專利名稱：五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，具體涉及五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法。
背景技術：
始載于《醫宗金鑒·外科心法要訣》的五味消毒飲，是治療瘡瘍腫毒的著名方劑。由金銀花、紫花地丁、紫背天葵、蒲公英、野菊花五味中藥組成，具有清熱解毒，消散療瘡等功效。大量臨床研究已證實該方具有廣譜抗菌、抗病毒及增強機體免疫功能的作用，以此方為基礎的加減方，己被廣泛應用于皮膚科、外科、婦科等火毒濕熱所致的多種感染性疾病的治療，臨床效果確切。 然而，目前尚未見國內文獻報道有關此方對而對非細菌性炎癥的作用。
發明內容
本發明的目的在于提供了五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，研究五味消毒飲加味提取物對非細菌性炎癥作用效果。本發明的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，具體步驟如下
步驟I)準備材料
金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹參；清潔級KM種小鼠；角叉菜膠、阿司匹林泡騰片、腫瘤壞死因子-α、白介素-6和ELISA試劑盒；
步驟2)五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗
以由金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花組成的五味消毒飲為基礎，加葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離出五味消毒飲加味提取物，對五味消毒飲加味提取物的浸膏進行安全限度試驗取若干偶數只清潔級KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數2組，陰性對照組I組，待試藥物I組，禁食8小時后，以動物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量，24h內，分2次灌胃給藥，每次O. 4 ml/10g體重(折合生藥量為450 (生藥)/kg)，陰性對照用等劑量生理鹽水灌胃，連續觀察7天，每天固定時刻觀察動物的死亡情況；步驟3)小鼠分組及給藥
取若干偶數只清潔級KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數的6組，即生理鹽水組、模型對照組、阿司匹林陽性對照組(5g/kg)，五味消毒飲加味提取物小劑量組(IOg (生藥)/kg)、中劑量組(20g(生藥)/kg)、大劑量(40g(生藥)/kg)3個給藥組；每日固定時間按O. 2ml/10g體積灌胃給藥，每天I次，連續7天；末次給藥前標記并測定右后足周長，取兩次測量的平均值為準；末次給藥30分鐘后，于小鼠右后足踝部注射20 μ L/只O. 5%的角叉菜膠致炎，于致炎后30min，90min, 120min, 180min分別測定足周長，生理鹽水組同法注射生理鹽水(20 μ L/只)，測定結束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4°C 5000轉/分離心5分鐘，分離血清，-20°C保存以備測定；
步驟4)腫瘤壞死因子-α和白介素-6水平測定
取血清樣品，按照腫瘤壞死因子-α和白介素-6試劑盒說明書，用ELISA法測定小鼠血清中腫瘤壞死因子- α和白介素-6的水平；
步驟5)統計學處理
數據均以均數土標準差(i
土s)表示，用SPSS 10. O軟件進行統計分析，統計方法采用單因素方差分析，組間均數比較采用F檢驗，P < O. 05表明組間差異有統計學意義。 有益效果本發明的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，得出五味消毒飲加味提取物對小鼠血清腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平均有抑制作用，說明其可能是通過抑制炎癥細胞因子的分泌來達到抗炎癥的效果，為其應用于非細菌性炎癥疾病提供實驗依據。
具體實施例方式本發明以五味消毒飲基礎，并加味葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離五味消毒飲加味粗提取物，采取經典的角叉菜膠誘導小鼠足腫脹模型模型，觀察本提取物抗炎癥作用效果，并測定其對小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的影響，為其應用于非細菌性炎癥疾病提供實驗依據。實施例I
本發明的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，具體研究實驗步驟如下
步驟I)準備材料
材料金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹參均為市售藥材，經蘇州雷允上制藥有限公司執業中藥師陳絢鑒定證實。清潔級KM種小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，動物許可證號SCXK (滬)2007-0005,雌雄各半，體重 20_25g;
五味消毒飲加味提取物(實驗室自制)；
角叉菜膠(Sigma公司，批號09JK1394)；
阿司匹林泡騰片(德國拜耳公司，規格和批號H32026201)；
小鼠腫瘤壞死因子-α (TNF-α )和白介素-6 (IL-6);
ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。步驟2)五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗
以由金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花組成的五味消毒飲為基礎，加葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離出五味消毒飲加味提取物，對五味消毒飲加味提取物的浸膏進行安全限度試驗取清潔級KM種小鼠共40只，雌雄各半，體重20g 25g，分為2組，每組20只，陰性對照組I組，待試藥物I組，禁食8小時后，以動物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量，24h內，分2次灌胃給藥，每次O. 4 ml/10g體重(折合生藥量為450 (生藥)/kg，)，陰性對照用等劑量生理鹽水灌胃，連續觀察7天，每天固定時刻觀察動物的死亡情況。
步驟3)小鼠分組及給藥
取KM種小鼠60只，雌雄各半，分為6組，即生理鹽水組(NS組)、模型對照組、阿司匹林陽性對照組(5g/kg)，五味消毒飲加味提取物小劑量組(IOg (生藥)/kg)、中劑量組(20g (生藥)/kg)和大劑量(40g (生藥)/kg)等3個給藥組,每組10只。每日固定時間按O. 2ml/10g體積灌胃給藥，每天I次，連續7天。末次給藥前標記并測定右后足周長，取兩次測量的平均值為準。末次給藥30分鐘后，于小鼠右后足踝部注射20 μ L/只O. 5%的角叉菜膠致炎，于致炎后30min，90min, 120min, 180min分別測定足周長。生理鹽水組同法注射生理鹽水(20yL/只)。測定結束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4°C 5000轉/分離心5分鐘，分離血清，-20°C保存以備測定。步驟4) TNF-α和IL-6的水平測定
