專利名稱：一種四價登革病毒亞單位疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種四價登革病毒亞單位疫苗及其制備方法和應用。
背景技術：
登革病毒(Dengue virus)是黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬的重要成員，其廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區，主要傳播媒介為埃及伊蚊。該病毒感染引起的疾病是最重要的蟲媒病毒病之一。據WHO統計，全球每年約有I億人感染登革病毒，隨著全球氣候變暖和國際化交流的增多，該病的流行區域正在不斷擴大，已成為嚴重的公共衛生問題。我國廣東、福建、海南和臺灣等東南沿海地區均為登革熱的高發區。自1978年以來，該地區暴發登革熱流行已達數十次，僅1980年和1985年海南2次流行患者就超過55萬。近兩年廣東和 福建省頻繁暴發登革熱，導致上千人患病，嚴重影響了我國經濟事業的正常發展。目前，對登革病毒感染只能進行對癥治療，仍無有效的疫苗用于臨床。自然界存在的登革病毒有四種血清型(I 4)，即登革I型病毒(DENVl)、登革2型病毒(DENV2)、登革3型病毒(DENV3)、登革4型病毒(DENV4)。每種血清型均可引起患者產生多種癥狀，統稱為登革病毒病，包括登革熱(dengue fever, DF)的臨床表現主要以高熱、頭痛、肌肉和關節痛為主，可伴有皮疫、淋巴結腫大和白血球減少。登革出血熱(denguehemorrhagic fever,DHF)的臨床特征為出血、血液濃縮、低血衆蛋白及凝血異常,有休克者為登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS)。人體被某一血清型的登革病毒感染后，會誘發針對該血清型的長效保護性免疫應答，但針對該型病毒的中和抗體對其它血清型卻無保護作用。相反，抗體與其它血清型病毒形成的抗原-抗體復合物可與單核細胞表面的Fe受體結合，從而獲得感染這些細胞的能力，這種抗體依賴的增強作用(ADE)可使患者產生更為嚴重的DHF/DSS。因此，安全有效的登革疫苗必須同時提供針對四個血清型的保護性免疫應答。泰國Mahidol大學和美國Walter Reed陸軍研究所采用傳統細胞傳代的方法分別研制的減毒活疫苗雖已進行了多年的臨床試驗，但由于四價疫苗混合物中的一個或多個血清型會增強或抑制疫苗中其它血清型的復制和免疫原性，而且也無法避免ADE的發生。因此，研制同時針對四個血清型病毒的四價登革疫苗極為迫切和重要。登革病毒基因組為單股正鏈RNA，長約I lkb，共編碼3種結構蛋白(C、PrM和E)和7種非結構蛋白(NSU NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。包膜蛋白E有三個結構域1區、II區和III區。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種預防和/或治療登革病毒病的產品。本發明所提供的預防和/或治療登革病毒病的產品，其活性成分為由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白組成的組合物。上述產品中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的質量比為I : I : (I 5) 1，具體為 I : I : I : I。上述任一所述產品中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下1-1或1-2所示1-1 : SEQ ID NO : I 所示；1-2 ^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白質；所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下
2-1或2-2所示2-1 SEQ ID NO 2 所示；2-2 ^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白質；所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下
3-1或3~2所不3-1 :SEQ ID NO :3 所示；3-2 ^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白質；所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下
4-1或4-2所示4-1 SEQ ID NO 4 所示；4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白質。 上述任一所述產品中，所述產品中包括藥學上可接收的載體。上述任一所述產品中,所述產品為疫苗。上述任一所述產品中，所述登革病毒病是由如下四種血清型登革病毒中的至少一種引起的DENVI、DENV2、DENV3 和 DENV4。由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白組成的組合物在制備預防和/或治療登革病毒病的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。上述應用中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的質量比為I : I : (I 5) 1，具體為 I : I : I : I。上述任一所述應用中，所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白氨基酸序列為如下1_1或1-2所示1-1 : SEQ ID NO : I 所示；1-2 ^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白質；所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下
