專利名稱：一種篩選、識別干細胞的試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選、識別嚙齒動物、人類或其他哺乳動物干細胞的試劑盒及其應用。
背景技術：
眾所周知，干細胞具有下述特征1)長期的自我更新能力；2)能夠產生高度分化的其它種類細胞；3)本身處于未分化狀態；4) 一般處于慢周期或靜息狀態；5)組織中處于相應的小生境(niches)內。干細胞包括胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)和成體干細胞(AdultStem Cells, ASCs)，胚胎干細胞是全能性的，在理論上于體內可以再生身體內幾乎任意組 織，但由于其一方面在獲取的倫理、道德等方面遇到了問題，另一方面其在應用上遇到了較為嚴重的問題，例如移植的胚胎干細胞可控性差，有生長為腫瘤的風險，并且其在移植受體后將會受到受體免疫系統的排斥等等，從而限制了其應用。鑒于胚胎干細胞研究及應用所遇到的上述問題，科學家期望通過核編程的方式讓成體細胞能夠回到類胚胎干細胞的狀態，經過幾十年的研究，終于，在2006年日本科學家山中伸彌(Yamanaka S，Cell, 2006. 126(4) :663-676,日本專利 2008-131577)采用四個誘導因子0ct4、nanog、sox2等導入正常人成纖維細胞內，成功重編程其為類胚胎干細胞，被稱為誘導多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),該細胞具有類似人類胚胎干細胞的特性，它雖然與胚胎干細胞相似，具有能分化成生物體內所有組織的潛力，但是 Lowry 和 Plath 發現(Lowry 等,CellStemCell, 2009. 5(1) : 111-123)，當進行分子標簽比較的時候，胚胎干細胞中某些基因的表達明顯與iPS細胞不同，與胚胎干細胞相比，iPS細胞研究仍有問題亟待解決，例如iPSCs具更高基因畸變頻率(Loring等，Cell StemCell,2011.8(1) :106-118)、致瘤性風險、編程效率低等等需要克服，因而，盡管研究人員取得了令人印象深刻的進展，要把細胞再編程用于治療疾病還需要更多一些突破。成體干細胞是另外一類具有修復、再生、替代能力的未分化細胞類型，通常位于特定的小生境內，在受到外界損傷后，其會動員或者產生新的干細胞，通過增殖、分化的方式形成新的功能細胞，從而調節組織和器官細胞數量保持動態平衡。成體干細胞的多能性特點首先在骨髓中得到的成體干細胞得以發現。造血干細胞是目前研究的最為詳盡的成體干細胞之一，在過去近40年里一直是干細胞領域研究的主題，它們在體內進行自我更新的細胞分裂，在單細胞水平分化為所有的造血成份，并在機能上使得重度骨髓抑制的動物和人的骨髓得以恢復。成體干細胞研究的基礎和其在臨床上的應用先決條件和最關鍵條件之一是對干/祖細胞的有效識別、篩選分離。最近越來越多的證據表明成體干細胞可見于多種成熟組織(Moore KA, Science, 2006. 311(5769) :1880-1885)，并且很可能是由處于靜息態(細胞周期外且低代謝狀態)和激活(細胞周期內且不能保留DNA標記)態的干細胞共存(Li等，Science, 2010. 327(5965) :542-545)，但從成體中分離干細胞仍是極具挑戰性的任務，一方面在于其數量較少且更難于定位、篩選分離各種組織特異性干細胞，另外一方面在于缺少可靠的特異性分子標記物對其進行識別。當前，主要有以下現有技術公開了如何得到相關的成體干細胞I)采用分子標志物篩選候選的干細胞，例如Thy-l1 或FLK2-Lineage_Sca-l+c-Kit+ 分選造血干細胞群(Christemsen JL 等，PNAS, 2001. 98 14541-14546 ；Uchida N 等，Experimental hematology,1996. 24 :649-659)，用 CD14.免疫磁性分離的方法從外周血篩選新的干細胞群(PCT/055950干細胞的提純、識別及用途)用 a 6bri10G7dim(LiA 等，PNAS, 1998. 95(7) :3902-3907 ;Tani H 等，PNAS，2000. 