一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯合疫苗的制作方法

專利名稱：一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯合疫苗的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學生物技術領域，涉及一種聯合疫苗及其制備方法，特別是涉及腸道病毒71型與甲型肝炎聯合疫苗及其制備方法。
背景技術：
近年來手足口病發病日益頻繁，患病病例及病死人數逐年上升，嚴重威脅著我國兒童與嬰幼兒的健康，給社會造成巨大的經濟負擔。2008年5月我國將手足口病納入丙類傳染病管理。腸道病毒71型作為手足口病最主要的病原體，常常與手足口病大規模爆發流行、重癥和死亡病例相關。甲型肝炎是一種主要的強傳染性的腸道傳染病，發病率高，流行面廣，是我國法定管理的乙類傳染病。為有效控制疾病的流行，研究開發用于預防上述兩種類腸道病毒引起的疾病的疫苗具有重大意義。腸道病毒71型(EV71)和甲型肝炎病毒(HAV)均是通過糞-口途徑傳播的小RNA 病毒科病毒，分別屬于腸道病毒屬和嗜肝病毒屬，人類是它們唯一的自然宿主。腸道病毒71型手足口病(HFMD)是由多種腸道病毒引起的全球性常見傳染病。 1958年首次報道了發生于新西蘭的病例，同年分離出主要病原CA16，1969年首次確認另一個重要病原體EV71，之后EV71與CA16交替出現，成為HFMD的主要病原體。HFMD的病原還包括其他多種腸道病毒。近年來EV71感染在我國大陸呈現上升趨勢，分離的EV71毒株皆屬C4基因亞型。疾病感染手足口病、中樞神經系統感染及皰疹性咽峽炎是EV71感染引起的常見臨床癥狀，但在EV71流行過程中的表現差異很大。20世紀70年代歐洲爆發的EV71中患者癥狀主要表現為腦炎和脊髓灰質炎樣麻痹，HFMD癥狀很少見；而同期日本流行的EV71主要表現為HFMD癥狀。在1998年臺灣地區EV71流行中，中樞神經系統感染者中有80%同時患HFMD，而同期澳大利亞的這個比例只有7%。急性咽峽炎在中國香港地區、日本和中國臺灣地區的EV71流行中都曾有報道。EV71引起的神經源性肺水腫主要分布于亞太地區EV71 流行的大量病例中。發熱和急性呼吸道疾病是幼兒EV71感染的又一常見臨床癥狀，在澳大利亞、加拿大和1998年中國臺灣的EV71流行中都有報道。流行病學(1)全球概況1975年，保加利亞發生EV71大流行，共有705名患兒受到感染，死亡44例，93 %的重癥病例和83. 8 %的死亡病例發生在5歲以下人群。1978年匈牙利發生EV71疫情，出現擬6例無菌性腦膜炎和7M例腦炎病例，死亡45例。1972-1999 年日本、澳大利亞與馬來西亞均發生多次EV71大流行。2003-2007年越南爆發三次大規模 EV71疫情。近30多年間世界發生的HFMD大流行都是由EV71感染引起的，EV71已成為全球范圍內最重要的中樞神經毒性病毒病原。(2)中國大陸概況我國常見的HFMD發病形式有流行和散發兩種。1987年在湖北省HFMD流行期間首次發現EV71感染。1995年武漢病毒研究所從HFMD病人中分離出EV71。1998與2000年臺灣地區和山東省招遠市先后暴發 EV71感染引起的HFMD。2002年4_6月上海市發生HFMD。2004年3_7月深圳市發生HFMD 聚集性病例10起。2006年我國報告HFMD病例13，637例，死亡6例。2007年報告83，344
