專利名稱：一種從紫草中分離出萘醌類有效成分的方法
技術領域：
本發明涉及從藥用植物中提取分離萘醌類成分的技術領域，更具體涉及一種從紫草抗腫瘤活性成分-萘醌類的提取方法，這些活性成分不僅有抗腫瘤的作用，還有抗炎、解熱、鎮痛、鎮靜、抗病原微生物、抗生育作用、保肝等作用，能廣泛用于醫藥衛生行業。
背景技術：
紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebaieuchroma (Royle) Johnst的干燥根，紫草中主要藥效成分為萘醌類色素，包括紫草素、去氧紫草素、β，β 二甲基丙烯酰紫草素、乙酰紫草素等。從紫草中分離出萘醌類有效成分，其藥理作用不僅有抗病原微生物作用；抗病毒作用；抗炎作用；消化道平滑肌的作用。主要有抗癌作用，由新疆紫草中提得的紫草素 (Shikonin)，510mg/kg可完全抑制腹水型肉瘤18(1細胞的生長。10mg/kg可延長帶瘤小鼠生命92. 5%。紫草素(Shikonin)對小鼠肝癌H22和Lewis肺癌的放射增敏作用。目前，對紫草萘醌成分的提取純化方法有較多的研究報道，但大多是傳統的提取分離工藝，分離時間長，提取雜質多；溶劑耗損大；不易分離得到高純度的藥用成分。本專利提供的提取分離方法，是利用Dr Flash II型中低壓制備色譜快捷、高效、量大的一種優良提取分離工藝，也能獲得純度較高的有效成分。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種從紫草中分離出萘醌類有效成分的方法，方法易行，操作簡便，該方法是利用中低壓制備色譜；高效分離抗癌活性成分的優化工藝，且含量在95%以上·。為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施 一種從紫草中分離出萘醌類有效成分的方法，其步驟是
1、 將紫草干燥莖塊烘干、粉碎后用乙醇超聲提取，乙醇的倒入量為藥材重量的5 10 倍。置入超聲儀中超聲3(T50min，再將超聲后的物質過濾，回收過濾溶液中的溶劑。將回收的溶劑再倒入三角瓶，繼續超聲，重復本步驟3飛次，得到用乙醇提取的干浸膏。2、分別用溶劑石油醚和乙酸乙酯將乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量為浸膏的4 7倍，反復萃取3 5次，至萃取液無色，分別將石油醚和乙酸乙酯萃取液過濾；回收過濾溶液中的溶劑，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏。3、將以上二種浸膏用等體積的乙酸乙酯超聲溶解，用其1 3倍量的400-500目硅膠拌樣，蒸干至無乙酸乙酯氣味；取400ml、1500mL Flash柱(也可以用玻璃和不銹鋼柱) 各一個，400ml的柱裝拌樣硅膠，1500ml的柱僅裝硅膠作為分離柱。二根柱都干法上樣；分別用石油醚洗脫至柱平衡，再將二根柱串聯，串聯后的柱子接到中低壓(0.廣5兆帕)制備型色譜柱上。中低壓(0. Γ5兆帕)制備色譜柱的制備條件為泵壓力100-200帕，流速IOOml/ min，檢測器的監控波長為395nm，檢測器的收集波長為280nm，死體積為7mL。4、洗脫劑為石油醚含B (B是按乙酸乙酯丙酮=4:1混合的溶劑)2% (v/v),6%(ν/ν), 10% (ν/ν) 的比例洗脫，每組洗脫劑中還加上0.2% (ν/ν)的甲酸，即，洗脫劑為1份 B加49份石油醚加0. 1份甲酸混合，在中低壓(0. Γ5兆帕)色譜柱的熒屏監控圖下洗脫柱子，并收集流份，按監控圖出現的譜峰收集，再以薄層色譜(TLC)檢識輔助，取TLC檢測紫色斑點中Rf值一致的流份，合并流分后得到六個粗的化合物。5、將中低壓(0. Γ5兆帕)制備色譜上串聯的2根柱子換成C18柱、將六個粗品化合物分別用甲醇溶解，注入C18柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脫，收集流分，蒸干，六個化合物得到進一步的純化，經高壓液相色譜檢測六個化合物的質量分數為95%以上。6、六個化合物經過堿性反應產生紫色，無色亞甲藍顯色試驗呈陽性，說明為萘醌成分(堿性反應的方法25% (WZV)Na2COyK溶液；4% (v/v) HCHO水溶液；5% (ν/ν)鄰二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加熱至溫度在50 70°C，1 4分鐘內產生紫藍色。無色亞甲藍顯色試驗，在薄層色譜TLC的板上用無色亞甲藍溶液噴霧，板子上出現藍色的斑點)。7經核磁共振譜、紅外、質譜分析確證六個單體分別為去氧紫草素 (deoxyshikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β -羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)；異丁酰紫草素
