抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及其識別的抗原表位和應用的制作方法

專利名稱：抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及其識別的抗原表位和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及單克隆抗體，尤其涉及抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體和抗0型 FMDV的中和性單克隆抗體，本發明還涉及上述單克隆抗體所識別的中和表位，本發明進一步涉及所述的單克隆抗體和中和表位在預防口蹄疫中的應用，屬于口蹄疫的防治領域。
背景技術：
口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)屬于小 RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA，其基因組RNA全長約8. 51Λ。口蹄疫是嚴重危害偶蹄動物的重要傳染病之一，該病引起幼畜死亡、產奶量下降、肉食減少、肉品下降、動物的生產性能降低，導致巨大的經濟損失。此外，由于貿易的限制和禁止而引起的損失更大，全世界每年由此造成的直接經濟損失可達數百億美元。2005年以來在我國江蘇、山東、甘肅、北京、河北等地爆發了 Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登錄號EF149009)，由于在我國江蘇省首先分離，被稱作Asial型江蘇譜系。該譜系口蹄疫病毒在我國牛群中一經流行，傳播趨勢迅猛，造成的損失極為嚴重。本世紀初0型口蹄疫病毒泛亞譜系在中國(O/Tibet/CHA/99， GenBank 登錄號AJ539138)及周邊國家甚至歐洲(Mason Pff et al. J Gen Virol. 2003, 84 (Pt 6) :1583-93)均有流行，給許多國家造成巨大損失。因此，積極開展Asial型和0型口蹄疫(FMD)的研究，對我國FMD的防控具有重要的意義。口蹄疫病毒的抗原結構十分復雜，不同血清型、基因型和分離株的口蹄疫病毒其抗原表位和抗原位點都不盡相同，存在廣泛的抗原變異。利用單抗逃逸突變株序列分析和交叉中和試驗，已鑒定了一些不同血清型FMDV的抗原位點，相關的研究主要來自0、A、C和 Asial型FMDV。中和性抗體在保護易感動物抵抗口蹄疫病毒感染過程中起主導作用，誘導機體產生中和性抗體的抗原位點主要位于各個血清型FMDV的VPl上，VPl的G-H環是病毒最重要的中和性抗原位點所在，該環中既存在線性表位，又存在構象型表位。在0型FMDV 的VPl蛋白中，G-H環133-157aa和C-末端200_213aa的線性表位組成重要的抗原位點1。 Miz等報道，FMDV A5亞型有2個中和性抗原位點，一個是線性表位，位于VPl的C-末端，關鍵殘基在198aa，另一個位于VP2的B-C環上，由2個表位組成，包括72aa和79aa。Santina Graziolideng用大量單抗進一步確定，Asial型FMDV存在4個中和性抗原位點位點1位于VPl的14ha，與0型VPl的144aa相對應，在保守的RGD基序側翼；位點2位于VP2的 B-C環區，包括67、72、74、77和79aa等多位殘基，而且與VPl的49aa和207aa相關聯；位點4位于VP3的B-B結節上，關鍵殘基為58aa和59aa，該位點與位點2相關聯；位點5位于VP3的C-末端，作為一個新發現的獨立位點被首次提出，218aa為關鍵性殘基。國外這些研究是用單克隆抗體壓力篩選或用合成肽掃描技術，只能確定表位相關氨基酸或肽段，不能精確確定表位的性質和位置。我國已有Asial型和0型FMDV中和活性單克隆抗體的文章發表，然而尚未見到中和表位的研究報道，因此，這些已發表中和性單克隆抗體的功能性和價值尚不清楚。

發明內容
