專利名稱：利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法
技術領域：
本發明涉及制備雞基因工程免疫增強劑的方法。
背景技術：
Akirins是2008年發現的，在不同物種間高度保守的核蛋白。Akirin是編碼201 個氨基酸的蛋白，在N-端和C-端分別表現出兩個保守的結構域，N-端24- 氨基酸殘基之間存在核定位信號。在斑馬魚、非洲爪蟾、人和鼠中具有兩個同源基因(akirinl和 akirin2)，在昆蟲(蜜蜂、黃粉甲蟲、岡比亞按蚊和果蠅)和雞中只有一個拷貝(akirin2)， 但在植物、酵母和細菌中未發現該基因。Akirin2作為天然免疫反應信號通路所必需的核內因子，在果蠅和小鼠中的免疫和炎癥反應中起作用。基因工程免疫增強劑就是把一種或多種細胞因子基因(目前常用基因有IL-1、 IL-2、IL-6、IL-18等)克隆到真核表達載體上，將構建的重組質粒直接導入體內，以增強疫苗的抗體產生和細胞免疫水平。為科學評價以重組細胞因子為主要成分的基因工程免疫增強劑在畜禽體內對不同種類疫苗的免疫增強作用，國內外學者進行了多次科學嘗試，取得了較好的免疫增強效果。當前，隨著家禽飼養規模的不斷擴大，國內外交往和貿易的日益頻繁，疾病傳播的機會大大增加，加之雞的免疫抑制性疾病及其他一些因素所造成的疫苗免疫抗體水平下降和免疫失敗等問題，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。目前傳統疫苗免疫增強劑存在增強效果不好，制備費用較高，毒副反應大等問題， 以及現有基因工程免疫增強核酸疫苗的只利用單一細胞因子基因可能帶來的免疫增強效果片面性問題，不能夠廣泛的提高疫苗、菌苗免疫效果。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有傳統疫苗免疫增強劑存在增強效果不好，制備費用較高，毒副反應大，以及現有基因工程免疫增強核酸疫苗存在不能夠廣泛的提高疫苗、菌苗免疫效果的問題，而提供利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法。利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法按以下步驟進行一、禾U用NCBI中紅原雞的EST數據庫，以人的akirin2基因(GenBank 匪 001007589)編碼序列(CDS)為靶標，利用BLAST軟件進行電子克隆，獲得雞akirin2基因全長編碼序列；二、采用Trizol試劑提取3日齡雛雞骨骼肌的總RNA，采用二步法RT-PCR技術獲得雞akirin2基因全長編碼序列，經純化后克隆到載體pMDIS-T并測序鑒定，獲得含雞 akirin2基因的重組pMD18_T載體；三、根據雞akirin2基因全長編碼序列，設計引物Pl和P2，并使引物Pl和P2的 5'-端分別帶有HindIII和EcoRI酶切位點，然后將重組pMD18_T載體中的雞akirin2基因亞克隆到表達載體pcDNA3. 0中構建成重組表達載體pcDNA-akirin ；
四、采用0. lmol/L的無菌PBS緩沖液稀釋重組表達載體pcDNA-akirin至濃度為 l.og/μ 1，于-20°c保存，即完成利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑；其中步驟二中雞akirin2基因全長編碼序列如SEQ ID No. 1所示；步驟三中引物Pl 的核苷酸序列為5' -CCCAAGCTTATGGCGTGCGGCGCCACTTTG-3'， 引物 P2 的核苷酸序列為5 ‘ -CGGAATTCTCATGAAACGTAACTGGCAGG-3 ‘；步驟四中PBS 緩沖液=NaCl 137mmol/L、KCl 2. 7mmol/L、Na2HPO4IOmmo 1/L, KH2P042mmol/L, pH 為 7· 2。本發明開發以雞akirin2基因為主要成分的基因工程免疫增強劑可以提高疫苗抗體水平，同時，由于akirin2基因在理論上可以廣泛提高機體IL_1、IL_6和toll-樣受體等多種免疫相關因子表達水平，因此本發明中制備的雞基因工程免疫增強劑可避免現有核酸疫苗利用單一因子免疫增強效果的片面性和不均衡性，進而具有對各種疫苗、菌苗適用面廣等特點。