專利名稱：桑色素-7-硫酸酯鈉抑制prl-3酶活性及在抗腫瘤轉移藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種桑色素-7-硫酸酯鈉抑制PRL-3酶活性及在抗腫瘤轉移藥物中的應用。
背景技術：
ISHTifflSIBI-3 (phosphatase of regenerating liver-3, PRL-3) 子蛋白酪氨酸磷酸酶，新近發(fā)現(xiàn)其與腫瘤轉移密切相關。目前PRL-3與腫瘤轉移的關系已經(jīng)十分明確。PRL-3基因最初被發(fā)現(xiàn)在人結直腸黏膜上皮細胞和結直腸原發(fā)癌細胞中低表達，而在淋巴結、肺和肝等轉移灶中持續(xù)高表達， 提示PRL-3基因與結直腸癌的轉移密切相關，其后眾多研究還表明PRL-3高表達與人胃癌、 食管癌、鼻咽癌、SKNAS成神經(jīng)細胞瘤、乳腺癌和黑色素瘤轉移有關，且raL-3高表達的癌癥患者預后情況遠差于PRL-3低表達患者。另外體內(nèi)和體外實驗也表明高表達PRL-3與腫瘤轉移生物學行為相關。同時國內(nèi)外對PRL-3相互作用蛋白和PRL-3在腫瘤轉移中的信號轉導途徑已進行了較深入的研究。Peng L等通過酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)PRL-3能與整合素結合并通過ERK1/2 和MMP-2信號途徑促進結腸癌的侵襲轉移能力，Ming J等研究報道PRL-3能通過上調(diào)ERK 磷酸化水平并激活Mio-A/C活性促進肺癌細胞的血管生成和轉移能力；Wang L報道姜黃素能通過抑制Src磷酸化而下調(diào)PRL-3的表達，從而抑制黑色素瘤細胞的轉移相關能力。因此&叫Q等提出PRL-3在篩選抗腫瘤轉移藥物方面是一個具有吸引力的分子靶點，其抑制劑研究具有巨大的臨床應用價值。韓國學者Ahn JH通過化學合成方法得到多種羅丹寧衍生物，發(fā)現(xiàn)2個具有一定抑制作用的PRL-3抑制劑。Moon MK從紅藤仔草中分離得到的2-甲基-1，3，6-三羥基-8，9 蒽醌對PRL-3酶也具有較好的抑制作用，IC50為1. 3 μ g/ml。我們對桑色素進行結構改造， 分離得到了水溶性的桑色素-7-硫酸酯鈉，對PRL-3酶具有很好的抑制作用，IC5tl值達到 0. 94 μ mol/L,并抑制腫瘤細胞體外侵襲和運動能力。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，目前暫無桑色素-7-硫酸酯鈉抑制PRL-3酶活性及抑制腫瘤細胞體外轉移相關能力的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種桑色素-7-硫酸酯鈉抑制PRL-3酶活性及在抗腫瘤轉移藥物中的應用，本發(fā)明應用基因工程技術得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通過PRL-3 酶抑制劑篩選模型，篩選得到一種半合成的桑色素-7-硫酸酯鈉對PRL-3酶活性的具有明顯的抑制作用，IC50值為0.94 μ mol/L，抑制效果大大強于其母體桑色素，也優(yōu)于國外研究報道的其它化合物或天然產(chǎn)物，同時Transwell小室法測定結果表明桑色素_7_硫酸酯鈉也能抑制腫瘤細胞的體外侵襲和運動能力，Western blot和熒光定量PCR結果顯示桑色素-7-硫酸酯鈉能特異性抑制PRL-3蛋白和mRNA表達，而不抑制PRL-3同家族成員PRL-I 和PRL-2蛋白和mRNA的表達。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術方案是通過基因工程技術得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通過測定PRL-3酶水解底物DiFMUP中磷酸基團生成DiFMU的熒光強度，計算桑色素-7-硫酸酯鈉對PRL-3酶活性的抑制作用，并采用半數(shù)效量概率單位法計算其IC50值，然后通過Transwell小室法測定桑色素_7_硫酸酯鈉抑制腫瘤細胞的體外轉移能力，Western blot和熒光定量PCR分析桑色素-7-硫酸酯鈉對PRL-3表達的影響，可應用于制備PRL-3酶抑制劑的陽性對照試劑或化合物，以及在藥物中，作為其中一個組分或前體用于制備抗腫瘤轉移藥物。