97 (20)10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS，2000. 97 (25) :13473-13475)識別人類、嚙齒動物來源的上皮干細胞，但其有效性還有待進一步證實；2)以其他技術聯合分子標記進行干細胞的篩選、富集比如公開號為CN108677A的一種干細胞靶向定位富集的方法，采用針對干細胞表面標志性抗原的特異性抗體與干細 胞結合，再標記上免疫磁珠，移植后通過兩個異性磁極將干細胞富集于靶組織內。Azuma等研究小組者采用機械或酶消化分離后結合已知分子標志物的方法，希望從成體組織中直接分離出干/祖細胞，從而對其進行鑒別及后續的功能研究(AzumaH等，Hepatology,2003.37(6) :1385-1389 ；ffright N 等，Biochem Biophys Res Commun,2008. 366(2)367-372)。通過小鼠遺傳學標志譜系試驗等實驗，結合所發現的分子標志物，例如Musashi-1、Lgr5 等提供了鑒定干細胞的可能(Barker N 等，Nature, 2007. 449 (7165)1003-1007 ;HaegebarthA等，Am J Pathol, 2009. 174(3) :715-721)，然而它們的有效性還有待進一步證實。不足之處是，磁珠標記可能會影響細胞活力，而酶消化作用時間又較長，富集后細胞活力不高，且這些分離的細胞群并不是同質類型的，而是由許多不同分化狀態或增殖能力的混合細胞群組成，非常不純。3)側群篩選法(side population，SP)，分化程度較低的干/祖細胞通常表達一些ATP結合轉運蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，細胞常利用ATP能量把外來的有毒物質從細胞內排出，以達到保護自身的目的，早期Goodell等(Goodell等，J ExpMed, 1996. 183(4) =1796-1806)的研究發現，當用Hoechst33342對骨髓細胞進行染色后，造血干細胞具有很強的排出染液的能力，被稱為側群細胞。最近，Wulff等(Wulff等，Haematologica, 2003. 88 (4) :368-378)從小鼠肝內分離到一群 SP 細胞，CD45+或 CD45-細胞亞群，其所占的百分比為1%，體外培養均可產生肝系和造血系起源的克隆，類似的研究結果在人類的成體肝組織內也分離到類似的SP細胞。此方法已被用于從其他器官和組織中篩選潛在的干/祖細胞群，不足之處是，當從實體組織中篩選出SP細胞后，由于獲得活細胞的能力有限，當此類細胞進行移植后可能影響他們的重塑能力。4)采用損傷聯合移植實驗進行干細胞特性的研究，例如Li等(LiWL等，Stem cells, 2006. 24 (2) :322-332)從倒千里光喊/部分肝切除(Retror sine/PartialHepatectomy, Rs/PH)處理后成年小鼠的肝內分離到一種細胞群，在培養期間，其可以分化為肝細胞和膽管上皮細胞，Li等認為這群細胞具有干/祖細胞潛能，被稱為肝上皮祖細胞(liver epithelial progenitor cells, LEPCs)。移植實驗提示其具有分化的潛能。然而類似的損傷試驗加入的藥物通常具有致癌特性，是否其導致組織中的細胞發生癌變，轉變為具有干細胞特性的前體細胞尚不清楚。
5)根據核形態進行干細胞的鑒別，例如，PCT/021504專利公開了一種根據細胞核形態鑒定干細胞的方法，通過觀察經處理后的組織樣品中分布的細胞核形態，核形態型的類型選自鐘形、雪茄形、凝聚球形、球形、卵形、香腸形、腎形和子彈形，從而允許顯微組織學/病理學技術人員根據核形態，將細胞區分為干細胞/非干細胞。6)幼年動物脈沖追蹤法進行干細胞的識別，早期的研究發現，當加入可以“標記”DNA的標記后，與分裂迅速的祖細胞相比，干細胞由于其具有慢周期或靜息期的特性而具有長期保留 DNA 標記的能力(Bickenbach JR, J Dent Res, 1981. 60 (Spec No C)1611-1620)，這一方法已經被用于識別小腸、子宮內膜、胰腺、腎乳頭等組織中的干細胞。