(isobuytyrlshikonin), β , β 一二甲基丙烯酰紫草素
(β，β 一 dimethylacrylshikonin)。并依次命名單體的化合物為 ZC I ；ZC II ；ZCIII ； ZCIV ；ZC IV ；ZC VI。經高壓液相色譜測試，六個化合物的純度分別是ZC I為99. 62% ；ZC II 為 99. 02% ；ZC III為 99. 5% ；ZC IV為 99. 31% ；ZC V 為 99. 3% ；ZC VI為 99. 2%。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
1)與現有的常壓制備技術相比現有的制備色譜，大多數為常壓制備色譜，常壓制備色譜雖然有容易操作、方便，不要額外購買儀器，只要購買玻璃柱和展開劑等優點，但柱填充料的顆粒如硅膠一般在100 200目，分離效果差，大多數要2次或多次過柱，而且柱洗脫時間長，耗時耗力。而中低壓(0.廣5兆帕)制備色譜，柱填充料的顆粒細，如硅膠可以用 400 500目(顆粒細更容易分離單體)，在中低壓立下，流速會大大加快，分離時間短，達到好的分離效果。2)與現有的高壓制備技術相比高壓制備色譜(10-30兆帕)中色譜柱的材料顆粒均很細一般為5微米，制備量有限.而且成本過高，目前只用于分離實驗級的毫克的量。中低壓(0. Γ5兆帕)制備色譜是可以制備100克級以上的單體，上樣量大；運行成本低，儀器要求配置低，而且用戶可以自己裝柱；還可使用預裝住，利用薄層色譜TLC可以快速的建立分離方法。3)常壓制備色譜與環境直接連接，試劑容易揮發，污染環境，而中低壓制備洗脫劑可以密閉循環使用，不會對環境污染。
具體實施例方式一種紫草抗腫瘤活性成分_萘醌類的提取方法，其具體步驟是
A、將Ikg紫草干燥莖塊烘干、粉碎后用乙醇超聲提取，乙醇倒入量為藥材重量的5 10 倍。置入超聲儀中超聲30或34或39或44或47或50min，再將超聲后的物質過濾，回收過濾溶液中的溶劑。將回收的溶劑再倒入三角瓶，繼續超聲，重復本步驟3或4或5次，得到用乙醇提取的干浸膏55g，得率為紫草干燥莖塊重量的5. 5%。 B、分別用溶劑石油醚和乙酸乙酯萃取乙醇浸膏，萃取溶劑石油醚和乙酸乙酯的量為浸膏的4或5或6或7倍，萃取至液體無色，分別將石油醚和乙酸乙酯萃取液過濾；回收過濾溶液中的溶劑，得到石油醚萃取浸膏為Hg，乙酸乙酯萃取浸膏16. 5g
C、將以上A、B步驟獲得的二種浸膏用等體積的乙酸乙酯超聲溶解，用其1或2或3倍量的400或450或500目硅膠拌樣，蒸干至無乙酸乙酯氣味；取400ml、1500mL Flash柱(也可以用玻璃和不銹鋼柱)各一個，400ml的柱裝拌樣硅膠，1500ml的柱僅裝硅膠作為分離柱。 二根柱都干法上樣；分別用石油醚洗脫至柱平衡，再將二根柱串聯，串聯后的柱子接到中低壓制備型色譜柱上。中低壓(0. 1或0.5或1或2或3或4或5M bar)制備色譜柱的制備條件為泵壓力100或150或200 Psi，流速lOOml/min，檢測器的監控波長為395nm，檢測器的收集波長為280nm，死體積為7mL。D、洗脫劑為石油醚含B (B為乙酸乙酯丙酮=4:1) 2%，6%，10%的比例洗脫，每組洗脫劑中還加上0. 2%的甲酸，即洗脫劑為1份B加49份石油醚加0. 1份甲酸，在中低壓色譜柱的熒屏監控圖下洗脫柱子，并收集流份，按監控圖出現的譜峰收集，再以TCL檢識輔助，取TCL檢測紫色斑點中Rf值一致的流份，合并流分后得到六個粗的化合物。E、將中低壓(0.1或0.5或1或2或3或4或5M bar)制備色譜上串聯的2根柱子換成C18柱、將六個粗品化合物分別用甲醇溶解，注入C18柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脫，收集流分，蒸干，六個化合物得到進一步的純化，經高壓液相色譜檢測六個化合物的質量分數為95%以上。F、六個化合物經過堿性反應產生紫色，無色亞甲藍顯色試驗呈陽性，說明為萘醌成分(堿性反應的方法25%(WZV)Na2CO3水溶液；4%HCH0(v/v)水溶液；5%(ν/ν)鄰二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加熱，在1 4分鐘內產生紫藍色。無色亞甲藍顯色試驗，在薄層色譜TLC的板上用無色亞甲藍溶液噴霧，板子上出現藍色的斑點)。G經核磁共振譜、紅外、質譜分析確證6個單體分別為去氧紫草素 (deoxyshikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β -羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)；異丁酰紫草素