本發明目的之一是提供一株能分泌抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系；本發明目的之二是提供一株能分泌抗0型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系；本發明目的之三是分別提供由上述中和性單克隆抗體所識別的亞洲1型FMDV中和表位氨基酸序列和0型FMDV中和表位氨基酸序列；本發明目的之四是將上述單克隆抗體或中和表位用于診斷或預防口蹄疫。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的一株能分泌抗亞洲1型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其微生物保藏號是CGMCC 2692 ；保藏日期2008年10月8日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區大屯路。由該雜交瘤細胞系所分泌的抗亞洲1 型FMD的中和性單克隆抗體，命名為3E11 ；一株能分泌抗0型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其微生物保藏號是CGMCC 2691;保藏日期2008年10月8日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區大屯路；由該雜交瘤細胞系所分泌的抗0型 FMDV的中和性單克隆抗體，命名為8E8 ；由單克隆抗體3E11所識別的亞洲1型FMDV構象型中和表位，該構象表位的關鍵性氨基酸殘基是由亞洲1型FMDV的VPl蛋白上Ser140或Ser141, Gly144、Leu146和Leu149組成；進一步優選的，所述構象表位的模擬表位的氨基酸序列為GSLXXL(SEQ ID N0:1)，其中， X選自任意一種氨基酸殘基；由單克隆抗體8E8所識別的0型FMDV的VPl蛋白中的一段線性中和表位序列，其氨基酸序列為⑶LNVRT (SEQ ID NO 2)或者為其衍生序列；其中，所述的衍生序列是對GDLNVRT中的一個或多個氨基酸進行缺失和/或替換后所得到的任意一種的氨基酸序列，其中所述的缺失是將G缺失；所述的替換選自以下6種中的任意一種或一種以上進行的組合(1) G用W替換；(2) L用A替換；(3) N用Q、A或W替換；(4) V用I或T替換；(5) R用L、K或A替換；(6) T用A替換；經試驗證實，上述的經過缺失和/或替換后所得到的衍生序列與GDLNVRT均具有相同的性能與用途。本發明技術方案的詳細描述本發明用純化的全病毒免疫BALB/c鼠制備抗Asial型FMDV江蘇譜系Asial/YS/ CHA/05株、0型FMDV泛亞譜系0/YS/CHA/05株的單克隆抗體，各獲得一株具有強中和活性的單克隆抗體3E11和8E8。間接免疫熒光和Western blot檢測表明，3E11識別Asial型 FMDV—個構象型優勢中和表位，該單抗與一個親本變異株(144位由G突變為幻無反應， 由此推斷VPl蛋白上144位Gly是單抗3E11識別表位的關鍵性氨基酸；8E8識別0型FMDV 一個廣譜的線性中和表位。本發明進一步利用噬菌體展示隨機12肽庫篩選上述兩個單抗識別的模擬表位，發現一個表位基序GSLXXL (X代表20種氨基酸殘基任意一種)與單抗3E11具有結合活性， 而單抗8E8的模擬表位基序為⑶LNVRT。鑒于兩個單抗的特性，用合成肽對單抗3E11識別的模擬表位基序的4個保守性氨基酸殘基進行定點突變分析確定，這些氨基酸均為關鍵性氨基酸；同時合成Asial/YS/ CHA/05株VPl蛋白G-H環的136 153aa序列，該十八肽包含GSLXXL基序所有4個關鍵性氨基酸，肽ELISA檢測顯示與單抗3E11同樣具有結合活性，從而確定該構象表位的關鍵性氨基酸殘基是由VPl蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149組成。單抗8E8模擬表位基序與0/YS/CHA/05株VPl蛋白的146 152位氨基酸序列存在高度同源，因而將146⑶LQVLT152序列及其截短肽序列與GST融合表達并進行Western blot分析，確定147DLQVLTi52是0型FMDV VPl上的一個線性B細胞表位；針對病毒VPl真實序列中146 152aa肽(P-8E8)合成一系列定點誘變肽并進行競爭ELISA分析，結果顯示， 氨基酸殘基D對于該表位活性最為關鍵，殘基V、L148、L151、Q和T對于表位活性起重要作用， 而且殘基T不可缺失。鑒于上述兩個單抗在體外具有很高的中和滴度，本發明進而用乳鼠保護試驗在體內驗證上述兩個單克隆抗體對FMDV感染的免疫保護作用。試驗結果表明，針對Asial型和 0型FMDV的單克隆抗體3E11和8E8腹水的半數保護量(PD5tl)分別為1995和2371 ；僅用 8PD50單抗3E11和IlPD5tl單抗8E8，就可完全保護乳鼠耐受致死劑量Asial型和0型FMDV 的攻擊。被動免疫的乳鼠在攻毒后體重增長的百分率隨單抗濃度的升高而升高，而且隨著單抗濃度的升高，乳鼠的起始死亡時刻后延、終點死亡時刻前移。通過體外中和試驗和體內動物被動免疫保護保護試驗說明，本發明的3E11單抗和8E8單抗具有良好的被動免疫效果，這兩株單抗均能應用于口蹄疫的緊急預防，可以對口蹄疫的被動免疫起到良好的免疫效果；用這兩個單抗所識別的FMDV血清型的保護性抗原表位可以進一步研究或開發出口蹄疫二價表位疫苗，對于口蹄疫的免疫預防將具有重要的意義。