2-1或2-2所示2-1 SEQ ID NO 2 所示；2-2 ^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白質；
所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下
3-1或3~2所不3-1 SEQ ID NO 3 所示；3-2 ^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白質；所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下
4-1或4-2所示4-1 SEQ ID NO 4 所示；4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白質。上述任一所述應用中，所述登革病毒病是由如下四種血清型登革病毒中的至少一種引起的DENVI、DENV2、DENV3 和 DENV4。實驗證明，用本發明疫苗免疫機體，可以激發機體的體液免疫應答，并對四個血清型登革病毒感染的乳鼠均具有保護效果，抵抗四個血清型登革病毒的感染。本發明對于預防人類登革病毒的感染具有重要的現實意義。
圖I為SDS-PAGE檢測E蛋白DIII區的表達。圖2為Western blot檢測E蛋白DIII區的表達。圖3為SDS-PAGE檢測純化后的E蛋白DIII區。圖4為ELISA檢測E蛋白DIII區的抗原性。圖5為間接免疫熒光檢測免疫后小鼠血清中針對登革病毒的IgG抗體。圖6為體外中和實驗檢測免疫小鼠血清對乳鼠的保護效果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、四種蛋白的制備一、登革病毒DENVl的E結構蛋白III區蛋白I、基因
以登革I型病毒GZ/80株毒株RNA (該病毒序列具有GENBANK號為AF350498的第
1-10735位核苷酸序列)為模板，或以人工合成的SEQ ID NO 5所示基因為模板，用表I中DII11-F/DIIII-R所示引物進行PCR擴增。PCR 循環條件為 94 °C 2min;94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 35 循環；72°C 延伸 7min。結果獲得了長度約300bp的擴增片段，與E蛋白的DIII區基因長度大小一致。2、重組表達載體將步驟I得到的PCR擴增產物用EcoR V和Sal I于37°C酶切3小時，回收純化片段，與用EcoR V和Sal I酶切的表達載體pET32a用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，連接產物通過熱休克法轉化化學感受態的E. coli Top 10，涂布Amp抗性LB平板，37°C培養16小 時，挑取數個單菌落接種Amp抗性LB培養液，37°C振蕩培養12小時。堿裂解法抽提質粒，測序鑒定。結果表明，在質粒pET32a的EcoR V和Sal I間插入的基因序列如SEQ ID NO 5所示。將該重組質粒記作pET32a-DENVl-DIII。SEQ ID NO :5所示基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。3、重組菌用步驟2中所述方法將pET32a-DENVl-DIII轉化E. coli BL21 (DE3)，得到陽性重組菌，記作 BL21-pET32a-DENVl-DIII。4、表達蛋白挑取重組工程菌BL21-pET32a-DENVl-DIII單菌落接種到Amp抗性LB培養液中，37°C振蕩培養過夜，次日按1%接種到新鮮Amp抗性LB培養液中，37°C振蕩培養至0D600約為O. 6時，加入O. OlmM IPTG在37°C誘導表達4小時，誘導結束后離心(6，OOOg, 15min)，收集菌體，將菌體重懸于PBS緩沖液(體積為培養菌液的1/10)中，超聲(脈沖5sec，間歇5sec，持續30min)破碎菌體，離心(6，OOOg, 30min)，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，結果顯示，重組菌的超聲破碎上清中，增加了一條蛋白帶，與目的蛋白預期大小(33KD)接近，說明DIII蛋白主要以可溶形式表達。同時采用Western blot對超聲上清進行鑒定,主要方法重組菌的超聲破碎上清經SDS-PAGE電泳分離，半干轉移儀將膠上蛋白轉移至PVDF膜上。使用含5%脫脂奶粉的TBST 4°C封閉過夜。以抗His標簽的單抗(I 1000)作為一抗，堿性磷酸酶標記的馬抗鼠IgG(l 1000)作為二抗進行孵育。最后用BCIP/NBT顯色。結果顯示，樣品中可被His標簽抗體識別的蛋白與目的蛋白的預期大小一致，進一步證明了 DIII蛋白已獲得正確表達。5、純化將步驟4得到的上清用Ni柱進行親和層析純化，使用結合緩沖液沖洗柱子，使用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。洗脫的蛋白經SDS-PAGE分析，顯示純化后的樣品中蛋白條帶單一，且與目的蛋白大小一致。結合緩沖液由pH值為7. 