專利名稱：一種基于dna水平的高致病性豬藍耳病病毒jev復制子疫苗及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗及其應用。
背景技術：
目前臨床應用的PRRS疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。由于滅活疫苗免疫效果不理想，而減毒活疫苗又存在毒力返強的可能性。當前PRRS己成為嚴重危害養豬業的重大傳染病之一，疫苗的免疫接種仍是預防與控制PRRS最有效的措施。目前用于預防PRRS的商品化疫苗主要是弱毒苗和滅活疫苗， 但因存在安全隱患或免疫效果差的缺陷，不能提供理想的免疫保護。而被譽為“第三次疫苗革命”DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的基因置于真核表達元件的控制之下，構成重組表達質粒DNA，將其直接導入動物體內，通過宿主細胞表達加工合成抗原分子，從而誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答。雖然DNA疫苗具備許多優勢，但是卻因接種劑量大和存在與宿主基因組重組的安全隱患在發展受到很多限制。因此，研究更安全、有效的新型疫苗載體對預防和控制PRRS的發生與流行具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于根據現有技術中存在的不足，提供一種基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗。本發明另一目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗的構建方法。本發明還有一個目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
一種基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗，是建立在JEV復制子 (PJEV-REP)上的。所述JEV復制子系統是以改造過的低拷貝質粒pOKM為骨架，在缺失絕大部分結構基因(第165-M02核苷酸)的情況下，構建包括CMV啟動子、5’ UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽(E25)、所有非結構蛋白、3’ UTR、核酶(HDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV復制子載體系統。上述JEV復制子系統的構建方法，包括如下步驟設計引物，其序列如SEQ ID NO: Γ18所示，從質粒pWF-GFP中擴增片段A，再從JEV的基因組RNA中擴增出片段B、C、D
和片段II ,再以片段A和B為模板，通過融合PCR的方法擴增出片段I ；以片段C和D為模板，融合PCR擴增出片段III，將片段I、Π和III定向克隆到低拷貝質粒中，得到基于DNA水平的乙型腦炎病毒復制子載體系統。本發明所述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗是將藍耳病的結構基因GP5與M蛋白插入到基于DNA水平的JEV復制子(pJEV-REP)中，包括CMV啟動子、 5'UTRX蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽、所有非結構蛋白編碼區、3’ UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白編碼區、FMDV-2A的序列和M蛋白編碼區。上述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗的構建方法包括如下步驟設計引物，其序列如SEQ ID N0:19l8所示，擴增出高致病性豬藍耳病病毒XH株的 GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在兩個基因中間插入FMDV-2A的序列，從而得到G-2A-M 片段，最后通過SpeI和MlI兩個酶切位點克隆到JpJEV-REP ；另外，為了使M蛋白能夠產生真實的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用MlI-HF 和SpeI兩個酶切位點插入到pJEV-REP中，最終構建基于JEV復制子并且能夠表達GP5和 M蛋白的高致病性藍耳病疫苗。IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。G-2A-M片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:30所示。本發明上述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子能有效表達并能誘發特異性抗體和細胞免疫反應，可作為預防高致病性豬藍耳病的一種新型基因工程疫苗。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