采用不同方式接種雞基因工程免疫增強劑對疫苗的免疫增強作用不同，其中以肌肉注射接種效果為最好(可使相應疫苗免疫抗體水平提高10% 25%)；雞基因工程免疫增強劑不僅可以在生產實踐中與疫苗聯合應用，而且還可以作為疫苗免疫佐劑直接用于疫苗生產中，具有廣闊的應用前景；本發明對雞免疫抑制性疾病的防治、提高疫苗免疫效率、降低疫苗生產成本等具有重要意義，為將來雞基因工程免疫增強劑的產業化生產和推廣應用奠定了基礎。此外，本發明中雞基因工程免疫增強劑的制備方法簡單，成本低廉，毒副反應小，為akirin2基因在哺乳動物和人中免疫增強劑的開發和利用提供理論和實驗依據。
圖1為具體實施方式
一中免疫增強效果圖，其中 表示第1組，■表示第2組，▲ 表示第3-1組， 表示第3-2組，X表示第3-3組，*表示第4組。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法按以下步驟進行一、禾U用NCBI中紅原雞的EST數據庫，以人的akirin2基因(GenBank 匪 001007589)編碼序列(⑶幻為靶標，利用BLAST軟件進行電子克隆，獲得雞akirin2基因編碼序列；二、采用Trizol試劑提取3日齡雛雞骨骼肌的總RNA，采用二步法RT-PCR技術獲得雞akirin2基因全長編碼序列，經純化后克隆到載體pMDIS-T并測序鑒定，獲得含雞 akirin2基因的重組pMD18_T載體；三、根據雞akirin2基因全長編碼序列，設計引物Pl和P2，并使引物Pl和P2的 5'-端分別帶有HindIII和EcoRI酶切位點，然后將重組pMD18_T載體上的雞akirin2基因亞克隆到表達載體pcDNA3. 0中構建成重組表達載體pcDNA-akirin ；四、采用0. lmol/L的無菌PBS緩沖液稀釋重組表達載體pcDNA-akirin至濃度為1.0 μ g/ μ 1，于-20°C保存，即完成利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑；其中步驟二中雞akirin2基因全長編碼序列如下ATGGCGTGCGGCGCCACTTTGAAAAG GACTCTGGATTTCGACCCGCTGCTCAGCCCGGCGTCCCCGAAACGGAGGCGATGTGCGCCATTGTCAGCCCCGGCCT CGGCCGCCGCCTCCTCCTCCTCCTTCGCCTCCCCGCAGAAATACCTGCGCATGGAGCCCTCGCCCTTCGGAGAGGTG TCCTCCCGGCTCACCACAGAACAAATTCTGTACAACATAAAACAGGAGTACAAACGCATGCAGAAGAGGAGACACTT AGAAAATAGCTTCCAGCAGACAGATCCTTGTTGTTCTACTGATGCACAGCCACATGCGTTTCTTCTTACTGGACCAG CTTTGCCAGGTACTTCATCTGCAGCATCATCACCATTGAAAAAAGAACAGCCTCTGTTTACTCTCAGACAAGTTGGA ATGATCTGTGAACGTTTGCTGAAAGAACGTGAAGAGAAAATCCGTGAAGAGTATGAAGAAATTTTGACCACAAAACT TGCAGAACAATACGACGCGTTTGTGAAGTTCACGCATGATCAAATCATGCGACGATATGGAGAACAGCCTGCCAGTT ACGTTTCATGA ；步驟三中引物Pl 的核苷酸序列為5' -CCCAAGCTTATGGCGTGCGGCGCCACTTTG-3'， 引物 P2 的核苷酸序列為5 ‘ -CGGAATTCTCATGAAACGTAACTGGCAGG-3 ‘；步驟四中PBS 緩沖液=NaCl 137mmol/L、KCl 2. 7mmol/L、Na2HPO4IOmmo 1/L, KH2P042mmol/L, pH 為 7· 2。