圖IELISA方法篩選單抗3E11特異性親和的噬菌體；用相同蝕斑數的各噬菌體克隆加入用單抗3E11包被的微孔板中，并設同種抗體亞型的單抗4C6、含BSA的封閉液和原始肽庫(Phage Library, PL)作為對照。圖2合成肽P-S7及其突變肽與單抗3E11結合活性的檢測；包被鏈酶親和素，分別加入系列稀釋的生物素化短肽P-S7和隨機打亂肽P-S7-SCR，與3E11結合反應后，加入HRP 標記的羊抗鼠二抗，顯色并測定吸光值。圖3合成肽P-S7及其突變肽與單抗3E11結合活性的檢測；用合成肽P_S7競爭抑制單抗3E11與病毒抗原的結合包被Iug病毒抗原，加入合成肽與單抗3E11預混液，最后加入羊抗鼠酶標二抗。圖4合成肽P-S7及其突變肽與單抗3E11結合活性的檢測；合成肽定點突變試驗鑒定P-S7肽與單抗3E11相互作用的關鍵性氨基酸，以單抗3E11與未突變短肽P-S7反應的OD4tl5值為100%，計算其它短肽的結合率。圖5合成的18-aa G-H環十八肽與單抗3E11的結合活性；包被鏈酶親和素，加入系列稀釋的生物素化短肽AsialpG-H，與單抗3E11反應，加入HRP標記的羊抗鼠二抗，顯色后測定OD4tl5吸光值。圖6ELISA方法篩選單抗8E8親和的噬菌體；以相同蝕斑數的各噬菌體克隆加入包被有單抗8E8的微孔板中，設同種抗體亞型的單抗5F7、含BSA封閉液以及噬菌體肽庫 (Phage Library, PL)作為對照。圖7陽性噬菌體克隆的Wfestern blot分析。圖8表位及其截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE (a)和^festern blot分析(b)。圖9合成肽的競爭ELISA實驗；用合成的突變肽競爭抑制單抗8E8與病毒結合。圖10合成肽的競爭ELISA實驗；肽濃度為lug/100ul，以P-8E8的抑制率為100%， 計算各合成突變肽的相對抑制率。圖11合成肽的競爭ELISA實驗；用合成的突變肽競爭抑制單抗8E8與病毒結合。圖12合成肽的競爭ELISA實驗；肽濃度為lug/100ul，以P-8E8的抑制率為100%， 計算各合成突變肽的相對抑制率。圖13單抗3E11濃度與乳鼠存活率的關系；乳鼠經10LD5(1ASial/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗3E11 (即不同中和抗體半數保護量)導致乳鼠存活率的差異。圖14單抗8E8濃度與乳鼠存活率的關系；乳鼠經IOLD5tl 0/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗8E8(即不同中和抗體半數保護量)導致乳鼠存活率的差異。圖15單抗3E11濃度與乳鼠存活時間的關系；乳鼠經10LD5(1ASial/YS/CHA/05攻擊后，不同濃度的單抗3E11導致乳鼠死亡時間的差異。圖16單抗8E8濃度與乳鼠存活時間的關系；乳鼠經IOLD5tl 0/YS/CHA/05攻擊后， 不同濃度的單抗8E8導致乳鼠死亡時間的差異。圖17單抗3E11濃度與乳鼠體重增長百分率關系；乳鼠經10LD5(1ASial/YS/CHA/05 攻擊后不同濃度的單抗3E11導致乳鼠體重增長百分率的的差異。圖18單抗8E8濃度與乳鼠體重增長百分率關系；乳鼠經10LD5(10/YS/CHA/05攻擊后不同濃度的單抗8E8導致乳鼠體重增長百分率的差異。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。一、材料和方法1.病毒、細胞、菌株和實驗動物口蹄疫病毒株Asial/YS/CHA/05屬于Asial型FMDV江蘇譜系，口蹄疫病毒0/YS/ CHA/05株屬于0型泛亞譜系；乳倉鼠腎細胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤細胞為本實驗室保存；質粒pGEX-6p-l和受體菌BL21由本實驗室保存；清潔級雌性BALB/c小鼠、SPF級BALB/c乳鼠購于中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。