h，收獲細胞培養液，經2次反復凍融，收集培養液。連續傳代3次，觀察CPE。結果顯示，病毒液通過豬乙型腦炎特異性血清中和后，無細胞病變。病毒的PCR基因擴增和序列測定參考國家標準“日本乙型腦炎病毒反轉錄聚合酶鏈反應試驗方法”(編號GB/T 22333-2008)進行基因序列分析，其方法包括設計引物、PCR、電泳、連接、轉化、單克隆鑒定、測序、序列比對。結果顯示，PCR擴增出了特異性條帶，大小為375bp，與預期一致；進一步的序列測定和分析證實，該毒株與目前我國流行的豬乙型腦炎病毒株的序列同源性在98%以上，為目前豬群流行毒株。BABL/c小鼠感染實驗將乙腦病毒10倍稀釋后，腦內接種4周齡的BABL/c小鼠(O. 03ml/只)，觀察小鼠的臨床癥狀。病毒接種小鼠后3天出現典型的腦炎癥狀，表現為興奮、轉圈、后肢麻痹、抽搐，并于7日內全部死亡。
病毒的毒力鑒定將病毒稀釋至106_°TCID5(l/ml，滴鼻接種懷孕45天左右的初產母豬5頭，每頭4ml，跟蹤觀察母豬的產仔情況。結果顯示，病毒接種懷孕母豬，可發生繁殖障礙，出現死胎、產弱仔等情況。豬細小病毒HN-2011株為采集母豬死胎的肝、腸系膜淋巴結、腎、腦等組織，為一種特異性強、免疫性好的病毒株，主要特征如下理化特性檢測將病毒液經56°C 30min滅活，乙醚、鹽酸、氫氧化鈉以及常用消毒劑處理后，接種單層ST細胞，觀察CPE。結果表明，病毒對熱抵抗力強，對脂溶劑、酸、堿以及常用消毒劑不敏感。病毒的電鏡觀察病毒經ST細胞培養72h后，將病變細胞上清經蔗糖梯度超速離心(40，000rmp/h)，純化病毒顆粒經2%磷鎢酸負染后，進行電鏡觀察。結果顯示，病毒外觀呈六角形或圓形，無囊膜，直徑約為20nm。
間接免疫熒光法檢測取分離的毒株接種ST細胞，在5% C02、37°C條件下培養48h，經丙酮固定后，進行間接免疫熒光檢測。結果顯示，病毒液感染的ST細胞出現了特異性熒光，陰性對照無特異性熒光出現。特異性血清中和試驗將病毒液和豬細小病毒特異性血清(南京農業大學提供)中和后，接種ST細胞，在5% C02、37°C條件下培養72h，收獲細胞培養液，經2次反復凍融，收集培養液。連續傳代3次，觀察CPE。結果顯示，病毒液通過豬細小病毒特異性血清中和后，無細胞病變。病毒的PCR基因擴增和序列測定參考行業標準“豬細小病毒聚合酶鏈反應操作規程”(編號SN/T 1874-2007)進行基因序列分析，方法包括設計引物、PCR、電泳、連接、轉化、單克隆鑒定、測序、序列比對。結果顯示，PCR擴增出了特異性條帶，大小為445bp，與預期一致；進一步的序列測定和分析證實，該毒株與目前我國豬細小病毒流行毒株的序列同源性在98%以上，為目前豬群流行豬細小病毒毒株。病毒血凝活性檢測取96孔微量反應板(U型)，用pH 7. 2的PBS將病毒培養液做2倍連續稀釋，加入反應板，并設PBS陰性對照和豬細小病毒抗原陽性對照，再加入O. 6%豚鼠紅細胞懸液，置室溫lh。結果顯示，病毒培養液能凝集豚鼠紅細胞，具有較高的血凝活性，而且隨著傳代培養次數的增加，病毒對細胞的適應性增強，病毒血凝價可達到21°以上。病毒的毒力鑒定將病毒稀釋至106_°TCID5°/ml，滴鼻接種懷孕45天左右的初產母豬5頭，每頭4ml，跟蹤觀察母豬的產仔情況。結果顯示，病毒接種懷孕母豬，可發生繁殖障礙，出現死胎、產弱仔等情況。本發明實施例中免疫原性好、生長穩定、效價高的豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒是經過細胞適應、細胞克隆和病毒克隆純化技術獲得的，技術方案包括以下步驟(I)適宜細胞系篩選將豬乙型腦炎病毒接種于BHK-21 (ATCC，編號CCL-10)、IBRS-2 (CCTCC，編號GDC0022)、ST (CCTCC,編號 GDC0007)、Vero (ATCC,編號 CCL-81)、C6/36 (ATCC, CRL-1660)及雞胚成纖維細胞，將豬細小病毒接種于PK-15 (CCTCC，編號⑶C0060)、ST(CCTCC，編號⑶C0007)、IBRS-2(CCTCC，編號⑶C0022)、CPK細胞(中國獸醫藥品監察所提供)和MVPK細胞(中國獸醫藥品監察所提供)，采用不同的培養基進行培養，控制培養條件為PH值為