本實施方式中涉及引物合成、基因合成和測序的部分均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；本實施方式在具體操作中涉及使用的各種反應試劑均為購買得到(寶生物工程有限公司)，并按說明書操作。本實施方式步驟二中采用二步法RT-PCR技術獲得雞akirin2基因全長編碼序列， 方法參照試劑說明書，其中具體PCR程序如下94°C預變性％iin，30個循環的94°C /lmin, 56°C /lmin，72°C /lmin，72°C終延伸 lOmin，4°C終止反應。本實施方式步驟二中雞akirin2基因全長編碼序列，經純化后克隆到載體 PMD18-T并測序鑒定，隨機挑取鑒定正確的5個重組克隆由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果表明雞Akirin2基因編碼序列全長576nt，克隆所得序列與電子克隆預測的完全一致，編碼191個氨基酸，如SEQ ID No. 2所示。本實施方式所得利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的應用在疫苗免疫動物的同時，采用Iml注射器胸肌注射接種200 μ g雞基因工程免疫增強劑，可使相應疫苗免疫抗體水平提高10% 25%。本實施方式步驟三中重組表達載體pcDNA-akirin的大量制備 重組表達載體pcDNA-akirin轉化大腸桿菌DH5 α，挑取陽性pcDNA-akirin 轉化子，然后采用LB培養基進行擴增培養，再采用堿裂解法大量提取和純化重組質粒 pcDNA-akirin，具體如下(1)將陽性pcDNA-akirin轉化子DH5 α菌種劃線培養后，挑取瓊脂培養板上的單菌落，接種在anl LB培養液中(含50 μ g/ml Amp)，37°C振蕩培養過夜；(2)取Iml菌液到含200ml LB培養液(含50 μ g/ml Amp)的三角瓶中，37°C振蕩培養過夜；(3)取菌液至Ij 50ml離心管，12000rpm離心1分鐘；(4)棄上清，將細菌沉淀懸浮于3ml冰預冷的溶液I (50mM葡萄糖，
2.5mMTris · Cl (ρΗ8· 0)，IOmM EDTA (ρΗ8. 0)，高壓滅菌)中，渦旋振蕩混勻，室溫擱置5分鐘；
(5)加6ml溶液II (0. 2M NaOH, 1 % SDS)，顛倒離心管10-15次以混合內容物，置冰上5分鐘；(6)加入4. 5ml溶液III (3M醋酸鉀/2M醋酸)，溫和顛倒混勻10秒鐘，冰上放置 5分鐘；(7) 12000rpm，4°C離心15分鐘，取上清到一個新的印pendorf管中；(8)加入等體積的酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，劇烈震蕩15秒；(9) 12000rpm，4°C離心15分鐘，取上清到一個新的印pendorf管中；(10)加2倍體積的預冷無水乙醇，顛倒混勻，_80°C放置30分鐘，12000rpm, 4°C離心15分鐘；(11)棄上清，加5ml 70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm，4°C離心15分鐘；(12)無菌操作棄上清，待乙醇完全蒸發，加入500 μ 1無菌水溶解質粒DNA。本實施方式所得利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的動物實驗采用雞新城疫(ND)弱毒疫苗(La Sota系，黑龍江省生物制品一廠產品)免疫7 日齡雛雞，具體方法為將60只7日齡的商品海蘭褐蛋雞平均分為4組(每組10只)，每組雞在鐵籠內隔離飼養，第1組雞只注射雞基因工程免疫增強劑；第2組為疫苗免疫組；第 3組雞在疫苗免疫的同時采用不同方法接種雞基因工程免疫增強劑，即3-1組采用點眼法， 3-2組采用滴鼻法，3-3組采用肌肉注射法；第4組為空白對照，即肌注pcDNA3. 0空載體質粒DNA ；以上各組接種量均為200 μ g/只；在疫苗接種后7天、14天、21天、28天、35天、42 天、49天、56天分別采取每組雞的血清進行ND血凝抑制(HI，購買自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所)抗體水平檢測。