7)基于干細胞的功能特征，例如耐受藥物或其他試劑的處理，報道了用于激活干細胞的方法，(Gordon MY 等，Leukemia research, 1985. 9 :1017-1021 ;BerardiAC 等，Science, 1995. 267 :104-108 ；Sharkis SJ 等，Stem cells，1997. 15 (Suppl I) :41-44;Juopperi TA 等，Experimental hematology, 2007. 35 :335-341),且用一些分子表面標記物分離這些細胞，然而，不足之處，一方面在于是他們所使用的分子標記仍沒有很強的特異性，且其中仍不清楚是否混雜有其它分期的祖細胞以及原先存在的增殖細胞，很可能其中 仍是一個異質細胞群(Berardi AC等，Science，1995. 267 :104-108)，更重要的是，沒有進一步采用可靠且普遍有效的方法用于識別這些激活的干細胞。其他如公開號CN101768570的專利公開了一種富集和提取成體干細胞的方法，它采用一種多孔的三維組織工程材料埋植到人或動物體內，使得成體干細胞在材料中富集，從而分離得到干細胞。上述所公開描述的方法或技術既有優勢也有劣勢，例如流式細胞分選法和免疫磁珠法分選往往是根據細胞表面特殊的標記來篩選分離干細胞，但目前特異的細胞表面標記很難達到共識，缺少特異性的分子表面標志，另外，需要借助專業人士的操作儀器來完成，分離時間較長，耗費較高，并且通過一定處理使之帶上儀器能識別的標記，這種化學過程對細胞狀態會造成一定的影響，操作不當甚至引起分化或導致細胞走向凋亡，另一方面，儀器分選效率不高，長時間的分選過程，導致細胞活力下降，細胞狀態改變等等問題，這些并不適用于大批量篩選富集干細胞用于科研、臨床等使用的需求。再者，缺乏功能性證據表明LRCs具有干細胞的功能特征，并且BrdU并不是一個細胞表面標志(Blanpain等，Cell，2004. 118(5) :635-648);通過細胞核形態鑒別分離干細胞專業和經驗要求高，易于出現鑒別錯誤，且操作過程和時間比較長。因而，成體干細胞的研究也逐漸為臨床醫學提供了一個發展新療法的機會，在組織工程和基因工程技術發展起來的細胞治療和基因治療是近年來生物醫學領域中的研究熱點和前沿，例如使用產生的自體經修飾后的干細胞直接施用給患者從而用于基因治療(Nathalie Cartier 等，Science，2009. 326 (5954) :818-823)和細胞治療，成體干細胞作為基因或細胞治療的載體和首選靶細胞，其中一個益處是減少移植時引起的免疫排斥。成體干細胞在作為臨床細胞治療、藥物篩選、人工組織的“種子庫”，在腫瘤、創傷修復、組織或器官功能重建、各種退行性疾病的治療等方面將發揮重要的作用。
發明內容
本領域需要克服現有技術中所存在的缺點，為了克服上述方法上的不足及提供進一步相關的優點，本發明公開一種篩選、識別干細胞的試劑盒及其制備方法與應用。本發明提供的試劑盒具有簡便快捷、特異性強和普遍適用性，可用于篩選、識別嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的正常離體或活檢組織、細胞系、腫瘤/癌前組織、癌/腫瘤性組織、轉移瘤/癌組織來源的干細胞，有益于基礎、臨床與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復和再生受損或患病組織等領域的應用。 本發明的試劑盒包括I)篩選試劑；2)細胞洗滌液； 3)識別試劑；4)細胞因子組合；5)描述使用方法的說明書，以及任選的；6)混合容器和裝置。其中，所述篩選試劑選擇包括抗生素化療藥物、抗代謝化療藥物、燒化劑化療藥物、激素及內分泌化療藥物、植物化療藥物、亞硝脲類化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、草酸鉬、鉬類、丙亞胺、羥基脲和氨烯咪胺的一種或兩種以上的組合。其中，所述識別試劑選擇BrdU、氚標記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基_2’脫氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可標記所述干細胞群或細胞系或其子代的任一分子或物質。