專利名稱：一種腦腫瘤磁共振對比劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫療檢測試劑技術領域，具體涉及用于MRI (磁共振成像)對比增強的腦部腫瘤特異性對比劑及其制備方法。
背景技術：
腦部腫瘤是顱內常見的、嚴重危害人類健康、致殘和死亡率高且療效差的疾病。近20年來磁共振在臨床上的運用使得中樞神經系統影像診斷技術大大提高和進步，它能安全有效地呈現人體組織及器官的結構及功能形態，在臨床診斷中已經作為一種常規的檢查手段得以應用。MRI檢查病例中超過30%需使用對比劑來提高正常組織與病灶的成像對比度，從而提高軟組織圖像的分辨率使MRI能更敏感地檢測微小病灶或特異性病灶。目前主要根據物質的磁化特性將對比劑分為順磁性和超順磁性對比劑，順磁性對比劑一般是釓的 螯合物，超順磁性對比劑一般是超順磁性氧化鐵對比劑。釓類對比劑有效地提高了磁共振成像MRI的診斷水平，但Gd-DTPA有弛豫率較低、非生物相容性、組織特異性低，滲透壓較高，成像時間短、彌散快，選擇性低，對肝膽道造影效果差，毒性與游離釓在體內的代謝過程相關，引起腎源性系統纖維化。超順磁性對比劑被用作磁共振的對比劑可以提高病變組織與正常腦組織的對比度。與傳統的釓螯合劑相比，它磁飽和強度高，弛豫率高，粒徑小，具有良好的標記基團，可與配體結合提高特異性。而且它具有生物相容性，可以被細胞通過正常的生化代謝途徑再利用或最終進入體內鐵池，對組織無毒副作用。普通超順磁性氧化鐵對比劑主要被網狀內皮系統所識別，例如在肝臟、脾臟及淋巴結等的顯像，它們能有效地降低質子弛豫時間，增加弛豫率，使得含有對比劑區域的T2加權圖像信號明顯降低。但是目前在肝、脾這些系統成像都依賴于被動地標記，包括由正常組織及腫瘤細胞周邊的網狀內皮細胞攝取而不是直接對腫瘤細胞進行標記。
發明內容
本發明的任務是提供一種腦腫瘤磁共振對比劑，使其具有特異性高、選擇性好、對比效果強、毒副作用低、組織濃度足夠活體成像等特點特，本發明還提供了這種腦腫瘤磁共振對比劑的制備方法。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種腦腫瘤磁共振對比劑是偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒。用生理可接受的稀釋劑將偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒稀釋，即可作為腦腫瘤磁共振對比劑使用，所述的稀釋劑可以是PBS緩沖液或生理鹽水，用生理可接受的稀釋劑稀釋偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒時，偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒與稀釋劑重量mg/體積mL比為10 20 I。所述的超順磁性氧化鐵納米粒可以是超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒。所述的超順磁性氧化鐵納米粒的粒徑大小為10 20納米。
本發明提供的腦腫瘤磁共振對比劑的制備方法，包括以下步驟步驟一、制備活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液；步驟二、將轉鐵蛋白溶解于緩沖液中得到轉鐵蛋白溶液；步驟三、將轉鐵蛋白溶液加入活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液中得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液；步驟四、去除步驟三得到的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液中未反應的轉鐵蛋白和吸附在超順磁性氧化鐵納米粒表面的轉鐵蛋白轉鐵蛋白。上述步驟一所述的制備活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液的方法是取超順磁性氧化鐵納米粒，分散于pH = 5. O的lmol/L醋酸鈉緩沖液中，加入1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(簡稱EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(簡稱NHS)(終濃度分別為5mM和12. 5mM)，振蕩15分鐘，用磁鐵除去未反應的EDC和NHS，再按2mg 200ul的比例 加入pH = 7. 4的O. lmol/L PBS緩沖液重新分散超順磁性氧化鐵納米粒，獲得活化后的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液；上述步驟二中所述的將轉鐵蛋白溶解于緩沖液中制備轉鐵蛋白溶液的方法是按重量體積比mg/ul為O. 2 : 200的比例將轉鐵蛋白溶解于pH = 7. 4的
