專利名稱：臍帶華通膠間充質干細胞在制備細胞移植材料中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物材料在制備醫用材料中的用途，特別涉及以人臍帶華通膠為原料制備的間充質干細胞在制備細胞移植材料以及組織工程種子細胞材料方面的應用。按本發明方法制備的醫用材料，包括細胞移植材料和種子細胞材料，可以用于對椎間盤退變性疾病的治療。
背景技術：
椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease, DDD)是一種常見病、多發病， 所引起的下腰痛常嚴重影響患者的工作及生活。椎間盤由纖維環包繞凝膠狀的髓核組織及上下的軟骨終板組成，其凝膠狀的髓核組織含有大量蛋白多糖及II型膠原，蛋白多糖可吸收水分增強張力，以對抗上下椎體的壓力。椎間盤退變時髓核內細胞數量減少，增殖能力降低，合成蛋白多糖及II型膠原等細胞外基質的能力下降，使髓核含水量低，影響了椎間盤的生物力學性能。目前對椎間盤退變的治療方法包括保守治療和手術治療。使用較多的髓核摘除術和脊柱融合術，能暫時緩解臨床癥狀，但遠期療效不理想，且有一定并發癥。近年來，建立在組織工程技術和細胞移植技術的治療策略，利用種子細胞、支架材料及參入各種細胞因子以修復退變椎間盤，展現了良好的前景。無論是組織工程技術還是細胞移植技術的應用，自體髓核細胞被認為是最理想的種子細胞，但髓核中細胞含量少，髓核細胞體外增殖能力差，其來源受到很大限制，不能滿足治療需要；而且，從相鄰椎間盤獲取自體髓核細胞會引起相應椎間盤的退變。因此，尋找一種擴增能力強，易于獲取的適用種子細胞是成為當前應用細胞移植技術治療椎間盤退變的關鍵問題。由于間充質干細胞具有無限增殖能力及多能分化潛能，被認為是當前最有前景的種子細胞來源。已有學者利用骨髓間充質干細胞誘導分化成為髓核細胞，能夠分泌蛋白多糖及II型膠原等功能蛋白。但成人骨髓中還存在著造血細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等多種細胞成分，間充質干細胞含量相對稀少，約為 1/105，分離純化相當困難。而且，骨髓中間充質干細胞的數量及增殖分化能力隨著年齡增長迅速遞減。其他來源的間充質干細胞如脂肪、腎臟、肺及胎兒臍血等間充質干細胞，或者含量稀少難以制備，或需創傷性手術才能獲得，因此限制了它們的臨床應用。本專利申請所稱“臍帶華通膠間充質干細胞”，或稱“來源于臍帶華通膠的間充質干細胞”，英文名稱為“Umbilical Cord Wharton's Jelly-Derived MSCs，UW-MSCs”，是指以臍帶華通膠為原材料經擴增技術傳代培養的細胞群。胎兒娩出母體后，胎盤連同臍帶的生理功能終結，繼胎兒之后被母體排出體外，成為人體排泄物。剖腹產是對胎兒生產過程的人工干預，在以手術方法從母腹中取出胎兒后，同時將胎盤連同臍帶作為遺棄物從母腹中取出。近年來，醫學界發現，存在于臍帶華通膠的間充質干細胞有許多潛在的利用價值。包括本申請人的在先專利申請“200910157731. 6臍帶華通膠間充質干細胞的制備方法及其產品”在內的若干文獻，公開了將華通膠間充質干細胞在體外誘導分化為脂肪細胞、骨細胞、 軟骨細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞及神經細胞的技術，但尚無人報告華通膠間充質干細胞具有向髓核細胞分化的潛能。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，將臍帶華通膠間充質干細胞應用于制備細胞移植材料或組織工程種子細胞材料，所制備的細胞移植材料或組織工程種子細胞材料可用于人椎間盤退行性病變的治療。本發明臍帶華通膠間充質干細胞在制備細胞移植材料和組織工程種子細胞材料中的應用，其方法包括以下工藝步驟以新生兒臍帶為材料制備華通膠間充質干細胞；分離培養正常髓核細胞。以實施椎間盤摘除術被摘除遺棄的椎間盤標本為材料分離制備髓核細胞；應用非接觸式或接觸式細胞共培養方法以髓核細胞誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞成為髓核細胞。本發明應用臍帶華通膠間充質干細胞為原材料制備用于人椎間盤退行性病變治療的細胞移植材料或組織工程種子細胞材料，其中的髓核細胞性能接近于自體髓核細胞， 是一種比較理想的同種異體移植醫用生物材料，顯示了諸多優點人臍帶華通膠來源的間充質干細胞可活躍增殖進行自我更新并具有多向分化潛能，相對于骨髓間充質干細胞，來源豐富，易于提取；細胞具有端粒酶活性，增殖能力強；不表達HLA-DR，低表達HLA-ABC，其免疫源性更低；其來源為臍帶，是嬰兒分娩后的遺棄物，避免了倫理道德問題。