其中，所述化療藥物的濃度約lmg/kg-100mg/kg細胞重量，且所述化療藥物作用細胞群的時間范圍為0. lh-72h，或選擇使用所述的化療藥物的濃度約10mg/kg-50mg/kg細胞重量，且所述化療藥物作用細胞群的時間范圍為0. 5h-36h。其中，所述識別試劑使用的濃度約0. lmg/kg-15mg/kg細胞重量,所述標記作用于所述篩選后干細胞群的時間為0. 01h-96h。進一步，所述化療藥物選擇以抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物聯合鉬類化療藥物任一一種的組合。其中，所述細胞洗滌試液可為生理鹽水、PBS、或其他緩沖液。其中，所述細胞因子選擇EGF、B27、bEGF、N2、Heparin, HF為基礎的細胞因子組合，其中所述EGF終濃度為5ng/mL-100ng/mL,優選10ng/mL-50ng/mL,所述bFGF終濃度為5ng/mL-100ng/mL,優選 10ng/mL-50ng/mL,所述 Heparin 終濃度為 2 u g/mL-40 u g/mL,所述B27、N2終濃度分別為2ng/mL-50ng/mL,優選10ng/mL-30ng/mL,所述LIF (白血病抑制因子)終濃度為 100U/mL-1500U/mL，優選 500U/mL-1000U/mL。其中，所述試劑盒的標記干細胞攜帶的標記也可選擇為磁性氧化鐵標記、量子點標記、GFP標記、RFP標記或其他任何可以讓所述篩選的干細胞和或子代攜帶的標記。本發明的試劑盒涉及本發明人預料之外的發現，該試劑盒可特異性的從混合細胞群中篩選、富集到干細胞群，并采用細胞標記對篩選的干細胞群和或其子代進行識別。本發明還進一步公開了篩選、識別干細胞試劑盒的使用方法，其使用包括如下步驟a)細胞預處理收集處理后的細胞，臺盼藍染色計算細胞存活率，隨后，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min,丟棄上清,稱重細胞重量。b)混合篩選試劑通過篩選試劑混合容器進行篩選試劑的混合。
c)篩選干細胞細胞重新接種于培養瓶或培養板內按照細胞重量加入一定濃度的篩選試劑，隨后，于37°C，5% CO2含多種細胞因子的條件下培養一定時間再收集細胞，其中，篩選試劑加入次數可以為I 10次。d)計算細胞存活率收集細胞，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min，丟棄上清，加入細胞洗滌液洗滌I 2次，計算細胞存活率后，離心丟棄上清，稱重細胞重量。e)混合識別試劑通過識別試劑混合容器進行識別試劑的混合。f)識別干細胞加入細胞標記試劑對篩選后的干細胞進行識別，于37°C，5% C02包含多種細胞因子組合的條件下培養，細胞標記的濃度為約0. lmg/kg-15mg/kg細胞重量，其中，所述標記作用時間為0. 01h-96h，標記加入次數可以為I 20次。g)標記檢測每隔一定時間采用單克隆抗體或多克隆抗體以特異性檢測細胞標 記，其中所述抗體為免疫球蛋白分子，能夠結合靶目標，其結合方式是至少識別免疫球蛋白的可變區的一個抗原位點，所述抗體不僅包括全抗體分子，也包括它們的片段，例如Fab、Fab’、Fv、單鏈(ScFv)等，或者它們的突變體，或者是包含抗體部分的融合蛋白，完全化的或部分化的人源化抗體及任何其他的被修飾的免疫球蛋白分子，其中所述免疫球蛋白分子包含一個抗原結合位點，其中，所述抗體選擇攜帶熒光素、生物素、放射性標記、酶標記、熒光底物標記、顯色底物標記、化學發光標記等中的任何一種。其中，所述試劑盒篩選、識別的干細胞群來自嚙齒動物、人類及其他哺乳動物的正常離體或活檢組織、細胞系、腫瘤/癌前組織、癌/腫瘤性組織、轉移瘤/癌組織的一種或兩種以上的組合。進一步，所述篩選分離的干細胞群和或其子代源自肝臟組織、腎臟組織、心臟組織、胰腺組織、腸組織、表皮組織、卵巢組織、輸卵管組織、睪丸組織、神經組織、胃組織、肺組織、乳腺組織、脂肪組織、肌肉組織、甲狀腺、間充質、脾臟組織、骨髓組織、外周血、臍帶血、經血、胎盤、牙組織、眼組織和腦組織中的一種或兩種以上所組成的組中。