9、20mM的Tris-HCl緩沖液、咪唑和NaCl組成；咪唑在結合緩沖液中的濃度為10mM，NaCl在結合緩沖液中的濃度為O. 5M ;結合緩沖液的pH值為7. 9。洗脫緩沖液由pH值為7. 9、20mM的Tris-HCl緩沖液、咪唑和NaCl組成；咪唑在結合緩沖液中的濃度為500mM，NaCl在結合緩沖液中的濃度為O. 5M ;結合緩沖液的pH值為7. 9。二、登革病毒DENV2的E結構蛋白III區蛋白登革病毒DENV2的E結構蛋白III區蛋白制備方法與實驗一中所述基本相同；不同的是所用引物為表I中DIII2-F/DIII2-R所示引物，模板為登革2型病毒43株毒株RNA (該病毒序列具有GENBANK號為AF204178的第1-10723位核苷酸序列)或為人工合成的SEQ ID NO 6所示基因；登革病毒DENV2的E結構蛋白III區的氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示，該蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。三、登革病毒DENV3的E結構蛋白III區蛋白登革病毒DENV3的E結構蛋白III區蛋白制備方法與實驗一中所述基本相同；不同的是所用引物為表I中DIII3-F/DIII3-R所示引物，模板為登革3型病毒80_2株毒株RNA (該病毒序列具有GENBANK號為AF317645的第1-10696位核苷酸序列)或為人工合成的SEQ ID NO :7所示基因；登革病毒DENV3的E結構蛋白III區的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，該蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。四、登革病毒DENV4的E結構蛋白III區蛋白登革病毒DENV4的E結構蛋白III區蛋白制備方法與實驗一中所述基本相同；不同的是所用引物為表I中DIII4-F/DIII4-R所示引物，模板為登革4型病毒B5株毒株RNA (該病毒序列具有GENBANK號為AF289029的第1-10665位核苷酸序列)或為人工合成的SEQ ID NO 8所示基因；登革病毒DENV4的E結構蛋白III區的氨基酸序列如SEQ IDNO :4所不,該蛋白的編碼基因的核昔酸序列如SEQ ID N0:8所不。表I
引物名稱序列(5' -3')
DIIIl-F CCGGATATCTCATATGTGATGTGCACA DIIIl-R TGCAGTCGACTTTCCCTATGGTGCTTCC DIII2-F CCGGATATCTCATACTCTATGTGCACA DIII2-R TGCAGTCGACTTGGCCGATAGAACTTCC DIII3-F CCGGATATCAGCTATGCAATGTGCTTG DIII3-R TGCAGTCGACCTTCCCAATCGAGCTTCC DIII4-F CCGGATATCTCATACACGATGTGCTCA DIII4-R TGCAGTCGACCTTGCCAATGGAACTCCC四個E蛋白DIII區的表達如圖I所示。M :蛋白Marker ;1，3，5和7 :四個重組載體轉化菌誘導后的超聲沉淀；2，4，6和8分別代表超聲上清；箭頭所指處為目的條帶位置。Western blot檢測E蛋白DIII區的表達的結果如圖2所示。M :蛋白Marker ；1 DENVl-DI 11 ；2 DENV2-DIII ；3 DENV3-DIII ；4 DENV4-DIII ;箭頭所指處為目的條帶位置。用SDS-PAGE檢測純化后的E蛋白DIII區的結果如圖3所示。M :蛋白Marker ；1 DENVl-DI 11 ；2 DENV2-DIII ；3 DENV3-DIII ；4 DENV4-DIII ;箭頭所指處為目的條帶位置。五、DIII蛋白的抗原性分析DENVl 的單克隆抗體購自 United States Biological，產品目錄號為 D2800-05。DENV2 的單克隆抗體購自 United States Biological，產品目錄號為 D2800-14。DENV3 的單克隆抗體購自 United States Biological，產品目錄號為 D2800-15。DENV4 的單克隆抗體購自 United States Biological，產品目錄號為 D2800-20。 采用分別針對4個血清型登革病毒的單克隆抗體對純化的DIII蛋白的抗原性進行ELISA分析。在微量酶聯板中加入100 μ I DIII蛋白抗原(碳酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為lyg/ml)，4°C過夜，棄包被抗原。用洗滌液(PBST)重復洗板3次，30s/次，拍干。加入150 μ I封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST)，37°C孵育lh，棄封閉液，洗滌同前。加入100 μ I相應的單克隆抗體，37°C孵育lh，棄抗體，洗滌同前。加入100 μ I工作濃度的HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育30min，棄抗體，洗滌同前。加入100 μ I TMB底物，37°C避光顯色15min，加入100μ1 2Μ H2SOj*止顯色，測定波長450nm的光吸收值。結果顯示，四種DIII蛋白均不能與正常小鼠血清結合(Negative)，但可分別與相應血清型登革病毒的單克隆抗體特異性結合，表明純化的四種DIII蛋白具有良好的抗原性。ELISA檢測E蛋白DIII區的抗原性結果如圖4所示。