7.O 7. 3，溫度為35 37°C，連續傳代培養8代，觀察病毒適宜細胞的情況，測定病毒增殖滴度，以病毒增殖滴度最高的細胞作為疫苗生產的適宜細胞系。結果顯示，豬乙型腦炎病毒在BHK-21細胞上的病變最明顯，病毒滴度最高，可達105_°TCID5(l/ml ;豬細小病毒在ST細胞上的病變最明顯，病毒滴度最高，可達105_ 3TCID5cZml。(2)細胞克隆篩選我們采用有限稀釋法對BHK-21和ST細胞進行了克隆，篩選到生長良好的BHK-21細胞10株，其中一株細胞對豬乙型腦炎病毒敏感，病毒滴度可達106_°TCID5(l/ml ;篩選到生長良好的ST細胞8株，其中一株細胞對豬細小病毒敏感，病毒滴度可達106_ 3TCID5ciAil。
(3)病毒克隆純化將BHK-21和ST細胞在6孔板上培養成單層，以細胞維持液分別將豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒作連續的10倍稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液分別接種BHK-21和ST單層細胞，每個稀釋度至少接種2孔，置37°C感作I 2h，使病毒充分吸附；吸附完畢后，吸出病毒液；取含中性紅的營養瓊脂糖，融化后降溫至37°C，注入6孔板上，使營養瓊脂糖覆蓋在細胞表面，平放30 60min，待瓊脂糖凝固，隨后置37°C繼續培養；在培養板上出現清晰的蝕斑時，即可進行挑斑；將挑取的豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒分別接種BHK-21和ST細胞，待其充分增殖以后，再作下一輪的蝕斑純化，并挑斑。如此操作3次，獲得純化的豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒。結果顯示，純化后的豬乙型腦炎病毒接種BHK-21細胞，病毒滴度可達107_°TCID5(l/ml以上；純化后的豬細小病毒接種ST細胞，病毒滴度可達107 2TCID5(l/ml以上。本發明實施例的制備二聯滅活疫苗技術方案包括以下步驟(I)細胞接種、吸附與培養將動物細胞懸液以O. 5X IO6 5X106Cells/g載體的終密度接種于載體罐中，設定生物反應器的參數進行細胞吸附與培養過程。其中，培養豬乙型腦炎病毒的動物細胞有BHK-21、IBRS-2、ST、Vero、C6/36及雞胚成纖維細胞，優選的是BHK-21細胞。豬細小病毒的培養細胞有ST、PK-15、IBRS-2、CPK和MVPK細胞，優選的是ST細胞。(2)病毒接種、吸附與增殖待細胞生長至O. 5 X IO7 I. O X 108Cells/g載體的密度時，更換細胞培養液，再將豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒病毒液分別接種到載體罐中，設定生物反應器的參數進行病毒吸附與增殖過程。(3)病毒收獲病毒液中培養細胞的CPE達75%以上時，進行病毒液的收獲。在本發明中，用于配制細胞培養液的培養基包括但不限于DMEM或α -ΜΕΜ，還可使用其它細胞培養基配制3“1^、1^、1640、11199、？10、？12等。在實施例中的步驟(I)中使用的培養液為含3% 5% (V/V)牛血清(美國PAA公司)的a-MEM(Modified EagleMedium)培養液或 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium)培養液(Invitrogen 公司)。步驟(I)中所述的載體為聚酯纖維載體(美國CESCO公司)，在載體罐中的加入量為 40 80g/L。較佳的，步驟(2)中病毒感染細胞時的感染復數(Multiplicity of Infection,Μ. O. I.)為 O. 0001 I. 5，優選 0. 01。
(4)病毒液的濃縮、滅活采用美國密理博公司的MINI-PELLIC0N標準超濾設備，分別對豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒進行超濾濃縮，最終病毒液體積為原體積的1/5 (即5倍濃縮)。病毒濃縮完畢后，分別采用甲醛溶液滅活，濃度為O. 1%，37°C滅活24h。(5) 二聯滅活疫苗的配制將收獲的滅活豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒混合液作為水相，加入乳化劑，乳化后獲得豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗。本發明實施例中使用了 Tidecell潮汐式生物反應器，結構見圖1，其主要組成部分包括1進料桶、2收料桶、3自動饋料儀、4pH/D0監控器、5恒溫振蕩箱、6培養液袋、7電腦控制器、8載體罐、9載體、10恒溫培養艙、11進/取樣管。各組成部分的主要功能如下載體罐放置于恒溫培養艙中，恒溫培養艙為載體罐提供一個恒溫的環境。載體罐 是細胞培養與病毒增殖的場所，細胞貼附生長在載體罐內部的載體上，當培養液泵入載體罐時，載體罐內的培養液液面上升并淹沒細胞，向細胞供給養分，并將細胞的新陳代謝產物從細胞上去除。當載體罐內的培養液被泵出時，載體罐中的培養液液面隨之下降，細胞露出，進行通風供氧。這個重復的運動使載體上的細胞能夠得到足夠的營養和氧氣，同時產生的代謝廢物如CO2能夠有效地被排出去。載體罐的蓋子上裝有數根管道，這些管道的作用包括人工手動方式向載體罐內注入液體(如接種細胞懸液等)或排出載體罐內的液體；由電腦控制器向載體罐注入氣體，氣體通常是壓縮空氣、氧氣及CO2三種的混合物，三種氣體在混合物中的比例可以自動調節控制，以適應細胞培養需要。電腦控制器可自動控制混合氣體向載體罐內的注入與排出，并為潮汐提供動力。培養液袋用以盛裝培養液，并通過管道與載體罐底部相通，通過與載體罐之間的液體流動，從而完成潮汐過程。培養液在潮汐過程中的灌流速度可通過電腦控制器進行調整。培養液的換液量是指在一次潮汐過程中，泵入或泵出載體罐的液體量，換液量的大小決定了載體罐內液面頂部和底部所處的位置。在培養液袋與載體罐之間相連通的管道上設有進/取樣管，可使用無菌注射器通過進/取樣管對培養液進行取樣，用以檢測其中的葡萄糖含量及病毒含量等指標。恒溫振蕩箱通過加熱與振蕩，來維持培養液袋內培養液溫度的恒定及成分的勻質性。收料桶及進料桶均通過自動饋料儀與培養液袋相連，培養液袋內的培養液需要進行收獲時，可通過自動饋料儀進入收料桶，而進料桶內的培養液則可以通過自動饋料儀對培養液袋進行補充。pH/DO監控器可以監測培養液袋內培養液的酸堿度(pH)及溶氧(DO)(溶氧是指氧氣在培養液中的溶解飽和度)，并通過向培養液袋內自動注入堿性溶液(如NaOH溶液或NaHCO3溶液)將培養液的pH值控制在合適范圍內。電腦控制器可以調節控制多種參數，如潮汐過程中載體罐內培養液的潮汐速率及頻率、恒溫培養艙的溫度、溶氧、CO2濃度(指載體罐內液面上方的混合氣體中CO2所占的體積百分比)等。對培養液中葡萄糖含量的調節是通過人工方式進行，根據對培養液中剩余葡萄糖的含量測定結果及培養液的總體積計算出需補加的葡萄糖量，然后通過注射器將高濃度的葡萄糖溶液從進/取樣管處注入培養液。實施例I豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備方法本實施例中所用的微載體為聚酯纖維，制苗用細胞系為BHK-21細胞和ST細胞，其中，豬乙型腦炎病毒使用BHK-21細胞增殖，而豬細小病毒使用ST細胞增殖。生物反應器為IOL載體瓶Tidecell潮汐式生物反應器。細胞生長液的配方BHK-21細胞的生長液為含5% (V/V)胎牛血清的DMEM(Invitrogen公司)；ST細胞的生長液為含5% (V/V)胎牛血清的a-MEM(Invitrogen公司)。細胞維持液的配方BHK-21細胞的生長液為含1% (V/V)胎牛血清的DMEM(Invitrogen公司);ST細胞的生長液為含1% (V/V)胎牛血清的a -MEM(Invitrogen·公司)。(I)細胞接種、吸附與培養IOL生物反應器中，加入無菌微載體聚酯纖維650g，以細胞密度為I. OX IO9ceIls/L(即細胞起始濃度相當于1.5X106cells/g載體)接入IOL生物反應器中，使之與微載體結合，生物反應器與裝有細胞生長液的37°C恒溫振蕩系統(容量500L)連接，培養條件為吸附程序培養液在載體罐中的液面上升速度5mm/s，在載體罐中的下降速度3mm/s，液面在反應器上下端點停滯時間為60s/10s。培養溫度37. 0°C，pH值調節7. 3，溶氧調節65%，二氧化碳濃度調節10%。自運行吸附程序計時，3h后啟動培養程序培養液在載體罐中的液面升降速度均為4mm/s，液面在反應器上下端點停滯時間為50s/50s。灌注培養3天，培養溫度37. (TC，采用7.5% (ff/V) NaHCO3自動調節pH值，使值控制在7. 2左右，溶氧為50%，二氧化碳濃度為5%。細胞接種后按每24h的時間點取載體樣和培養基樣，控制培養液中葡萄糖濃度I. O