3例，死亡17例；2008年HFMD居全國報告的丙類傳染病發病數第二位，死亡數的首位，報告病例489，073例，重癥1，165例，死亡1 例，重癥與死亡病例中EV71感染率分別為81. 59% 與96. 43%。截至2009年9月底，全國累計報告HFMD例970，477例，重癥12,861例，死亡 317 例。甲型肝炎甲型肝炎是由HAV引起的肝臟急性，發病率與社會經濟發展水平密切相關，不同地區人群抗HAV抗體陽性率不同(15%-100%)。估計每年有150萬甲型肝炎臨床病例發生。HAV感染后可誘導產生終生免疫。在低度流行區甲型肝炎通常會在高危人群中以單個病例形式出現或呈小規模爆發，在高度流行區多數人在兒童期已獲得隱性感染而臨床病例較少見。在中、低度流行國家成人病例更為常見。疾病感染HAV本身不導致細胞病變，肝細胞損害是由白細胞介導的免疫反應所致。急性甲型肝炎與其他類型的急性病毒性肝炎難以區分，典型癥狀包括發熱、不適、厭食、嘔吐和腹部不適，隨后出現尿色加深和黃疸。約有0.01%的臨床病例會出現爆發性肝炎，病死率很高。HAV引起的急性肝炎并發癥較少，引起的肝外并發癥較多。HAV不會引起慢性感染，目前無特異性抗病毒治療方法。甲型肝炎的病死率為0. 015%，感染臨床表現與患病年齡有關，5歲以內幼兒90%以上不出現明顯癥狀；15歲左右的青少年約有25%有癥狀；成年人則90%以上癥狀和體征明顯。大年齡組人群疾病嚴重程度增加、死亡率增高。流行病學(1)全球概況人體感染HAV后出現抗HAV抗體，血清抗體陽性率可作為人群的病毒傳播標志。北歐血清抗體陽性率最低約15%，歐洲其他地區、澳大利亞、日本和美國，40%-70%的成人血清抗體陽性。發展中國家所有成人幾乎都有既往感染的血清學證據。( 中國大陸概況中國是甲型肝炎的高發區，城市人群感染率>80%，農村人口感染率> 90%。1990 2009年全國甲型肝炎發病總體呈逐年下降趨勢，發病數由584,353 例下降至43，841例；發病率由52. 58/10萬下降至3. 28/10萬。我國全年均有甲型肝炎發病，呈現春季高發現象，但發病流行高峰不明顯。發病年齡主要集中在青壯年和兒童中，男性發病多于女性。2004年爆發沈起，2005年爆發33起，2006年爆發43起，發病數依次為 2，291 例、2，061 例和 1，808 例。甲型肝炎疫苗已經上市多年，我公司生產的腸道病毒71型滅活疫苗業已獲準進行臨床試驗。

發明內容
本發明旨在提供一種EV71與HAV聯合疫苗及其制備方法。為實現本發明的目的，本發明首先提供一種EV71與HAV聯合疫苗，其包含滅活 EV71以及滅活HAV。在另一個實施方案中，還包括鋁佐劑。其中所述的滅活EV71抗原含量為25 1600U/ml(EV71抗原含量檢測用EV71抗原參比品可購自中國食品藥品檢定研究院)；滅活HAV抗原含量的半數有效量(指引起50% 實驗對象出現陽性反應時的藥量，ED50)為不高于125u，優選為25 2000u/ml。優選的滅活EV71抗原含量為50 800U/ml，滅活HAV抗原含量為100 1000u/ml。在本發明的一個實施方案中，所述的鋁佐劑優選為氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。聯合疫苗中鋁含量終濃度為0. 125 2. Omg/ml，優選的鋁含量終濃度為0. 25 1. Omg/ml。本發明所用的鋁佐劑，可以市售獲得也可以采用已知方法進行制備，該佐劑為本領域技術人