2.主要試劑融合劑PEG/DMS0 (Mw, 1450)、HAT 鹽(50x)、HT 鹽(50x)、HRP 或 FITC 標記的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自 Southern Biotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸購自Amresco公司；二甲基亞砜(DMSO)、鄰苯二胺(OPD)、PEG6000購自Solarbio公司；Ph. D. -12 肽庫試劑盒購自New England Biolabs公司；HRP標記抗的M13噬菌體抗體購自于GE Healthcare公司；限制性內切酶 BamHI、XhoI, PstI 購自 TaKaRa 公司；T4DNA 連接酶購自 New England Biolabs 公司；高糖DMEM干粉購自GIBCO公司；進口優級胎牛血清(PAA)購自西班牙Nalgene公司； 96孔細胞培養板購自加拿大JET Biochemical公司。3.鼠免疫與單克隆抗體的制備(1)將Asial型、O型FMDV細胞適應毒接種于長滿單層的BHK-21細胞，待75%以上細胞出現病變后收毒。將收獲的細胞培養液反復凍融三次，初步裂解細胞，釋放病毒。凍融后的病毒液以1 1000加入TritonX-IOO和4 10000加入甲醛裂解與滅活48h以上， 取滅活過的病毒液ImL上BHK-21細胞盲傳三代，檢測是否滅活徹底。將經凍融裂解后的培養液作9000rpm(Beckman高速離心機，JA-IO轉子)、4°C離心90min，回收病毒液上清，棄去細胞沉淀。按病毒液上清的體積加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室溫攪拌池至完全溶解，4°C過夜沉淀。次日將上清9000rpm、4°C離心90min，棄上清，回收沉淀。用NET緩沖液于低溫下將沉淀輕輕重懸。將重懸的上清^000rpm、4°C離心2h，回收沉淀，于低溫下用適量的NET緩沖液輕輕重懸沉淀，充分混勻后分裝，-70°C凍存備用。將提純抗原用NET 緩沖液進行10倍、100倍、1000倍稀釋，用分光光度計測量蛋白質的濃度。(2)用純化的Asial型、0型FMDV抗原200 μ g/200uL加等體積弗氏完全佐劑，充分乳化后經背部皮下注射6周齡雌性BALB/c小鼠；2周后進行第2次免疫，佐劑為弗氏不完全佐劑；間隔2周后，以不加佐劑的等量抗原進行第3次免疫。為刺激小鼠快速產生強烈免疫反應，于融合前3d采用尾靜脈和脾臟注射相結合的免疫方式進行加強免疫，注射二倍量抗原。(3)細胞融合a)飼養層細胞的制備細胞融合前一天進行飼養層細胞的制備，眼科剪刀、眼科鑷子、平皿等試驗用具用前高溫干熱滅菌，HAT完全培養液做無菌檢驗。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常規方法分離陰性血清。拉頸脫白處死小鼠，將其浸泡于75%酒精中， IOmin后移入超凈工作臺。將小鼠腹部向上固定在鼠架上，用鑷子提起腹正中部皮膚，眼科剪刀橫向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和鑷子上下撕開皮膚，充分暴露腹膜。用鑷子輕輕提起腹膜，將IOmL注射器內吸取的8-lOmL HAT完全培養液注入腹腔，切勿刺破臟器和腸道，注射器不要拔出，在腹腔內來回抽吸5-10次，然后用鑷子按摩兩側腹部30秒左右，再進行抽吸，重復以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔內液體。注意避開腸系膜及脂肪組織，以免堵塞針頭。將從2只鼠中取出的腹腔細胞加入55mL HAT培養液中，吹散混勻細胞，分裝于6塊96孔培養板，100 μ L/孔。置于37°C、5% CO2培養箱中培養。b)骨髓瘤細胞的制備融合前36-4 ,將骨髓瘤細胞擴大培養，使細胞處于對數生長期。融合當天，用15mL DMEM基礎培養液將細胞從瓶壁上吹下，收集于50mL離心管中。 IOOOrpm離心lOmin。將細胞沉淀重懸置20mL DMEM基礎培養液中，混勻。取少量骨髓瘤細胞懸液，臺盼蘭染色計數，備用。c)免疫脾細胞的制備融合前摘除小鼠眼球采血，制備陽性血清。將小鼠拉頸脫臼致死，浸泡于75%酒精中，IOmin后放于超凈臺。無菌打開腹腔，分離結締組織并取出脾臟，將脾臟放入裝有滅菌尼龍網和盛有15mLDMEM基礎培養液的平皿中，用滅菌玻璃注射器內芯研磨脾臟，使脾細胞全部通過網孔進入平皿中。