目前市場普遍存在的藍耳病疫苗弱毒疫苗，但減毒活疫苗最大的缺點是存在毒力返強的可能性，而傳統的基因工程疫苗蛋白表達量低，免疫原性較差等不足。而本發明研發的復制子疫苗不存在活病毒，因此不存在病毒毒力返強的可能性，另外，本發明也證明了與傳統的DNA疫苗相比，本發明的疫苗可以產生更高的抗體和更強的淋巴細胞增殖反應。
圖1為基于JEV復制子載體的豬高致病性藍耳病疫苗的構建圖，其中，A為 JEV-REP-G-2A-M-IRES ；B 為 pJEV-REP-G-2A_M ；
圖2為GP5基因、M基因及其融合PCR的擴增產物；其中，1為DNA Marker DL2, 000 ； 2為GP5基因PCR片段；3為M基因PCR片段；4為G-2A-M片段；5為G-2A-MR片段；6為 IRES序列PCR片段；7為G-2A-M-IRES片段；
圖3為各重組質粒的酶切鑒定；其中，1為λ-EcoTH I digest Marker ;2為DNA Marker DL2, 000 ；3 為 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (Sall/Spel);4 為 pJEV-REP-G-2A_M (Sail/ Spel);5 為 ρJEV-REP-GFP (Sall/Spel);6 為 pJEV-REP-IRES (Sall/Spel);7 為 pCAGGS-GM (EcoRI 和 XhoI)；
圖4為表達GP5/M蛋白的三組重組質粒的Wfestern blot檢測結果；其中， 1 為 pageRuler Prestained Protein Ladder ；2 為 pJEV-REP-G-2A-M-IRES ；3 為 PJEV-REP-G-2A-M ；4 為 pCAGGS-GM ；5 為 293T 細胞；
圖5為三組pJEV-REP重組質粒轉染細胞48h的IFA結果(X400)；其中，A 為 pJEV-REP-G-2A-M-IRES 轉染細胞；B 為 pJEV-REP-IRES 轉染細胞；C 為 PJEV-REP-G-2A-M 轉染細胞；D 為細胞； 圖6為免疫小鼠血清抗體的生長曲線；圖7為不同疫苗免疫小鼠的脾臟淋巴細胞特異性增殖反應。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。材料=PRRSV-XH株由農業部動物疫病防控重點開放實驗室張桂紅教授惠贈； Mac 145細胞由農業部動物疫病防控重點開放實驗室提供；8周齡的SPF級BALB/c雌性小鼠購自廣東省實驗動物中心。實施例1 構建豬高致病性藍耳病復制子疫苗
1.構建豬高致病性藍耳病復制子疫苗的設計(結構圖如圖1)
通過自行設計的引物(如SEQ ID NO: 19^29所示)，以HP PRRS基因RNA的反轉錄產物為模板，引物GP5F與GP5R-FMDV2A-R可擴增出GP5基因的完整編碼區及2A序列的前45個堿基，結果擴增出大小為648bp特異性片段；引物MF-FMDVF2A-F與MR- MlI則可以擴增出 2A序列的后45個堿基及M基因的完整編碼區，擴增出570bp。另外，引物GP5F和MR-&ilI 通過融合PCR的方法擴增出約1，200bp的G-2A-M片段。同時以G-2A-M片段為模板，以 GP5F和MR為引物擴增出約1，200bp的G-2A-MR片段，再以IRESlF和IRES-588R為引物， 以pIRESl-neo為模板擴增出588bp的IRES序列。接著利用G-2A-MR片段和IRES為模板， 以GP5F和IRES-588R為引物融合擴增出約1，800bp的G_2A_M_IRES特異性片段，最后利用 MlI-HF和SpeI兩個酶切位點插入到pJEV-REP中，最終構建基于JEV復制子并且能夠表達 GP5和M蛋白的高致病性藍耳病疫苗(如圖2)。2.真核表達質粒的構建
以GP5-EcoRI和MR-XhoI為引物，以質粒pJEV-REP-G-2A_M為模板通過PCR的方法擴增出G-2A-M-EX片段。然后將G-2A-M-EX片段和真核表達載體pCAGGS分別用限制性內切酶EcoRI和B10I進行消化連接產物直接用于轉化以及重組質粒的獲得，命名為pCAGGS-GM 伐口圖2)。3.各重組質粒的酶切鑒定