O.lmol/LPBS緩沖液中，得到轉鐵蛋白溶液；上述步驟三所述的將制備的轉鐵蛋白溶液加入活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液中得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液的方法是將轉鐵蛋白溶液加入活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液中，轉鐵蛋白溶液與活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液的重量用量比為O. Img lmg，室溫條件下放置過夜，獲得偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液。上述步驟四所述的去除步驟三得到的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液中未反應的轉鐵蛋白和吸附在超順磁性氧化鐵納米粒表面的轉鐵蛋白轉鐵蛋白的具體方法是用磁鐵去除步驟三得到的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液中未反應的轉鐵蛋白，經磁分離得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的沉淀，用PBS緩沖液清洗偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的沉淀三至五次，去除吸附在超順磁性氧化鐵納米粒表面的轉鐵蛋白，再加入PBS緩沖液重新分散偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒，使其充分混合均勻，得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的對比劑。偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的體外表征⑴偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的粒徑大小利用透射電鏡測定。偶聯轉鐵蛋白前后超順磁性氧化鐵納米粒的粒徑分別為9納米和14納米，見圖2、圖3。(2)偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的弛豫率曲線將偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒用水稀釋成不同濃度，加入96孔板中，利用Magnetom A Trio Tim 3. O測定不同濃度的偶聯超順磁性氧化鐵納米粒的T2值，得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的弛豫系數(r2)為64. SmT1S'本發明的有益效果通過以下動物實驗表明實驗動物=Wistar大鼠，湖北預防醫學科學院提供，體重在250_300g之間，雄性。設備西門子 MagnetomATrio Tim 3. O(I)腫瘤動物模型的制備在大鼠前因右偏3毫米，前偏I毫米的的位置將顱骨鉆開，利用立體定位儀將10μ I含IO6個大鼠膠質瘤細胞(C6細胞)注入該位置，約10天后瘤直徑達到(5_X5mm)用于動物成像實驗。(2)實驗動物成像大鼠腫瘤模型8只，隨機分為2組，一組為實驗組，尾靜脈注射經PBS稀釋的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒對比劑，按12mg/kg 組為對照組，尾靜脈注射相同劑量的超順磁性氧化鐵納米粒對比劑，在2分鐘內注射完畢，分別在2小時、24小時、48小時掃描，觀察腫瘤部位信號的變化。(3)MR信號值測量方法盡量取相同層面瘤體最大徑上的5個圓形區域為感興趣區(ROI)，面積為2mm2，測其T2WI圖像信號強度(Signal intensity, SI)值，然后計算其平均值。(4)數據處理采用SPSS13. O版本統計軟件，用隨機區組設計資料的方差分析方法對數據進行處理，之后用SNK-q檢驗進行兩兩間比較。結果發現，瘤體信號值在注射轉鐵蛋白偶聯的超順磁性氧化鐵納米粒后，信號呈明顯改變，見圖7 ;并隨著觀察時間的延長，試劑轉鐵蛋白偶聯的超順磁性氧化鐵納米粒有向瘤體四周擴散的趨勢，最大改變為50. 86%，見表I。
表I注射超順磁性氧化鐵納米粒對比劑與注射偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒對比劑的瘤體信號強度值變化率對比
權利要求
1.偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒在制備腦腫瘤磁共振對比劑中的應用。
2.一種腦腫瘤磁共振對比劑，其特征在于它是偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒。
3.根據權利要求2所述的腦腫瘤磁共振對比劑，其特征在于含有生理可接受的稀釋劑。
4.根據權利要求3所述的腦腫瘤磁共振對比劑，其特征在于所述的稀釋劑可以是PBS緩沖液或生理鹽水。
5.根據權利要求4所述的腦腫瘤磁共振對比劑，其特征在于，偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒與稀釋劑的重量/體積用量比為10-20mg lmL。
6.據權利要求2所述的腦腫瘤磁共振對比劑，其特征在于，所述的超順磁性氧化鐵納米粒可以是超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒。
7.根據權利要求2或6所述的對比劑，其特征在于，所述的超順磁性氧化鐵納米粒的粒徑大小為10 20納米。