將脾細胞溶液轉入50mL離心管中，加 DMEM基礎培養液大約至30mL，混勻。IOOOrpm離心8min，棄上清。將細胞沉淀懸于IOmL DMEM基礎培養液中，混勻。取細胞懸液，臺盼蘭染色計數，備用。d)脾細胞與骨髓瘤細胞融合取65mLHAT培養液，15mL基礎DMEM培養液和 lmL50% PEG于37°C水浴中預熱，另備盛有37°C水的200mL燒杯。按5份脾細胞數加1份骨髓瘤細胞數取相應細胞懸液量，加入50mL玻璃離心管中，補加DMEM基礎培養液至30mL，混勻。IOOOrpm離心lOmin，棄上清，盡可能倒干。用手掌輕擊離心管底部，使沉淀細胞松散均勻呈糊狀。將離心管放入盛有37°C水的200mL燒杯中，一手均勻轉動離心管，另一手用ImL 巴氏吸管吸取37°C 50% PEG溶液lmL，Imin內加完，靜置anin。隨后先慢后快地加入DMEM 基礎培養液終止反應，37°C水浴靜置lOmin。IOOOrpm離心lOmin，棄上清，加入65mLHAT培養基，輕輕地吹散細胞，每孔0. ImL接種于已培養有飼養細胞的6塊96孔培養板，置37°C、 5%的(X)2培養箱中培養。5d后半量換液，8d后全換液，待克隆長至孔底面積1/4-1/3時取上清進行檢測并換HT培養液。4.抗體檢測 ELISA用提純的病毒抗原包被于微孔板中，加入IOOuL雜交瘤細胞培養上清，37°C溫育 Ih后洗滌，加入1 5000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，洗滌后加入底物OPD避光顯色 IOmin,于波長492nm測定吸光值。5.間接免疫熒光微孔板培養BHK-21細胞至單層，接種口蹄疫病毒4X 103TCID5(1/Well，出現CPE之前用冷無水乙醇進行固定，加入50uL雜交瘤細胞培養上清，37°C溫育40min后PBS洗滌三次，加入1 200稀釋的熒光素標記羊抗鼠IgG抗體，37°C溫育40min，洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察，以+號數目記錄熒光強度。6.微量細胞中和試驗(1)病毒毒價的測定將病毒接種于單層細胞，37°C吸附Ih后加入維持液，置溫箱培養；逐日觀察，待細胞病變(CPE)達75%以上，收獲病毒懸液凍融3次，以3000r/min離心lOmin，取上清液，定量分裝成Iml小瓶置_70°C保存備用，選用的病毒必須是對細胞有較穩定的致病力。取自-70°C冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養板上作10倍遞進稀釋即ΙΟ"1, ΙΟ"2,10-11……，每孔病毒懸液量為50 μ 1，每個稀釋度作8孔，每孔加入100細胞懸液，每塊板的最后一行設8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5% CO2溫箱37°C培養，從48-7 逐日觀察細胞病變，記錄結果。按Reed 和 Muench 兩氏法計算 TCID50。表 1TCID50計算(接種劑量50 μ 1)
權利要求
1.一株能分泌抗0型口蹄疫病毒的中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其微生物保藏號是CGMCC洸91。
2.由權利要求1所述雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在制備診斷、預防或治療口蹄疫的試劑或藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了抗口蹄疫病毒的單克隆抗體及其識別的抗原表位和應用，屬于口蹄疫的防治領域。所述能分泌抗O型FMDV的中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其微生物保藏號是CGMCC No.2691。本發明還公開了上述單克隆抗體所分別識別的O型FMDV VP1蛋白的線性中和表位的氨基酸序列。體外中和試驗和體內動物保護試驗說明，本發明的單克隆抗體具有良好的被動免疫效果，能應用于口蹄疫的緊急預防，可對口蹄疫的被動免疫起到良好的免疫效果。
文檔編號A61K39/42GK102277333SQ20111016255
公開日2011年12月14日 申請日期2008年10月30日 優先權日2008年10月30日
發明者于力, 周國輝, 張春媛, 趙磊 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所