4員所熟知，易于獲得和制備。本發明中，所述滅活EV71毒株可選用本領域公知的任何適用于本發明的EV71病毒的基因型，優選為A、B、C基因型，病毒培養用細胞為Vero細胞或者2BS細胞；滅活HAV毒株可選用本領域公知的任何適用于本發明的HAV疫苗株，優選為TZ84株、YN5株、HMl75株和呂8株，培養用細胞為Vero細胞或2BS細胞。本發明的另一個目的在于提供所述聯合疫苗的制備方法，其包括將滅活EV71和滅活HAV分別吸附于鋁佐劑，將上述兩種滅活病毒的吸附產物混合制得EV71與HAV聯合疫苗；或者將滅活EV71與滅活HAV混合后再與鋁佐劑進行吸附；或者先將滅活EV71與鋁佐劑進行吸附以后再加入滅活HAV進行吸附；或者先將滅活HAV與鋁佐劑進行吸附以后再加入滅活EV71進行吸附。與現有技術相比，本發明具有如下優點本發明的疫苗可以同時預防由EV71引起的手足口病、中樞神經系統感染及皰疹性咽峽炎、神經源性肺水腫和急性呼吸道疾病及HAV引起的甲型肝炎。動物實驗表明，聯合疫苗中EV71的免疫原性高于EV71滅活疫苗的免疫原性。EV71與HAV病毒均為單鏈小RNA 病毒，結構不穩定易發生變異，一般RNA病毒變異速度比DNA病毒快一到兩個數量級；由于滅活疫苗的安全性較高，因此采用EV71、HAV病毒分別培養、滅活后制備滅活疫苗優于減毒疫苗。EV71與HAV滅活病毒的病毒外殼完整，構象保持較好，可以使機體產生較高的免疫原性誘導出特異性中和抗體，EV71與HAV滅活病毒制備聯合疫苗優于重組病毒。EV71病毒為腸道病毒71型，HAV為腸道病毒72型，由兩種腸道病毒制備的聯合疫苗具有腸道病毒類疾病更大的保護范圍；同時由于兩種病毒均采用接種細胞后培養純化的方式制備，具有相似的生產工藝便于工業生產，同時由于均是滅活病毒，聯合疫苗具有更高的安全性。含有兩種及以上的抗原，可以同時預防兩種及以上疾病的聯合疫苗以其方便多效、成本低成為新一代疫苗研制的熱點，與單一疫苗相比，聯合疫苗可以減少疫苗的接種次數，減少生產運輸儲存和銷售冷鏈運作的運輸與保存成本，具有顯著的優越性。本發明的聯合疫苗使用了經充分證明具有良好安全性及免疫原性的HAV滅活疫苗，可大大減低疫苗的生產成本和市場價格。同時該聯合疫苗吸附完全，理化性質穩定，相互干擾作用。動物實驗表明，根據本發明EV71與HAV聯合疫苗的優選實施方案制備的EV71與 HAV聯合疫苗可有效誘導機體產生針對EV71和HAV的高滴度、特異性抗體，體外實驗證實該聯合疫苗所誘導的抗體具有明顯的反應性與中和活性；特別的聯合疫苗中EV71的與免疫效果不受另一組分的影響與干擾，吸附率大于95%，免疫原性不劣效于EV71滅活疫苗和 HAV滅活疫苗的兩種單價疫苗。本發明提供的聯合疫苗具有與兩種單價疫苗相同的免疫原性。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1 滅活EV71原液的制備培養待接種Vero細胞至長成致密的單層后進行細胞消化，1 8稀釋傳代培養至長成單層后接種病毒，EV71滅活疫苗病毒種子按照1 102CCID5(l/ml接種于長好的Vero細胞，于33士 1°C培養15天，根據細胞病變情況收獲培養后的細胞病毒上清得到EV71病毒收獲液。收獲液采用終濃度不超過250 μ g/ml的甲醛滅活不低于6天，然后通過超濾與柱層析等純化方式進行純化，合并層析純化液超濾濃縮后除菌過濾，得到滅活EV71原液。實施例2 滅活HAV原液的制備采用含有新生牛血清的fegle’ s MEM培養基培養2BS細胞，細胞長好后經過細胞消化與稀釋傳代培養后，接種0. 05 1. OMOI的TZ84株、YN5株、HM175株和呂8株的HAV 培養，培養期間根據細胞生長情況換維持液，維持液為含有新生牛血清的fegle’ s MEM培養基。