重組質粒 pCAGGS-GM 用 EcoRI 和 XhoI 進行酶切鑒定，而 pJEV-REP-G-2A-M_IRES、 PJEV-REP-G-2A-M和pJEV_REP_IRES三個重組質粒則均用MlI和SpeI進行酶切鑒定(如圖3)。實施例2化學熒光法flfestern-blot檢測GP5蛋白和M蛋白表達
將共表達 PRRSV 的 GP5 和 M 蛋白的質粒(pJEV-REP-G-2A_M 和 pJEV-REP-G-2A-M_IRES) 與真核表達質粒(pCAGGS-GM)分別轉染細胞，轉染4 后收集細胞，重組質粒轉染4 后，收獲細胞，PBS洗2次，適量PBS重懸，加入2 X SDS上樣緩沖液，沸水浴作用lOmin。制備12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，按每孔20 μ 1點樣，并于80V/0. 5h和120V/1. 5h條件下電泳。電泳結束后，在半干電轉印儀上于17V/10min條件下將蛋白轉移至硝酸纖維膜上。 轉移完成以后用1\ 83洗膜5!^11，5%脫脂乳371封閉lh。用抗GP5蛋白和抗M蛋白特異性單克隆抗體室4°C孵育過夜，PBST洗3遍，每遍5min，將IRDye 800標記的羊抗鼠熒光二抗作1 7，500稀釋后一起加入，室溫搖床上孵育lh，PBST洗膜3次，每次5min，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統進行掃描，結果發現，三種轉染了質粒的細胞都在43KD出現特異性條帶，表明GP5和M蛋白的表達是以GP5/M異源二聚體的形式存在(見圖4)，表明這幾種重組質粒在轉染細胞后均可正確表達目的蛋白。實施例3間接免疫熒光檢測JEV非結構蛋白的表達
將共表達PRRSV的GP5和M蛋白的JEV復制子質粒(pJEV-REP-G-2A_M和 PJEV-REP-G-2A-M-IRES)與載體對照質粒(pJEV_REP_IRES)分別轉染細胞48h后，用間接免疫熒光的方法檢測到三種JEV復制子重組質粒均能表達JEV NSl蛋白(見圖5)。實施例4免疫小鼠血清特異性抗體的檢測
60只8周齡的SPF級BALB/c雌性小鼠分為5組，每組12只，分別免疫 pJEV-REP-G-2A-M-IRES、pJEV-REP-IRES、pJEV-REP-G-2A-M、pCAGGS-GM 和 PBS，免疫劑量為 100 μ L/只，每側各50 μ L，共免疫3次，每隔3周免疫一次。采集免疫后0、2、4、6、8和10周的免疫小鼠血清，用豬藍耳病ELISA檢測試劑盒進行檢測(其中將豬的酶標二抗更換為小鼠的酶標二抗)。主要步驟如下1:100稀釋待檢小鼠血清，取預包被的板，每孔加100 μ L待檢血清，置37°C溫育30min ；300 μ L/孔洗滌液洗板4次，每次靜置:3min ；每孔加NBL公司的鼠酶標二抗(1:7，500稀釋)100 μ L， 置37°C溫育60min ；洗滌4次，方法同上；每孔加底物A液和B液各50 μ L，室溫避光顯色 IOmin ；每孔加終止液50 μ L, 10 min內用酶標儀630nm波長測定各孔的OD值(見圖6)。 從圖中可以看出免疫組在一免后兩周開始檢測到特異性抗體，二免后ρJEV-REP-G-2A-M 和ρJEV-REP-G-2A-M-IRES免疫組相比對照組抗體水平開始增加，并在三免后兩周(8 周)三組疫苗組均達到抗體的高峰，此時PJEV-REP-G-2A-M (0D630=0. 73士0. 09)和 PJEV-REP-G-2A-M-IRES (0D630=0. 71 士0. 08)免疫組比 pCAGGS-GM (0D630=0. 59 士0. 11)DNA 疫苗免疫組產生更高的抗體。結果表明復制子疫苗比DNA疫苗能產生更高的抗體水平。實施例5免疫小鼠的特異性淋巴細胞增殖水平