4.5g/L。細胞接種之后每間隔12小時，用經滅菌的載體取樣棒從載體罐中對載體進行一次取樣，使用細胞計數器監測細胞生長密度。細胞接種后72小時，密度已達到3. 5X IOltl個/L(即相當于5. 4X107cells/g載體)，可用于病毒接種。(2)病毒的接種、吸附與增殖在IOL潮汐式生物反應器中，細胞培養至第3天，BHK-21細胞和ST細胞在生物反應器內的密度達3. 5 X IOltl個/L，把培養基恒溫備料槽體中的培養液換成維持液含有I %牛血清的DMEM或a -MEM培養基，按Μ. O. I.為O. 01分別接種豬乙型腦炎病毒(ΒΗΚ-21細胞)和豬細小病毒(ST細胞)。運行接毒程序細胞生長液在載體罐中的液面上升速度4mm/s，下降速度2mm/s，液面在反應器頂部停留55s，底部停留10s，病毒吸附3h。之后，運行病毒培養程序細胞維持液在載體罐中的液面上升與下降速度均為4mm/s，液面在反應器頂部停留50s，底部停留50s。培養溫度36. 50C ;采用7. 5% (WA)NaHCO3自動調節pH，使pH值維持在7. 2 ;溶氧為30%, 二氧化碳濃度為3%。病毒吸附程序結束后，繼續運行細胞培養程序，此時參數根據二氧化碳濃度利用7. 5 % (ff/V) NaHCO3自動調節pH值7. 3，溶氧為45 %，二氧化碳濃度為5 %。(3)病毒收獲
從病毒接種后的24小時開始，每間隔12小時對培養液(即病毒液)進行一次取樣，用顯微鏡法檢測病毒液的CPE。培養至接毒后第3天檢測到CPE大于75%，分別收獲病毒液。收獲時，先對載體瓶運行病毒液排除程序，使之全部流入恒溫振蕩系統中,對恒溫振蕩系統中的病毒液，采用50L的自動收集桶，按照5L/min的流速進行收集。經_20°C反復凍融2次后合并在收料桶。收獲的豬乙型腦炎病毒及豬細小病毒滴度都為108_°TCID5(l/ml。(4)病毒液濃縮、滅活收獲的病毒液，經美國密理博公司的MINI-PELLIC0N標準超濾設備，先對病毒液進行粗濾，濾除病毒液中的雜質；然后采用50KD和30KD截流分子量的超濾膜包，分別對豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒進行超濾濃縮，最終各病毒液體積為原體積的1/5 (即5倍濃縮)。濃縮完畢后，分別采用甲醛溶液滅活，使用滅活劑濃度為O. I %，37°C滅活24h，完全滅活豬乙型腦炎和豬細小病毒。(5) 二聯滅活疫苗的配置 I)油相制備取法國賽比克公司的疫苗佐劑ISA206、ISA15AVG和MS251CVG 3種佐劑，121°C滅菌30min后冷卻至室溫備用。2)水相配置檢驗合格的豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒滅活抗原混合液作為水相。3)油相與水相的配置將檢驗合格的豬乙型腦炎病毒和豬細小病毒滅活抗原混合液(按I : I體積比例混合均勻)與進口疫苗佐劑ISA206、ISA15AVG和MS251CVG 3種佐劑按I : I的體積比混合，在500 800rmp/min的轉速下攪拌IOmin,在終止攪拌前加入1% (W/V)硫柳汞溶液，使其終濃度為萬分之一，充分振蕩混勻，分裝后2 8°C保存即可完成豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備。根據后續的一系列實驗結果，疫苗佐劑ISA206的穩定性、效力、保存期等效果優于其他兩種佐劑(ISA15AVG和MS251CVG)，因此本發明優選ISA206佐劑為疫苗制備佐劑。實施例2豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的檢驗I. 二聯滅活疫苗的成品檢驗物理性狀檢驗a)外觀為乳白色或淡紅色均勻乳劑。b)劑型為雙向型，即水包油包水(W/0/W)。取清潔吸管，吸取少量疫苗滴于清潔冷水中，除第I滴外，均呈油滴狀不擴散。c)穩定性取疫苗IOml加入離心管中，經3，000rmp/min離心15min,不分層,管底析出水相< O. 5ml ;取疫苗在37°C左右放置21d，結果顯示不分層，沒有破乳現象。d)黏度用Iml清潔吸管(下口徑I. 2mm，上口徑2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗Iml令其垂直自然流出，記錄流出O. 4ml所需時間，結果顯示,3次流出時間均在8s內。無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄進行，無菌生長。支原體檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，無支原體生長。