其中，所述組織來源于嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的活檢或離體正常組織。進一步，所述篩選分離的干細胞群和或其子代源自介于正常組織與癌/腫瘤性組織之間的嚙齒動物、人類及其他哺乳動物來源的腫瘤/癌前任意病變組織。進一步，所述篩選分離的干細胞群和或其子代源自肝癌、腎癌、胰腺癌、腸癌、卵巢癌、乳腺癌、腦癌、肺癌、肝部轉移瘤、肺轉移瘤、腫瘤細胞系和或腫瘤/癌活檢、離體組織等材料的一種或兩種以上所組成的組中。其中，腫瘤細胞系包括源自嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的腫瘤組織建立的腫瘤細胞系。其中，所述試劑盒有益于基礎、臨床與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復和再生受損組織等領域的應用。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施例進行說明，但本領域的技術人員應當理解，本發明的實施例目的是為了清楚的說明本發明的優點，不是用于限制本發明，任何基于本發明的修改、替換均落在本發明的精神范疇和保護范圍之內。實施例I肝癌干細胞篩選、識別試劑盒及其使用
一、肝癌干細胞篩選、識別試劑盒I)篩選試劑；2)生理鹽水；3)識別試劑；4)細胞因子組合；5)肝癌干細胞篩選、識別的使用說明書；6)篩選、識別試劑的混合容器。 其中，篩選試劑選擇氟尿嘧啶、環磷酰胺、卡鉬。
其中，識別試劑選擇BrdU試劑。其中，試劑盒在生產過程中保持無菌操作以確保其內含物是無菌的，且內毒素含量檢測< 0. 5EU/mL表示試劑盒合格。二、材料與方法I.材料I. I肝癌組織取材嚙齒動物、人或其他哺乳動物的活檢或離體新鮮肝癌組織樣品。I. 2組織處理方法PBS緩沖液清洗組織2 3次，再用眼科剪將組織剪碎成約Imm3的小塊，加入胰酶(濃度為0. 1% 0. 3% )后在37°C消化IOmim 60min，加入與胰酶溶液體積等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K(美國Hyclone公司)終止反應，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min,丟棄上清,加入低溫預冷的含2%胎牛血清的PBS洗漆沉淀2 3次，用無菌100目 400目篩網過濾，從而濾出細胞懸液。2.試劑盒的使用方法a、細胞預處理獲得肝癌組織的單細胞懸液后，臺盼藍染色計算細胞存活率，隨后，低溫以800g離心3mim 5min,丟棄上清,稱重細胞重量。b、混合篩選試劑把篩選試劑瓶中所包含的試劑化療藥物氟尿嘧啶、環磷酰胺、卡鉬用試劑混合容器進行混合，終濃度分別為10mg/mL、4mg/mL、4mg/mL。C、篩選干細胞細胞重新接種于培養瓶或培養板或培養皿內按照細胞重量加入經混合后的篩選試劑，隨后，于37°C，5% CO2條件下培養16h再收集細胞，篩選試劑加入次數為I次。d、計算細胞存活率收集細胞，低溫以800g離心3mim 5min，丟棄上清，加入細胞洗滌液洗滌I 2次，計算細胞存活率后，離心丟棄上清，稱重細胞重量。e、混合細胞標記把識別試劑瓶中所包含的細胞標記試劑BrdU，用試劑混合容器進行混合，終濃度為2mg/kg細胞重量。f、識別干細胞加入混合后細胞標記試劑識別肝癌干細胞，于37°C，5% CO2包含lOng/mL 的 B27、5ng/mL 的 N2、5ng/mL 的 EGF、5ng/mL 的 bFGF、10u g/mL 的 Heparin,900U/ml的LIF的條件下培養，其中，所述標記作用時間為36h，每隔12h加入一次，標記加入次數共為3次。g、標記檢測每隔12h進行細胞標記的檢測，檢測采用FITC熒光素標記的抗BrdU抗體。其中，整個操作過程保持在無菌條件下進行。
根據本發明的試劑盒篩選的肝癌干細胞，可作為臨床、基礎與應用研究、藥物篩選等領域的應用工具。實施例2心臟干細胞篩選、識別試劑盒及其使用一、心臟干細胞篩選、識別試劑盒I)篩選試劑；2) PBS 緩沖液；3) BrdU 試劑；4)細胞因子組合；