三免后兩周進行淋巴細胞增殖試驗。首先用眼球采血法處死小鼠，浸泡于75%的乙醇中；在超凈臺中取出小鼠脾臟置于35mm培養皿中，注意無菌操作；在培養皿中加入4_5 mL淋巴細胞分離液。用注射器將脾臟挑成碎塊，然后于200目的篩網下用注射器的活塞進行研磨，然后吹打成單個細胞懸液；然后把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到15mL離心管中，覆蓋200-500 μ L的1640培養基，保持液面分界明顯；室溫，800g離心30min ；接下來吸出淋巴細胞層，再加入10 mL1640培養基，顛倒洗滌。室溫，250g離心IOmin收集細胞；最后傾倒上清液，用1640培養基重懸細胞，細胞計數，然后用1640完全培養基將細胞稀釋到IX IO6個/ mL。將上述制備的淋巴細胞懸液離心后懸浮到RPMI1640完全培養基，然后加到96孔平底細胞培養板(1 X 105個/孔)，每孔加入100 μ L的細胞懸液。再加入相同體積的PRRSV(1 μ g)、Mac 145空細胞對照或是RPMI1640完全培養基。培養板在含5% C02的37°C恒溫培養箱培養84h后，每孔加入10 μ L CCK-8試劑，混勻后繼續培養池，然后用酶標儀檢測波長為450 nm的光密度值。每個樣品設三個重復，計算刺激指數 (Stimulation Index, Si)。SI=PRRSV 刺激孔的平均光密度度值 0D450nm/Macl45 空細胞對照孔密度度值0D450nm。脾細胞加入PRRSV刺激培養80h后，加入WST-8溶液，來判斷活細胞數量。活細胞的量由樣品的0D450nm顯示，根據PRRSV刺激組和空細胞對照組的 0D450nm計算刺激指數(Stimulation Index, Si)從而判斷增殖水平。實驗結果表明(見圖 7)pJEV-REP-G-2A-M(SI=l. 804士0. 175)和 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (SI=L 853士0. 254)免疫組的 SI 明顯高于 pJEV-REP-IRES (SI=1. 155士0. 037)空載體免疫組(ρ<0· 01) ； DNA 疫苗組(pCAGGS-GM) SI指數(SI=1. 54士0. 10)也明顯高于PBS對照組(ρ<0· 01)，但是增殖水平低于其它兩組復制子疫苗組。
權利要求
1.一種基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗，其特征在于將藍耳病的結構基因GP5與M蛋白插入到基于DNA水平的JEV復制子(pJEV-REP)中，包括CMV啟動子、5’ UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽、所有非結構蛋白編碼區、3’UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白編碼區、FMDV-2A的序列和M蛋白編碼區。
2.權利要求1所述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗的構建方法，其特征在于包括如下步驟設計引物，其序列如SEQ ID NO: 1918所示，擴增出高致病性豬藍耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在兩個基因中間插入FMDV-2A的序列，從而得到G-2A-M片段，最后通過SpeI和MlI兩個酶切位點克隆到JpJEV-REP ；另外， 為了使M蛋白能夠產生真實的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)， 最后利用MlI-HF和SpeI兩個酶切位點插入到pJEV-REP中，最終構建基于JEV復制子并且能夠表達GP5和M蛋白的高致病性藍耳病疫苗。
3.權利要求1或2所述基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗在制備生物制品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種基于DNA水平的高致病性豬藍耳病病毒JEV復制子疫苗及其應用。本發明是通過引物擴增出高致病性豬藍耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在兩個基因中間插入FMDV-2A的序列，從而得到G-2A-M片段，最后通過SpeI和SalI兩個酶切位點克隆到JpJEV-REP；另外，為了使M蛋白能夠產生真實的N末端，G-2A-M片段的下游插入了IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用SalI-HF和SpeI兩個酶切位點插入到pJEV-REP中，最終構建基于JEV復制子并且能夠表達GP5和M蛋白的高致病性藍耳病疫苗。
文檔編號A61K39/12GK102247606SQ201110135690
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者亓文寶, 廖明, 李紅梅, 臧富玉, 陳孝明 申請人:華南農業大學