8.一種腦腫瘤磁共振對比劑的制備方法，包括以下步驟 步驟一、制備活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液； 步驟二、將轉鐵蛋白溶解于緩沖液中得到轉鐵蛋白溶液； 步驟三、將轉鐵蛋白溶液加入活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液中得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液； 步驟四、去除步驟三得到的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液中未反應的轉鐵蛋白和吸附在超順磁性氧化鐵納米粒表面的轉鐵蛋白轉鐵蛋白。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于， 步驟一所述的制備活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液的方法是取超順磁性氧化鐵納米粒，分散于pH = 5. O的lmol/L醋酸鈉緩沖液中，加入1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，終濃度分別為5mM和12. 5mM,振蕩15分鐘，用磁鐵除去未反應的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，再按2mg 200ul的比例加入pH = 7. 4的O. ImoI/LPBS緩沖液重新分散超順磁性氧化鐵納米粒，獲得活化后的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液；步驟二中所述的將轉鐵蛋白溶解于緩沖液中制備轉鐵蛋白溶液的方法是按重量體積比mg/ul為O. 2 : 200的比例將轉鐵蛋白溶解于pH = 7. 4的O. lmol/L PBS緩沖液中，得到轉鐵蛋白溶液；步驟三所述的將制備的轉鐵蛋白溶液加入活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液中得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液的方法是將轉鐵蛋白溶液加入活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液中，轉鐵蛋白溶液與活化的超順磁性氧化鐵納米粒懸浮液的重量用量比為O. Img lmg，室溫條件下放置過夜，獲得偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液；步驟四所述的去除步驟三得到的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液中未反應的轉鐵蛋白和吸附在超順磁性氧化鐵納米粒表面的轉鐵蛋白轉鐵蛋白的具體方法是用磁鐵去除步驟三得到的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒混懸液中未反應的轉鐵蛋白，經磁分離得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的沉淀，用PBS緩沖液清洗偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的沉淀三至五次，去除吸附在超順磁性氧化鐵納米粒表面的轉鐵蛋白，再加入PBS緩沖液重新分散偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒，使其充分混合均勻，得到偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒的對比劑。
10.根據權利要求I所述的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒在制備腦腫瘤磁共振對比劑中的應用，其特征在于，所述的偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒按權利要求8或9所述的方法制得。
全文摘要
本發明提供了一種腦腫瘤磁共振對比劑，它是偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒，可含有生理可接受的稀釋劑，其稀釋劑可以是PBS緩沖液或生理鹽水，偶聯轉鐵蛋白的超順磁性氧化鐵納米粒與稀釋劑的重量/體積用量比為10-20mg∶1mL，所述的超順磁性氧化鐵納米粒可以是超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒，超順磁性氧化鐵納米粒的粒徑大小為10～20納米。本發明對比劑利用轉鐵蛋白與表面表達轉鐵蛋白受體的細胞的高親和力來實現靶向性顯影，具有特異性高、選擇性好、對比效果強、毒副作用低、組織濃度足夠活體成像等特點。
文檔編號A61K49/18GK102784400SQ201110129500
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月18日 優先權日2011年5月18日
發明者劉芳, 姜冬玲, 尚亞雷, 尹明媛, 徐海波, 朱艷紅, 李歡, 楊祥良, 石浩軍, 蔣瑋麗, 謝輝, 趙彥斌 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院