取血清樣品，按照TNF- α和IL-6試劑盒說明書，用ELISA法測定小鼠血清中TNF- a和IL-6的水平。·步驟5)統計學處理
數據均以均數土標準差)表示，用SPSS 10. O軟件進行統計分析，統計方法采用單因素方差分析，組間均數比較采用F檢驗，P < O. 05表明組間差異有統計學意義。研究結果
I.五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗
由于受試藥物的濃度或體積限制，一次給藥無法測出LD5tl,因此，進行了最大耐受量的測定，以提取物浸膏，按小鼠最大體積的藥量灌胃給藥，結果顯示，給藥劑量為450g (生藥)/kg時，小鼠無死亡發生。已知五味消毒飲臨床常用劑量為疒3g (生藥)/kg，小鼠的最大耐受倍數相當于人體的15(Γ225倍，說明本提取物的毒性比較低。2.五味消毒飲加味提取物的對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響
由表I可知，角叉菜膠誘導小鼠足腫脹在120min之內，足周長隨著時間變化而逐漸上升，2h后，開始下降；五味消毒飲加味提取物各劑量組可以抑制小鼠腫脹發生，且呈一定劑量依賴性關系。大劑量組(40g(生藥)/kg)的抑制作用尤其明顯(/X0. 01或O. 05 Ks NS對照組)，中劑量組次之。阿司匹林陽性對照組抗足腫脹效果也較為明顯0°〈0. 01或O. 05 μNS對照組)。
表I.五味消毒飲加味提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響(η=10， 土S)
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注與NS對照組對照組比較，##Ρ<0· 01, #/Κ0· 05。3.五味消毒飲加味提取物對TNF-α的影響
TNF-α是機體重要的炎癥指標之一，是免疫宿主反應的快速反應因子。小鼠注射了角叉菜膠后，模型組小鼠血清中TNF-α水平明顯升高(/X0. 01 Ks模型組)，說明小鼠體內產生了嚴重的炎癥應激反應。五味消毒飲加味提取物大劑量組明顯抑制小鼠血清TNF-α水平(/XO. Ol Ks模型組)，提示其有較強的抗炎作用。阿斯匹林也可抑制TNF-α分泌(/X0. 01KS模型組)，但其作用強度沒有提取物大劑量用藥組強。表2.五味消毒飲加味提取物對小鼠血清TNF-α的影響(n=10，； 土s)
權利要求
1.五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特征在于，具體步驟為 步驟I)準備材料 金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹參；清潔級KM種小鼠；角叉菜膠、阿司匹林泡騰片、腫瘤壞死因子-α、白介素-6和ELISA試劑盒； 步驟2)五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗 以由金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花組成的五味消毒飲為基礎，加葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離出五味消毒飲加味提取物，對五味消毒飲加味提取物的浸膏進行安全限度試驗取若干偶數只清潔級KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數2組，陰性對照組I組，待試藥物I組，禁食8小時后，以動物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量，24h內，分2次灌胃給藥，每次O. 4 ml/10g體重(折合生藥量為450 (生藥)/kg)，陰性對照用等劑量生理鹽水灌胃，連續觀察7天，每天固定時刻觀察動物的死亡情況； 步驟3)小鼠分組及給藥 取若干偶數只清潔級KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數的6組，即生理鹽水組、模型對照組、阿司匹林陽性對照組(5g/kg)，五味消毒飲加味提取物小劑量組(IOg (生藥)/kg)、中劑量組(20g(生藥)/kg)、大劑量(40g(生藥)/kg)3個給藥組；每日固定時間按O. 2ml/10g體積灌胃給藥，每天I次，連續7天；末次給藥前標記并測定右后足周長，取兩次測量的平均值為準；末次給藥30分鐘后，于小鼠右后足踝部注射20 μ L/只O. 5%的角叉菜膠致炎，于致炎后30min，90min, 120min, 180min分別測定足周長，生理鹽水組同法注射生理鹽水(20 μ L/只)，測定結束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4°C 5000轉/分離心5分鐘，分離血清，-20°C保存以備測定； 步驟4)腫瘤壞死因子-α和白介素-6水平測定 取血清樣品，按照腫瘤壞死因子-α和白介素-6試劑盒說明書，用ELISA法測定小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平； 步驟5)統計學處理數據均以均數土標準差( 土s)表示，用SPSS 10. O軟件進行統計分析，統計方法采用單因素方差分析，組間均數比較采用F檢驗，P < O. 05表明組間差異有統計學意義。
2.根據權利要求I所述的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特 征在于，所述步驟I)中清潔級KM種小鼠的體重在20-25g之間。
3.根據權利要求I所述的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特征在于，所述步驟2)中，所取的清潔級KM種小鼠為40只。
4.根據權利要求I所述的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特征在于，所述步驟3)中，所取的清潔級KM種小鼠為60只。
全文摘要
本發明公開了五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，以五味消毒飲基礎，并加味葛根與丹參兩種中藥,采用水提醇沉的方法，提取分離五味消毒飲加味粗提取物，采取經典的角叉菜膠誘導小鼠足腫脹模型模型，觀察本提取物抗炎癥作用效果，并測定其對小鼠血清腫瘤壞死因子-α和白介素-6的影響。本發明的五味消毒飲加味提取物對小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，得出五味消毒飲加味提取物對小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平均有抑制作用，說明其可能是通過抑制炎癥細胞因子的分泌來達到抗炎癥的效果，為其應用于非細菌性炎癥疾病提供實驗依據。
文檔編號A61K49/00GK102836292SQ20111016439
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者向敏 申請人:蘇州衛生職業技術學院