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1分離培養華通膠間充質干細胞取新鮮新生兒臍帶約30cm為材料，無菌儲存于D-Hanks液中，2_6°C保存。所取臍帶材料以足月產健康新生兒臍帶為優，可保證其臍帶發育良好；再則，優選剖腹產新生兒臍帶，較之陰道產感染率低。在超凈工作臺中用平衡鹽溶液洗去臍帶殘留血液，將臍帶剪成4cm大小節段，對每一節段均縱行剪開臍帶外膜，游離去除2條臍動脈和1條臍靜脈，取血管之間以及血管與外膜之間的華通膠組織，剪切成約Imm3大小碎塊，以平衡鹽溶液沖洗后，浸于濃度為0. 2% 膠原酶溶液中，膠原酶溶液，置37°C消化5小時，觀察消化情況，未見組織塊，消化液成粘稠狀，2500rpm離心10分鐘，棄掉上層上清液，剩余粘稠液體再用0. 25%胰蛋白酶37°C恒溫消化30分鐘，2500rpm離心10分鐘，棄上清液，加DMEM/F12培養基和胎牛血清，使胎牛血清濃度達到20%，于37°C、5%二氧化碳條件培養。細胞于第2天開始貼壁，第4天用含20% 胎牛血清的DMEM/F12完全培養基進行換液。以后每2 3天換液一次，待細胞融合達到 80-90%時，進行傳代培養。棄上清液，PBS洗細胞，0.25%胰蛋白酶消化5分鐘，IOOOrpm離心，進行細胞傳代。傳代后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基進行培養，每3天進行換液。細胞免疫表型鑒定，表達⑶73，⑶90，⑶105，⑶四，⑶166，HLA-ABC,不表達⑶；34，⑶45， HLA-DR0實施例2分離培養正常髓核細胞椎間盤摘除術是長久以來對椎間盤突出癥患者普遍實施的一種手術治療方法，手術過程是將移位的椎間盤摘除或部分切除。本發明是收集新鮮的經手術摘除的椎間盤標本，立即在超凈工作臺中分離出髓核組織，PBS清洗兩遍，除去殘留的血液。將髓核組織剪碎約1. Omm3大小，放入5ml離心管中，加入用DMEM/F12無血清培養基配制好的0. 2% II型膠原酶溶液，置37°C消化5小時，通過無菌不銹鋼絲網OOOmm)過濾組織碎片。細胞懸液 1000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，于 37°C、5%二氧化碳條件培養。細胞于第2天開始貼壁，以后每2 3天換液一次，待細胞融合達到80-90%時，進行傳代培養。傳代后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基進行培養， 每3天進行換液。實施例3非接觸式細胞共培養方法誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞用帶有插入層的Transwell六孔板進行非接觸式共培養，其插入層具有高密度孔徑，孔徑大小為0. 4 μ m，細胞因子能夠穿過，其材料為聚對苯二甲酸乙酯，細胞能夠粘附生長，插入層接種髓核細胞，六孔板下層接種華通膠間充質干細胞，細胞最優接種數量為，華通膠間充質干細胞2 X 104，髓核細胞為6X 104。培養7天后，收集華通膠間充質干細胞。實施例4接觸式細胞共培養方法誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞(1)利用活細胞染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(5， 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester, CFSE)標記華通膠間充質干細胞。 胰蛋白酶消化收集第三代細胞，PBS洗兩遍，計數細胞，用無血清DMEM/F12培養基懸浮細胞，調整細胞濃度為1. O X 106/ml，加入一定量10 μ mol/L濃度的CFSE溶液，使其終濃度為 5. 0mol/L，37°C孵育30分鐘，加入一定量胎牛血清使其終濃度為40%，終止反應10分鐘， IOOOrpm離心5分鐘，PBS洗兩遍，用于細胞共培養。(2)用普通六孔板進行接觸式共培養。細胞接種密度為6. OX 107cm2。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養基，37°C、5%二氧化碳培養箱中培養，隔2 3天換液。細胞最優接種數量為，華通膠間充質干細胞1. 5X104,髓核細胞4. 5X 104。細胞培養7天，每2 3天換液。(3)共培養7天后對接觸式共培養的細胞利用MoFlo高速流式細胞分選儀進行細胞分選。胰蛋白酶消化細胞，IOOOrpm離心5分鐘，PBS洗兩遍，用250 μ IPBS懸浮細胞，通過直徑30 μ m的無菌濾網，除去細胞團塊，進行高速流式細胞分選。激發波長為490 μ m，發射波長為530 μ m。熒光陽性細胞為華通膠間充質干細胞，熒光陰性細胞為髓核細胞。細胞收集于含PBS液的離心管中。