具體實施例方式實施例11.人PRL-3蛋白的表達、純化與酶動力學分析根據(jù)Genebank公布的NM_03261 編碼序列，應用生物學信息軟件設計PRL-3特異性上下游引物，以人卵巢癌細胞總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，將回收純化的PRL-3cDNA片段和pCold II質粒用限制性內(nèi)切酶 BamHI和HindIII雙酶切，將線性化的載體與目的片段按1 3的摩爾比混合，用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，取適量連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細菌，隨機挑選Amp抗性菌落擴增后堿裂解法小量提取質粒，酶切鑒定重組質粒pColdII-His-PRL-3，將鑒定無誤的重組質粒pCold II-His-PRL-3轉化人ArcticExpress E. coli后，以含Amp的LB培養(yǎng)液、37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)至0D600值達到約0. 4 0. 5，15°C保存30min，加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG進行誘導，15°C培養(yǎng)Mh，離心收菌，細菌裂解液裂解，取上清液進行 SDS-PAGE電泳和Western Blot以分析目的蛋白，在證實目的蛋白表達后，對上清液進行針對His-tag的M-NTA親和純化回收，然后進行酶活性分析，結果表明純化的PRL-3蛋白具有磷酸酶活性。2.桑色素-7-硫酸酯鈉對PRL-3酶活性的影響參照EnzChek Phosphatase Assay Kit(E12020)說明書進行。加入 8ymol/L DiFMUP (緩沖體系20mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0,5mmol/L DTT,0. 01% Triton X-100 和 2mmol/LEDTA2Na) 100 μ 1 作為酶反應底物于96孔酶標板中，再加入不同濃度的桑色素-7-硫酸酯鈉2 μ 1至終濃度為0. 625，1. 25， 2. 5，5，10和20 μ mol/L,再加入4. 0 μ gPRL-3酶100 μ 1，充分混勻，室溫避光反應5min,用 0. 5mo VLNa3VO4抑制劑2 μ 1終止反應。Varioskan Flash掃描式多功能讀數(shù)儀測定每孔中PRL-3酶水解底物DiFMUP中磷酸基團生成DiFMU的熒光強度(激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為358nm和455nm)。結果顯示桑色素_7_硫酸酯鈉能明顯抑制PRL-3酶活性，IC50值為 0. 94ymol/L。3.桑色素-7-硫酸酯鈉對高轉移卵巢癌細胞H0-8910PM細胞運動能力的影響 Transwell小室PVPF膜下表面涂纖粘蛋白Fibronectin 5 μ g，上室加含BSA的無血清培養(yǎng)基0. 5ml，下室加入0. 6ml含1 % BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后加入1 X IO5個細胞于上室中，再分別加入不同濃度桑色素-7-硫酸酯鈉1 μ 1，使其終濃度分別為10、20和 4(^11101/1，對照組加入等量的？85。37°C>5% CO2溫箱內(nèi)孵育6h。^Transwell小室取出， 濾膜用甲醇固定，蘇木精染色，水洗，伊紅染色，水洗，用PBS浸濕的棉簽擦去濾膜內(nèi)表面的細胞；用封片膠將濾膜封于載玻片上，于400 X顯微鏡下計數(shù)穿過PVPF濾膜的細胞數(shù)。每膜計數(shù)上下左右中5個隨機不同視野，每組平行設3個濾膜。
運動抑制率淨二 (1_給藥組穿膜細鮮均數(shù))xl_ J；對照組穿膜細胞平均數(shù)結果顯示用終濃度10、20和40 μ mol/L的桑色素_7_硫酸酯鈉處理H0-8910PM細胞他后，細胞體外運動能力明顯降低，其抑制率分別是08.5 士 6.9)%、(37.8 士 8.3)%和 (55. 9 士 7. 0) %。4.桑色素-7-硫酸酯鈉對高轉移卵巢癌細胞H0-8910PM細胞侵襲能力的影響 Transwell小室PVPF膜上表面涂5 μ g Matrigel，下表面涂纖粘蛋白Fibronectin 5 μ g, 干燥過夜。其余步驟參照運動實驗進行。結果顯示用終濃度10、20和40 μ mol/L的桑色素-7-硫酸酯鈉處理H0-8910PM細胞Mi后，明顯抑制H0-8910PM細胞侵襲人工基底膜成分 Matrigel 的能力，其抑制率分別是(19. 0士3. 9)%、(33. 5士8. 1) %和 1 士8. 9)%。5. Western Blot分析桑色素_7_硫酸酯鈉對高轉移卵巢癌細胞H0-8910PM細胞中 PRL-I，PRL-2和PRL-3蛋白表達影響取對數(shù)生長期的H0-89IOPM細胞，稀釋成每毫升1 X IO6 個，接種于50mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿5mL。待細胞貼壁后，分別以0.