Negative :以正常小鼠血清作為一抗；DENV1 DENV4分別代表針對不同血清型登革病毒的單克隆抗體。實施例2、動物免疫及免疫效果評價選用4周齡Balb/C雌性小鼠進行免疫。小鼠分為2組(DIII混合組和Trx組)，6只/組。將純化的4個血清型登革病毒的DIII蛋白按I : I : I : I的質量比混合(免疫劑量為4種蛋白分別使用25 μ g)或硫氧環蛋白(Trx) 25 μ g稀釋于100 μ I PBS中，再與弗氏完全佐劑按I : I的體積比混合，充分乳化后采用皮下多點注射進行初次免疫，每只小鼠注射200 μ I。每2周加強免疫I次,共加強免疫3次。每次加強免疫劑量和免疫途徑均與初次免疫相同，加強免疫時將蛋白與弗氏不完全佐劑以I : I的體積比混合。初次免疫前和第二、三次加強免疫后兩周采小鼠尾靜脈血，分離血清測定IgG抗體效價和中和抗體效價。病毒DENV1、病毒 DENV2、病毒 DENV3、病毒 DENV4 均在文獻 “Chen S，Yu M, JiangTiDeng Y,Qin C，Qin E. Induction of tetravalent protective immunity against fourdengue serotypes by the tandem domain III of the envelope protein. DNA CellBiol. 2007 ；26(6) :361-367.) ”中公開過，在符合國家和軍隊有關規定且經相關部門審批后，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。BHK-21細胞購自ATCC，產品目錄號為CCL-10 。血清抗體效價的檢測方法為1.制備登革病毒感染細胞的抗原片，待BHK21細胞(25cm2培養瓶)長成單層后，移去培養基，加入2ml含2% FBS的DMEM，并分別加入0. 5ml的DENVU DENV2、DENV3和DENV4病毒懸液。于37°C,5% CO2條件下吸附Ih后，每瓶補加3ml含2% FBS的DMEM，同樣條件下繼續培養2天。經0. 25%胰酶消化后，將感染了病毒的BHK21細胞配制成5 X IO5個/ml濃度的細胞懸液，滴加至經過滅菌處理的多點鍍膜載玻片的上樣孔內，20 μ I/孔，載玻片置濕盒，于37°C，5% CO2條件下培養6h，使細胞貼壁。將載玻片于PBS中洗去未貼壁細胞，室溫晾干，-20°C丙酮固定30min。晾干后保存于_20°C備用。2.將不同稀釋度血清滴加至抗原片孔內，37°C孵育lh，PBS洗3次，5min/次。然后加用O. 02%伊文思藍稀釋的FITC-羊抗鼠IgG(l 200)，37°C孵育30min，PBS洗3次，5min/次。室溫干燥后在熒光顯微鏡下觀察。結果發現，經DIII混合物免疫的小鼠血清IgG抗體可與四個血清型的登革病毒抗原結合，產生特異熒光；而Trx免疫小鼠的血清則不能產生這種特異熒光。這表明，DIII混合物免疫小鼠后可產生針對登革病毒四個血清型的特異抗體。表2顯示了最后一次加強免疫后兩周的小鼠血清中IgG抗體的效價。本實驗中抗體效價以可見熒光的最高血清稀釋度表示。間接免疫熒光檢測免疫后小鼠血清中針對登革病毒的IgG抗體的結果如圖5所示。(A =Trx免疫小鼠血清；B E :代表DIII混合物免疫的小鼠血清分別與四個血清型的登革病毒抗原的反應。C6/36細胞購自ATCC，產品目錄號為CRL-1660 。 血清中和抗體的測定(固定病毒-稀釋血清法)將56°C滅火30min的免疫小鼠血清稀釋(I 4、1 8、1 16、1 32和I 64)后，分別與等體積的IOOTCID5q的DENVl、DENV2、DENV3和DENV4病毒在37°C孵育lh。然后加入96孔板中的單層C6/36細胞吸附lh，再向每孔加入100μ I含2% FBS的RPMI-1640。于37°C、5% CO2條件下培養，每天觀察細胞病變。中和抗體效價以觀察不到細胞病變的血清最高稀釋度表示。結果顯示，DIII混合物免疫小鼠的血清中可檢測到針對四個血清型登革病毒的中和抗體，其中針對DENVI的中和抗體效價最高，可達I : 43，而針對DENV3的中和抗體效價僅為I : 9。同時，Trx組免疫后小鼠血清中和抗體效價均低于I : 8。這表明，DIII混合物免疫可誘導小鼠產生針對各血清型登革病毒的中和抗體。表3顯示了最后一次加強免疫后兩周的小鼠血清的中和抗體效價。乳鼠保護實驗將56°C滅活30min的免疫小鼠血清分別與等體積的50個LD5tl的DENVl、DENV2、DENV3和DENV4病毒在37°C孵育Ih。然后進行Balb/C乳鼠(3日齡)腦內注射，20μ1/只。每日觀察乳鼠死亡情況，并計算乳鼠的存活率。結果顯示，DIII混合物免疫小鼠的血清可有效保護乳鼠免受DENVl，DENV2和DENV4病毒的致死性攻擊，其生存率分別為90% (9/10),100% (10/10)和100% (8/8)，與Trx組相比具有顯著性差異(p=O. 0026,0. 000023和O. 00016)。雖然DIII混合物免疫小鼠的血清對DENV3的保護率(33.3% (2/6))與Trx組相比無統計學差異，但該組血清可延緩病毒感染的乳鼠產生后肢麻痹等神經癥狀。以上結果表明，DIII混合物誘導小鼠產生的免疫應答可有效保護乳鼠免受不同血清型登革病毒的攻擊。體外中和實驗檢測免疫小鼠血清對乳鼠的保護效果如圖6所示。(A D :分別代表免疫小鼠血清對DENV1，DENV2, DENV3和DENV4感染乳鼠的保護作用；*代表DIII混合組的存活率與Trx組具有統計學差異)。表2免疫小鼠血清中針對不同血清型登革病毒的IgG抗體效價
權利要求
1.一種預防和/或治療登革病毒病的產品，其活性成分為由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白組成的組合物。