在實際應用時，可任意選擇使用實施例3所述的非接觸式細胞共培養方法或者實施例4所述的接觸式細胞共培養方法。發明人根據實時定量PCR(ReaI-TimePCR)分析共培養后華通膠間充質干細胞基因表達變化，結果表明接觸式共培養或非接觸式共培養后，華通膠間充質干細胞表達髓核細胞標志基因(S0X-9、II型膠原和蛋白多糖)顯著上調；ELISA 方法分析共培養后的華通膠間充質干細胞合成及分泌蛋白多糖和二型膠原的能力顯著提高，證明華通膠間充質干細胞被誘導分化為髓核細胞。其作為一種醫用生物材料，可以按細胞移植方法治療椎間盤退行性變；也可作為組織工程種子細胞，復合組織工程支架，構建組織工程椎間盤，用于治療椎間盤退變性疾病。下述發明人所做的動物實驗，證明了本發明技術的實用性。實驗例華通膠間充質干細胞細胞移植治療椎間盤退變動物實驗
家犬在CT引導下穿刺椎間盤纖維環，進行椎間盤退變動物模型制作。術后6周 MRI顯示穿刺造模椎間盤發生退變，Pfirrmarm分級退變達到4級。家犬在麻醉下進行經接觸式共培養誘導分化的華通膠間充質干細胞移植，將1 X IO6細胞經注射器移植入退變椎間盤間隙，空白對照組注射aiilPBS溶液。2月后進行影像學觀察，實驗組椎間盤經細胞移植治療后，椎間盤退變由PfirrmanM級改善為3級，椎間盤高度增高；對照組椎間盤退變變為5 級，椎間盤間隙變窄。處死動物后，進行免疫組織化學分析表明，實驗組椎間盤髓核內蛋白多糖和二型膠原含量比對照組顯著增高。
權利要求
1.臍帶華通膠間充質干細胞在制備人椎間盤細胞移植材料和制備椎間盤組織工程種子細胞材料中的應用。
2.權利要求1所述的臍帶華通膠間充質干細胞的應用包括以下方法步驟以分娩后新生兒臍帶為材料制備華通膠間充質干細胞；以實施椎間盤摘除術被摘除遺棄的椎間盤標本為材料分離培養正常髓核細胞；以與髓核細胞共培養方法誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞。
3.根據權利要求2所述的臍帶華通膠間充質干細胞的應用，其特征在于，所述臍帶華通膠間充質干細胞的制備包括以下步驟取臍帶血管之間以及血管與外膜之間的華通膠組織，經膠原酶消化18小時、胰蛋白酶消化30分鐘，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基進行傳代培養。
4.根據權利要求2所述的臍帶華通膠間充質干細胞的應用，其特征在于，所述正常髓核細胞的分離培養包括以下步驟取新鮮椎間盤標本分離髓核組織，經II型膠原酶溶液消化5小時，再以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養。
5.根據權利要求2所述的臍帶華通膠間充質干細胞的應用，其特征在于，所述以與髓核細胞共培養方法誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞的方法為非接觸式方法，具體工藝步驟為使用聚對苯二甲酸乙酯制作的、孔徑大小為0. 4 μ m的Transwell六孔板進行共培養， 其插入層接種髓核細胞6 X IO4,下層接種華通膠間充質干細胞2 X IO4,培養7天后，收集華通膠間充質干細胞。
6.根據權利要求2所述的臍帶華通膠間充質干細胞的應用，其特征在于，所述以與髓核細胞共培養方法誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞的方法為接觸式方法，具體工藝步驟為用乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯標記華通膠間充質干細胞，與髓核細胞混勻，接種于普通六孔板，細胞接種密度為6. 0 X IOVcm2 ；培養7天后進行細胞分選，收集華通膠間充質干細胞。
7.根據權利要求6所述的臍帶華通膠間充質干細胞的應用，其特征在于，所述以接觸式誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞的方法中，接種的髓核細胞數量為華通膠間充質干細胞的3倍。
全文摘要
本發明涉及臍帶華通膠間充質干細胞在制備醫用生物材料中的應用。這種醫用生物材料可以用于人椎間盤細胞移植，也可用作椎間盤組織工程的種子細胞。它是以新鮮人臍帶為材料制備華通膠間充質干細胞，以實施椎間盤摘除術時被摘除的椎間盤標本為材料分離培養正常髓核細胞；再應用非接觸式或接觸式細胞共培養方法誘導分化臍帶華通膠間充質干細胞。
文檔編號A61L27/38GK102258809SQ20111019833
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月15日 優先權日2011年7月15日
發明者何勍, 吳劍宏, 張燕, 張超, 李海峰, 王德利, 王超峰, 辛洪奎, 阮狄克 申請人:中國人民解放軍海軍總醫院