(isobuytyrlshikonin), β , β 一二甲基丙烯酰紫草素
(β , β 一 dimethylacrylshikonin)。并依次命名單體化合物為 ZC I ；ZC II ；ZC III ； ZC IV ；ZC IV ；ZC VI。經高壓液相色譜測試，六個化合物的純度分別是ZC I為99. 62% ；ZC II 為 99. 02% ；ZC III為 99. 5% ；ZC IV為 99. 31% ；ZC V 為 99. 3% ；ZC VI為 99. 2%。
權利要求
1. 一種從紫草中分離出萘醌類有效成分的方法，其步驟是A、將紫草干燥莖塊烘干、粉碎后用乙醇超聲提取，乙醇的倒入量為藥材重量的5 10 倍，置入超聲儀中超聲3(T50min，再將超聲后的物質過濾，回收過濾溶液中的溶劑，將回收的溶劑再倒入三角瓶，繼續超聲，重復本步驟3飛次，得到用乙醇提取的干浸膏；B、分別用溶劑石油醚和乙酸乙酯將乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量為浸膏的 4 7倍，反復萃取3 5次，至萃取液無色，分別將石油醚和乙酸乙酯萃取液過濾；回收過濾溶液中的溶劑，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏；C、將(A)和(B)步驟的浸膏用等體積的乙酸乙酯超聲溶解，用其1 3倍量的400-500 目硅膠拌樣，蒸干至無乙酸乙酯氣味；取400ml、1500mL Flash柱各一個，400ml的柱裝拌樣硅膠，1500ml的柱僅裝硅膠作為分離柱，二根柱都干法上樣；分別用石油醚洗脫至柱平衡， 再將二根柱串聯，串聯后的柱子接到中低壓0.廣5兆帕制備型色譜柱上，中低壓0.廣5兆帕制備色譜柱的制備條件為泵壓力100-200帕，流速lOOml/min，檢測器的監控波長為395nm， 檢測器的收集波長為280nm，死體積為7mL ；D、洗脫劑為石油醚含B=B是按乙酸乙酯丙酮=4:1混合的溶劑2%v/v，6%v/v，10%v/v 的比例洗脫，每組洗脫劑中還加上0. 2%v/v的甲酸，洗脫劑為1份B加49份石油醚加0. 1 份甲酸混合，在中低壓0. Γ5兆帕色譜柱的熒屏監控圖下洗脫柱子，并收集流份，按監控圖出現的譜峰收集，再以薄層色譜檢識輔助，取TLC檢測紫色斑點中Rf值一致的流份，合并流分后得到六個粗的化合物；E、將中低壓0.廣5兆帕制備色譜上串聯的2根柱子換成C18柱、將六個粗品化合物分別用甲醇溶解，注入C18柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脫，收集流分，蒸干，六個化合物得到進一步的純化；F、六個化合物經過堿性反應產生紫色，無色亞甲藍顯色試驗呈陽性，說明為萘醌成分 堿性反應的方法25%W/vNa2C03水溶液；4%v/vHCH0水溶液；5%v/v鄰二硝基苯的苯溶液各1 滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加熱至溫度在50 70°C，1 4分鐘內產生紫藍色；G、經核磁共振譜、紅外、質譜分析確證六個單體分別為去氧紫草素、紫草素、乙酰紫草素、羥基異戊酰紫草素；異丁酰紫草素、β，β 一二甲基丙烯酰紫草素，并依次命名單體化合物為ZC I ；ZC II ；ZC III ；ZC IV ；ZC IV ；ZC VI，經高壓液相色譜測試，六個化合物的純度分別是 ZC I 為 99. 62% ；ZC II 為 99. 02% ；ZC III為 99. 5% ；ZC IV為 99. 31% ；ZC V 為 99. 3% ； ZC VI為 99. 2%ο
全文摘要
本發明公開了一種從紫草中分離出萘醌類有效成分的方法，其步驟A、將紫草干燥莖塊烘干、用乙醇超聲提取，超聲，得到干浸膏；B、用溶劑石油醚和乙酸乙酯將乙醇干浸膏萃取，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏；C、將浸膏用等體積的乙酸乙酯超聲溶解，蒸干至無乙酸乙酯氣味，串聯后的柱子接到中低壓制備型色譜柱上；D、洗脫劑為石油醚，在中低壓色譜柱的熒屏監控圖下洗脫柱子，收集流份，得到化合物；E、將中低壓制備色譜上串聯，將化合物用甲醇溶解，化合物得純化；F、化合物經過堿性反應產生紫色，無色亞甲藍顯色試驗呈陽性。方法易行，操作簡便，該方法是利用中低壓制備色譜；高效分離抗癌活性成分的優化工藝，且含量在95%以上。
文檔編號A61P35/00GK102228499SQ20111016499
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者袁曉, 袁萍 申請人:中國科學院武漢植物園