5)心臟干細胞篩選、識別的使用說明書；6)篩選、識別試劑的混合容器。其中，篩選試劑選擇氟尿嘧啶、絲裂霉素。其中，識別試劑選擇BrdU和5_乙炔基_2’脫氧尿嘧啶核苷(EDU)試劑。其中，試劑盒在生產過程中保持無菌操作以確保其內含物是無菌的，且內毒素含量檢測< 0. 5EU/mL表示試劑盒合格。二、材料與方法I.材料I. I心臟組織取材嚙齒動物、人或其他哺乳動物的正常活檢或離體新鮮心臟組織樣品。I. 2組織處理方法PBS緩沖液清洗組織2 3次，再用眼科剪將組織剪碎成約Imm3的小塊,加入膠原酶(濃度為2 10mg/mL)后在37°C消化IOmim 30min,加入與膠原酶溶液體積等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K(美國Hyclone公司)終止反應，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min,丟棄上清,加入低溫預冷的含2%胎牛血清的PBS洗漆沉淀2 3次，用無菌200目 400目篩網過濾。2.試劑盒的使用方法a、細胞預處理獲得心臟組織的單細胞懸液后，臺盼藍染色計算細胞存活率，隨后，低溫以900g離心3mim 5min,丟棄上清,稱重細胞重量。b、混合篩選試劑把篩選試劑瓶中所包含的試劑化療藥物氟尿嘧啶、絲裂霉素用試劑混合容器進行混合，終濃度分別為2mg/mL、4mg/mL。C、篩選干細胞細胞重新接種于培養瓶或培養板內按照細胞重量加入經混合后的篩選試劑，隨后，于37°C，5% CO2條件下培養24h再收集細胞，其中，篩選試劑加入次數為2次，每隔12小時加入I次。d、計算細胞存活率收集細胞，低溫以900g離心3mim 5min，丟棄上清，加入細胞洗滌液洗滌I 2次，計算細胞存活率后，離心丟棄上清，稱重細胞重量。e、混合細胞標記把識別試劑瓶中所包含的細胞標記試劑BrdU和5_乙炔基_2’脫氧尿嘧啶核苷(EDU)，用試劑混合容器進行混合，終濃度0. 8mg/kg、0. lmg/kg細胞重量。f、識別干細胞加入混合后細胞標記試劑識別心臟干細胞，于37°C，5% CO2包含lOng/mL 的 B27、10ng/mL 的 N2、30ng/mL 的 EGF、30ng/mL 的 bFGF、10u g/mL 的 Heparin,600U/ml的LIF的條件下培養，其中，所述標記作用時間為24h，每隔6h加入一次，標記加入次數共為4次。
g、標記檢測每隔12h進行細胞標記的檢測，檢測采用FITC熒光素標記的抗BrdU抗體。其中，整個操作過程保持在無菌條件下進行。根據本發明的試劑盒篩選的心臟干細胞，可作為臨床、基礎與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復受損或患病組織等領域的應用工具。實施例3肺干細胞篩選、識別試劑盒及其使用一、肺干細胞篩選、識別試劑盒I)篩選試劑；2) PBS 緩沖液；
3)fcdU 試劑；4)細胞因子組合；5)使用說明書；6)篩選、識別試劑的混合容器。其中，篩選試劑選擇氟尿嘧啶、絲裂霉素。其中，識別試劑選擇BrdU試劑。其中，試劑盒在生產過程中保持無菌操作以確保其內含物是無菌的，且內毒素含量檢測< 0. 5EU/mL表示試劑盒合格。二、材料與方法I.材料I. I肺臟組織取材嚙齒動物、人或其他哺乳動物的正常活檢或離體新鮮肺臟組織樣品。I. 2組織處理方法PBS緩沖液清洗組織2 3次，再用眼科剪將組織剪碎成約Imm3的小塊,加入膠原酶(濃度為4 10mg/mL)后在37°C消化IOmim 45min,加入與膠原酶溶液體積等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K(美國Hyclone公司)終止反應，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min,丟棄上清,加入低溫預冷的含2%胎牛血清的PBS洗漆沉淀2 3次，用無菌200目 400目篩網過濾。2.試劑盒的使用方法a、細胞預處理獲得肺臟組織的單細胞懸液后，臺盼藍染色計算細胞存活率，隨后，低溫以850g離心3mim 5min,丟棄上清,稱重細胞重量。