甲醛及硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》附錄進行，甲醛及硫柳汞含量不超過規定的含量。2. 二聯滅活疫苗的安全性試驗將實驗室試制的3批疫苗(批號分別為201001、201002和201003)分別進行了安全性試驗。試驗內容包括對3 5日乳鼠、10 20kg仔豬、5 6月齡青年后備母豬、種公豬、懷孕母豬分別進行I次單劑量接種、超劑量接種、單劑量重復接種的安全性試驗。試驗結果表明3批疫苗接種動物后，均未出現紅腫、瘙癢、破潰等局部反應，采食和精神狀態正常，無全身反應。將部分免疫動物28天撲殺，取注射部分組織制備成切片，觀察組織病變。結果顯示,3批疫苗免疫動物后，對注射部位無損傷，表明疫苗安全性好。3. 二聯滅活疫苗的效力試驗將實驗室試制的3批疫苗(批號分別為201001、201002和2 01003)分別進行免疫
效力試驗，內容包括最小免疫劑量試驗、HI抗體滴度與免疫攻毒保護相關性試驗、豚鼠的HI抗體滴度與豬的HI抗體相關性試驗。最小免疫劑量試驗將3批疫苗分別以O. 2ml、I. 0ml,2. Oml/頭免疫青年后備母豬、5 6月齡種公豬，28天后采血分離血清，測定HI抗體效價，結果見表I。結果顯示，免疫O. 2ml/頭，豬乙型腦炎HI抗體效價不低于I : 32 ;免疫I. Oml/頭，豬乙型腦炎HI抗體效價不低于I : 64 ;免疫2. Oml/頭，豬乙型腦炎HI抗體效價不低于I : 128。同時，免疫
O.2ml/頭，豬細小HI抗體效價不低于I : 32 ;免疫I. Oml/頭，豬細小HI抗體效價不低于I 64 ;免疫2. Oml/頭，豬細小HI抗體效價不低于I : 128。根據文獻報道，免疫后豬乙型腦炎HI抗體效價在I : 40以上，豬細小HI抗體效價在I : 64以上，即可達到攻毒保護效果。因此，二聯滅活最小免疫劑量是I. Oml/頭。表.I 二聯滅活疫苗最小免疫劑量試驗結果
免疫劑量描主刑±抗體水平(平均HI值)
(ml/頭)動物類型抗豬&型腦炎#毒(不同批次) 抗豬細小病毒(不同批次)_'_I_2_3_I_2_3
后備母豬 48.345.850.556.250.357.5
0.2
種公豬 38.637.345.244.545.348.6
后備母豬88.2110.795.8108.4134.5124.3 1.0 ,
種公豬105.4115.098.5115.4125.0108.5
后備母豬238.5176.2262.5273.3215.2311.4
2.0
種公豬166.4214.3236.8204.5251.4277.8HI抗體滴度與免疫攻毒保護相關性試驗將3批疫苗分別免疫后備母豬，在7、14、21、28日采血測血清HI抗體，取抗體為I : 16、1 32、1 64和I : 128的豬，以豬乙型腦炎病毒(含量106_°TCID5(l/ml)和豬細小病毒(含量106_°TCID5(l/ml)4ml分別滴鼻攻毒，在攻毒后5、7、9日采血，綜合三次測定結果，測定有無病毒血癥，并跟蹤母豬產仔情況，結果見表2。結果表明，當乙腦HI抗體效價不低于I : 32時，攻毒保護率可達90%以上；當細小HI抗體效價不低于I : 32時，攻毒保護率可達95%以上。考慮到疫苗臨床使用時的復雜情況，為保證疫苗實際使用的免疫保護效果，確定疫苗效力檢驗時，檢驗標準為免疫28日后，其血清豬乙型腦炎和豬細小HI抗體效價均不低于I : 64。表.2HI抗體滴度與免疫攻毒保護相關性試驗結果
權利要求
1.一種豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 1)在潮汐式生物反應器中，接種動物細胞至生物反應器內的微載體上，進行細胞的吸附培養； 2)在細胞的吸附培養結束后進行細胞的擴增培養，將豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒接種到擴增培養的細胞上，進行病毒的吸附培養； 3)在病毒的吸附培養結束后進行病毒的增殖培養； 4)在接種的動物細胞病變CPE達到75%以上時，收獲病毒液； 5)將收獲的病毒培養液于_20°C凍融兩次，濃縮后滅活，獲得滅活的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒混合液； 6)進行水相與油相的配置將豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒混合液作為水相，加入乳化劑，乳化后獲得豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗。