、10，20和40μπιο1/ L的桑色素-7-硫酸酯鈉處理Η0-8910ΡΜ細胞Mh，收集細胞，PBS洗滌2次，加入預冷的細胞裂解液100 μ L，用細胞刮將細胞刮下，并轉移至預冷的1. 5mL離心管中。置于碎冰上冰育 20min后，于4°C、12000Xg離心15min。BCA法測定上清液中蛋白含量。蛋白樣品和上樣緩沖液按3 1的比例混合，100°C水中煮沸5min使蛋白質變性。SDS-PAGE電泳后電轉移至PVPF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入PRL-I或PRL-2或PRL-3于室溫孵育池，用TBS緩沖液洗3次，每次lOmin，加入辣根過氧化合物酶標記抗體于室溫孵育池，用TBS洗3次，每次 lOmin，加發(fā)光試劑顯影、曝光。結果顯示桑色素-7-硫酸酯鈉能抑制PRL-3蛋白表達，而不抑制PRL-3同家族成員PRL-I和PRL-2蛋白表達。6.熒光定量PCR分析桑色素-7-硫酸酯鈉對高轉移卵巢癌細胞H0-8910PM細胞中PRL-l，PRL-2和PRL-3mRNA表達影響參照熒光定量實時PCR要求，設計引物。用0.、10， 20和40 μ mol/L的桑色素_7_硫酸酯鈉處理H0-8910PM細胞Mh，提取H0-8910PM細胞總 RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。按反轉錄試劑盒操作流程行反轉錄實驗。配實時 PCR反應體系，Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀上進行PCR反應，采用比較閾值法對實時定量RT-PCR結果進行定量分析。結果顯示桑色素-7-硫酸酯鈉能抑制PRL-3mRNA表達，而不抑制PRL-3同家族成員PRL-I和PRL-2mRNA表達。桑色素-7-硫酸酯鈉的性能抑制PRL-3酶活性，抑制腫瘤細胞體外侵襲和運動能力。桑色素-7-硫酸酯鈉的用途用于抑制PRL-3酶活性的陽性對照試劑或化合物；用于制備預防腫瘤轉移的藥物。具體的使用形式1.可制成粉劑，用水或生理鹽水溶解；2.可制成注射針劑，按注射針劑要求使用；
3.可制添加糖或甜味劑的飲料，制成口服液產(chǎn)品。用法1.可單一使用制成PRL-3酶抑制劑的陽性對照試劑。2.可作為抗腫瘤轉移藥物其中一個組分使用。3.可作為前體進行改造用于研發(fā)抗腫瘤轉移藥物。
權利要求
1.一種桑色素-7-硫酸酯鈉抑制PRL-3酶活性及在抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特征是通過基因工程技術得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通過測定PRL-3酶水解底物 DiFMUP中磷酸基團生成DiFMU的熒光強度，計算桑色素_7_硫酸酯鈉對PRL-3酶活性的抑制作用，并采用半數(shù)效量概率單位法計算其IC50值，然后通過Transwell小室法測定桑色素-7-硫酸酯鈉抑制腫瘤細胞的體外轉移能力，Western blot和熒光定量PCR結果顯示桑色素-7-硫酸酯鈉能特異性抑制PRL-3蛋白和mRNA表達，而不抑制PRL-3同家族成員PRL-I 和PRL-2蛋白和mRNA的表達，可應用于制備PRL-3酶抑制劑的陽性對照試劑或化合物，以及在藥物研發(fā)中，作為其中一個組分或前體用于制備抗腫瘤轉移藥物。
2.根據(jù)權利要求1所述的桑色素-7-硫酸酯鈉抑制PRL-3酶活性及在抗腫瘤轉移藥物中的應用，其特征是可制成粉劑；可制成注射針劑；可制添加糖或甜味劑的飲料。
全文摘要
一種桑色素-7-硫酸酯鈉抑制PRL-3酶活性及在抗腫瘤轉移藥物中的應用，用基因工程技術得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，篩選得到一種水溶性的桑色素-7-硫酸酯鈉對PRL-3酶活性具有明顯的抑制作用，抑制效果大大強于其母體桑色素，也優(yōu)于其它化合物或天然產(chǎn)物，Transwell小室法測定結果表明該化合物能明顯抑制腫瘤細胞的體外侵襲和運動能力，Western blot和熒光定量PCR結果顯示該化合物能特異性抑制PRL-3蛋白和mRNA表達，而不抑制PRL-3同家族成員PRL-1和PRL-2蛋白和mRNA的表達。本發(fā)明提供的該化合物對PRL-3在腫瘤轉移中的作用研究以及抗腫瘤轉移藥物的設計與研發(fā)具有很高的應用價值，可應用于制備PRL-3酶抑制劑的陽性對照試劑或化合物，以及在藥物開發(fā)中作為其中一個組分或前體用于制備抗腫瘤轉移藥物。
文檔編號A61P35/04GK102302482SQ20111018468
公開日2012年1月4日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權日2011年6月29日
發(fā)明者何太平, 劉 文, 梁念慈 申請人:廣東醫(yī)學院