b、混合篩選試劑把篩選試劑瓶中所包含的試劑化療藥物紫杉醇、足葉乙甙用試劑混合容器進行混合，終濃度分別為3mg/mL、10mg/mL。c、篩選干細胞細胞重新接種于培養瓶或培養板內按照細胞重量加入經混合后的篩選試劑，隨后，于37°C，5% CO2條件下培養48h再收集細胞，其中，篩選試劑加入次數為2次，每隔24小時加入I次。d、計算細胞存活率收集細胞，低溫以850g離心3mim 5min，丟棄上清，加入細胞洗滌液洗滌I 2次，計算細胞存活率后，離心丟棄上清，稱重細胞重量。e、混合細胞標記把識別試劑瓶中所包含的細胞標記試劑BrdU，用試劑混合容器進行混合，終濃度4mg/kg細胞重量。f、識別干細胞加入混合后細胞標記試劑識別肺干細胞，于37°C，5% CO2包含8ng/mL 的 B27、8ng/mL 的 N2、lOng/mL 的 EGF、lOng/mL 的 bFGF、IO u g/mL 的 Heparin, 900U/ml的LIF的條件下培養，其中，所述標記作用時間為24h，每隔6h加入一次，標記加入次數共為4次。g、標記檢測每隔12h進行細胞標記的檢測，檢測采用TRITC熒光素標記的抗BrdU抗體。其中，整個操作過程保持在無菌條件下進行。根據本發明的試劑盒篩選的肺干細胞，可作為臨床、基礎與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復受損或患病組織等領域的應用工具。顯然在不違反本發明的領域及范疇下，可以對上述篩選、識別干細胞的試劑盒進 行成分的修飾及或增加，本發明是以上述實施例進行試劑盒及其應用的說明，并不是用于限制試劑盒的使用，對此進行的任何等司替換、修改、增加均屬于本發明的保護范疇內。
權利要求
1.一種篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 1)篩選試劑； 2)細胞洗滌液； 3)識別試劑； 4)細胞因子組合； 5)描述使用方法的說明書，以及任選的； 6)混合容器和裝置。
其中，所述篩選試劑選擇包括抗生素化療藥物、抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、激素及內分泌化療藥物、植物化療藥物、亞硝脲類化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、草酸鉬、鉬類、丙亞胺、羥基脲和氨烯咪胺的一種或兩種以上的組合。
其中，所述識別試劑選擇BrdU、氚標記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基_2’脫氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可標記所述干細胞群或細胞系或其子代的任一分子或物質。
2.根據權利要求I所述的篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述化療藥物的濃度約lmg/kg-100mg/kg細胞重量，且所述化療藥物作用細胞群的時間范圍為O. lh_72h，或選擇使用所述的化療藥物的濃度約10mg/kg-50mg/kg細胞重量，且所述化療藥物作用細胞群的時間范圍為O. 5h-36h。
3.根據權利要求I所述的篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述識別試劑使用的濃度約O. lmg/kg-15mg/kg細胞重量，所述標記作用于所述篩選后干細胞群的時間為O.01h-96h。
4.根據權利要求I所述的篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述化療藥物選擇以抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物聯合鉬類化療藥物任 種的組合。
5.根據權利要求I所述的篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述細胞洗滌試液可為生理鹽水、PBS、或其他緩沖液。