2.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述微載體由選自聚酯、明膠或多糖的一種或幾種制成。
3.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述微載體以O. 5 X IO6 5X 106cells/g的終密度接種細胞。
4.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述微載體的添加量為40 80g/L。
5.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，保藏號為V201119 ;所述豬細小病毒為HN-2011株，保藏號為V201118。
6.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟2)中接種時的細胞濃度為 O. 5X IO7 I. OX 108cells/g。
7.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述豬乙腦病毒和豬細小病毒接種的感染復數為O. 0001 I. 5。
8.根據權利要求I所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述的吸附培養和步驟2)中所述的擴增培養使用含3% 5% (V/V)牛血清的細胞培養液；步驟3)中所述的病毒吸附培養和步驟4)中所述的病毒增殖培養使用1% (V/V)牛血清的細胞培養液，其中所述的細胞培養液為選自DMEM、MEM、a-MEM、EMEM、1640、M199、FlO和F12中的一種，所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
9.根據權利要求I中所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，在步驟I)至步驟2)的培養過程中控制葡萄糖含量范圍為I. O 4. 5g/L，溫度37. 0°C，pH調節7. O 7. 5，溶氧調節40% 80%，二氧化碳濃度為5% 10%的條件下進行。
10.根據權利要求I中所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于，在步驟3)至步驟4)的培養過程中控制溫度36. 5°C, pH調節7. O 7. 5，溶氧調節30% 80%，二氧化碳濃度為3% 5%的條件下進行。
11.根據權利要求ι- ο任一項制備方法獲得的豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗。
12.根據權利要求11的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，保藏號為V201119 ;所述豬細小病毒為HN-2011，保藏號為V201118。
13.一種豬乙型腦炎病毒為SD-2011株，保藏號為V201119。
14.一種豬細小病毒為HN-2011，保藏號為V201118。
全文摘要
本發明提供了豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗的制備方法(1)在潮汐式生物反應器中，接種動物細胞至生物反應器內的微載體上，進行細胞的吸附培養與擴增培養過程；(2)將豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒接種到擴增培養的細胞上，進行病毒的吸附培養與增殖培養過程；(3)在接種的動物細胞CPE達到75％以上時，收獲病毒液；(4)將收獲的病毒培養液于-20℃凍融兩次，濃縮后滅活，加入乳化劑，乳化后獲得豬乙型腦炎病毒與豬細小病毒二聯滅活疫苗。本發明的優點是保藏的種毒的免疫原性好、生長穩定、效價高；采用了潮汐式生物反應器，分別培養和收獲高滴度的二種病毒，濃縮滅活后直接乳化配制，可以大規模連續生產二聯滅活疫苗。
文檔編號A61P31/14GK102886043SQ20111020386
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司