2.根據權利要求I所述的產品，其特征在于所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的質量比為I : I : (I 5) : 1，具體為I : I : I : I。
3.根據權利要求I或2所述的產品，其特征在于 所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下1-1或1-2所示1-1 SEQ ID NO 1 所示； 1-2^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白質； 所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下2_1或2-2所示2-1SEQ ID NO 2 所示； 2-2^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白質； 所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下3_1或3-2所示3-1SEQ ID NO 3 所示； 3-2^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白質； 所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下4_1或4-2所示4-1SEQ ID NO 4 所示； 4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白質。
4.根據權利要求I或2或3所述的產品，其特征在于所述產品中包括藥學上可接收的載體。
5.根據權利要求1-4中任一所述的產品，其特征在于所述產品為疫苗。
6.根據權利要求1-5中任一所述的產品，其特征在于所述登革病毒病是由如下四種血清型登革病毒中的至少一種引起的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4。
7.由登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白組成的組合物在制備預防和/或治療登革病毒病的產品中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的質量比為I : I : (I 5) 1，具體為I : I : I : I。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于 所述登革病毒DENVl的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白氨基酸序列為如下1-1或1-2所示1-1 SEQ ID NO 1 所示； 1-2^fSEQ ID NO :I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-1衍生的蛋白質； 所述登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下2_1或2-2所示2-1SEQ ID NO 2 所示； 2-2^fSEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-1衍生的蛋白質； 所述登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下3_1或3-2所示3-1SEQ ID NO 3 所示； 3-2^fSEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-1衍生的蛋白質； 所述登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白的氨基酸序列為如下4_1或4-2所示4-1SEQ ID NO 4 所示； 4-2 ^fSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-1衍生的蛋白質。
10.根據權利要求7-9中任一所述的應用，其特征在于所述登革病毒病是由如下四種血清型登革病毒中的至少一種引起的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4。
全文摘要
本發明公開了一種四價登革病毒亞單位疫苗及其制備方法和應用。本發明的預防和/或治療登革病毒病的產品，其活性成分為由登革病毒DENV1的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV2的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白、登革病毒DENV3的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白和登革病毒DENV4的包膜蛋白E的結構域III所示蛋白組成的組合物。實驗證明，用本發明疫苗免疫機體，可以激發機體的體液免疫應答，并對四個血清型登革病毒感染的乳鼠均具有保護效果，抵抗四個血清型登革病毒的感染。本發明對于預防人類登革病毒的感染具有重要的現實意義。
文檔編號A61K39/12GK102824633SQ20111016223
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者秦成峰, 趙慧, 鄧永強, 姜濤, 秦鄂德 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所