6.根據權利要求I所述的篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述細胞因子選擇EGF、B27、bEGF、N2、Heparin, LIF為基礎的細胞因子組合，其中所述EGF終濃度為5ng/mL-100ng/mL,優選 10ng/mL-50ng/mL,所述 bFGF 終濃度為 5ng/mL-100ng/mL,優選10ng/mL-50ng/mL,所述 Heparin 終濃度為 2 μ g/mL-40 μ g/mL,所述 B27、N2 終濃度分別為2ng/mL-50ng/mL,優選10ng/mL-30ng/mL,所述LIF(白血病抑制因子)終濃度為IOOU/mL-1500U/mL,優選 500U/mL-1000U/mL。
7.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的標記干細胞攜帶的標記也可選擇為磁性氧化鐵標記、量子點標記、GFP標記、RFP標記或其他任何可以讓所述篩選的干細胞和或子代攜帶的標記。
8.根據權利要求I至7所述的篩選、識別干細胞試劑盒的使用方法，其使用包括如下步驟 a)細胞預處理收集經處理后的細胞，臺盼藍染色計算細胞存活率，隨后，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min,丟棄上清,稱重細胞重量。
b)混合篩選試劑通過篩選試劑混合容器進行篩選試劑的混合。
c)篩選干細胞細胞重新接種于培養瓶或培養板或培養皿內按照細胞重量加入一定濃度的篩選試劑，隨后，于37°C，5% CO2條件下培養一定時間再收集細胞，篩選試劑加入次數可以為I 10次。
d)計算細胞存活率收集細胞，低溫以800 IOOOg離心3mim 5min，丟棄上清，加入細胞洗滌液洗滌I 2次，計算細胞存活率后，離心丟棄上清，稱重細胞重量。
e)混合識別試劑通過識別試劑混合容器進行識別試劑的混合。
f)識別干細胞加入細胞標記試劑對篩選后的干細胞進行識別，于37°C，5%C02包含多種細胞因子組合的條件下培養，細胞標記的濃度為約O. lmg/kg-15mg/kg細胞重量，其中，所述標記作用時間為O. 01h-96h，標記加入次數可以為I 20次。
g)標記檢測每隔一定時間采用單克隆抗體或多克隆抗體以特異性檢測細胞標記，其中所述抗體為免疫球蛋白分子，能夠結合靶目標，其結合方式是至少識別免疫球蛋白的可變區的一個抗原位點，所述抗體不僅包括全抗體分子，也包括它們的片段，例如Fab、Fab’、Fv、單鏈(ScFv)等，或者它們的突變體，或者是包含抗體部分的融合蛋白，完全化的或部分化的人源化抗體及任何其他的被修飾的免疫球蛋白分子，其中所述免疫球蛋白分子包含一個抗原結合位點，其中，所述抗體選擇攜帶熒光素、生物素、放射性標記、酶標記、熒光底物標記、顯色底物標記、化學發光標記等中的任何一種。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒篩選、識別的干細胞群來自嚙齒動物、人類及其他哺乳動物的正常離體或活檢組織、細胞系、腫瘤/癌前組織、癌/腫瘤性組織、轉移瘤/癌組織的一種或兩種以上的組合。
10.根據權利要求I所述的篩選、識別干細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒有益于基礎、臨床與應用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復和再生受損或患病組織等領域的應用。
全文摘要
本發明涉及一種篩選、識別干細胞的試劑盒及其應用，本發明的試劑盒包括篩選試劑、細胞洗滌液、識別試劑、細胞因子組合、使用說明書及相應試劑混合容器。試劑盒所述的篩選試劑為化療藥物，識別試劑用于對篩選后的干細胞群和或其子代進行識別，本試劑盒可實現工業化批量生產，使用簡便、特異性強、實用有效，可直接用于嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的干細胞篩選、識別，具有廣泛應用前景。
文檔編號A61K35/42GK102796700SQ20111014966
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者李福生, 盧磊磊, 盧淼淼, 盧晶晶 申請人:李福生, 盧磊磊