結果如圖1所示第2、3組雞在免疫7天后新城疫病毒(NDV)的抗體滴度均開始迅速上升，至免疫后21天2、3組雞的NDV抗體水平達到峰值；從28天NDV抗體水平開始小幅度下降；從NDV抗體水平變化曲線表明應用雞基因工程免疫增強劑的第3組雞的NDV抗體水平整個監測過程均高于單用疫苗的第2組雞，而在應用雞基因工程免疫增強劑組內部以肌肉注射途徑接種免疫增強效果最好，產生的NDV抗體水平可達第二組的1. 25倍；整個試驗期間，第1組和第4組對照雞的NDV抗體水平一直在2Log2以下；以上結果表明采用肌肉注射方式接種雞基因工程免疫增強劑可以顯著提高雞NDV活疫苗免疫后的抗體產生水平。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中3日齡雛雞為商品海蘭褐雞。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。本實施方式中3日齡的商品海蘭褐雞，免疫前新城疫病毒(NDV)平均抗體滴度均小于2Log2，購自東北農業大學孵化場。
權利要求
1.利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法，其特征在于利用 akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法按以下步驟進行一、利用NCBI中紅原雞的EST數據庫，以人的akirin2基因編碼序列為靶標，利用 BLAST軟件進行電子克隆，獲得雞akirin2基因全長編碼序列；二、采用Trizol試劑提取3日齡雛雞骨骼肌的總RNA，采用二步法RT-PCR技術獲得雞 akirin2基因全長編碼序列，經純化后克隆到載體pMD18_T并測序鑒定，獲得含雞akirin2 基因的重組PMD18-T載體；三、根據雞akirin2基因全長編碼序列，設計引物Pl和P2，并使引物Pl和P2的5'-端分別帶有HindIII和EcoRI酶切位點，然后將重組pMD18_T載體中的雞akirin2基因亞克隆到表達載體pcDNA3. O中構建成重組表達載體pcDNA-akirin ；四、采用0.lmol/L的無菌PBS緩沖液稀釋重組表達載體pcDNA-akirin至濃度為 1. O μ g/ μ 1，于-20°C保存，即完成利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑；其中步驟二中雞akirin2基因全長編碼序列如SEQ ID No. 1所示；步驟三中引物Pl的核苷酸序列為5 ‘ -CCCAAGCTTATGGCGTGCGGCGCCACTTTG-3 ‘，引物 P2 的核苷酸序列為5' -CGGAATTCTCATGAAACGTAACTGGCAGG-3'；步驟四中 PBS 緩沖液NaCl 137mmol/L、KCl 2. 7mmol/L、Na2HPO4IOmmo 1/L, KH2P042mmol/L, pH 為 7. 2。
2.根據權利要求1所述的利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法， 其特征在于步驟二中3日齡雛雞為商品海蘭褐雞。
全文摘要
利用akirin2基因序列制備雞基因工程免疫增強劑的方法，它涉及制備雞基因工程免疫增強劑的方法。它解決了現有基因工程免疫增強核酸疫苗存在不能夠廣泛的提高疫苗、菌苗免疫效果的問題。方法獲得雞akirin2基因編碼序列；獲得含雞akirin2基因的重組pMD18-T載體；設計引物并使5′-端分別帶有HindIII和EcoRI酶切位點，將重組pMD18-T載體中的雞akirin2基因亞克隆到表達載體中構建成重組表達載體；無菌PBS緩沖液稀釋重組表達載體即完成。本發明中雞基因工程免疫增強劑可提高機體IL-1、IL-6和toll-樣受體等多種免疫相關因子表達水平，具有對各種疫苗、菌苗適用面廣等特點。
文檔編號A61K48/00GK102240402SQ20111013665
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者滿朝來 申請人:哈爾濱師范大學