培養至病毒增殖高峰期后，采用胰蛋白酶或其他適宜方法消化含有HAV的細胞，經過離心或者過濾的方法收集病毒收獲液。采用超濾法濃縮病毒，再用色譜層析法純化病毒；除菌過濾后用終濃度不超過250 μ g/ml的甲醛于37士 1°C滅活12天，滅活后的病毒液為滅活 HAV原液。實施例3 :EV71與HAV聯合疫苗制備吸附方式1 將稀釋后的滅活HAV和稀釋后滅活EV71分別用鋁佐劑吸附后，混合兩種滅活病毒的吸附產物，制成EV71與HAV聯合疫苗。吸附方式2 將稀釋后的滅活HAV先用鋁佐劑吸附后，再加入稀釋后的滅活EV71 進行吸附，制成EV71與HAV聯合疫苗。吸附方式3 將稀釋后滅活EV71先用鋁佐劑吸附，再加入稀釋后滅活HAV進行吸附，制成EV71與HAV聯合疫苗。吸附方式4 將稀釋后的滅活HAV與稀釋后滅活EV71先混合，然后將混合液加入鋁佐劑進行吸附，制成EV71與HAV聯合疫苗。其中EV71抗原含量為400U/ml、200U/ml、 100U/ml, HAV抗原含量為500u/ml ；鋁佐劑終濃度為0. 4mg/mL·檢測四種吸附方式制備的EV71與HAV聯合疫苗的吸附完全性、解離抗原以及體內效力。EV71與HAV抗原吸附效果與解離抗原分別采用EV71與HAV抗原雙抗體夾心酶聯免疫法檢測，檢測靈敏度分別為5U/ml、15. 6u/ml ；EV71體內效力試驗將聯合疫苗采用0、14天兩針腹腔免疫ICR小鼠，第觀天采血，以細胞病變法檢測血清中抗EV71中和抗體滴度。HAV 體內效力試驗將聯合疫苗1 8、1 32、1 1 稀釋后Iml/只腹腔免疫ICR小鼠，第觀天采血，用甲肝抗體測定試劑盒檢測抗HAV抗體效價，根據抗體陽轉率計算ED5tlt5結果見下表。抗原吸附完全性與ED5(1、EV71解離抗原回收率計算方法如下吸附完全性
(HAV I EV-1 匕:+f ？.兮 *
(HAV iz EVl)土- ^ ii理」 歹I.疫苗的吸附完全性反應疫苗中沒有被鋁佐劑捕獲的游離的抗原含量占疫苗中總的理論抗原含量的比值，結果越高顯示疫苗的吸附效果越好。ED50 :50%陽轉終點對數=高于50%陽轉率稀釋對數+距離比例X稀釋對數的因數ED50 =疫苗單位劑量/50%陽轉終點疫苗稀釋度(陽轉終點反對數)
權利要求
1.一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯合疫苗，其特征在于，包括滅活腸道病毒71型病毒和滅活甲型肝炎病毒。
2.根據權利要求1所述的聯合疫苗，其特征在于，還包括鋁佐劑。
3.根據權利要求2所述的聯合疫苗，其特征在于，所述的鋁佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。
4.根據權利要求1 3任一項所述的聯合疫苗，其特征在于，所述的腸道病毒71型滅活病毒的抗原含量為25 1600U/ml。
5.根據權利要求4所述的聯合疫苗，其特征在于，所述的滅活腸道病毒71型病毒為腸道病毒71型病毒A、B或C基因型。
6.根據權利要求1 3任一項所述的聯合疫苗，其特征在于，所述的滅活甲型肝炎病毒的抗原含量為25 2000u/ml。
7.根據權利要求6所述的聯合疫苗，其特征在于，所述的滅活甲型肝炎病毒選自甲型肝炎病毒TZ84株、YN5株、HM175株和呂8株。
8.根據權利要求2或3所述的聯合疫苗，其特征在于，所述的鋁佐劑的鋁含量為終濃度 0. 125 2. Omg/ml ；優選的鋁含量終濃度為0. 25 1. Omg/ml。
9.權利要求1 8任一項所述的聯合疫苗的制備方法，其特征在于將腸道病毒71 型滅活病毒與甲型肝炎滅活病毒分別吸附于鋁佐劑，制備病毒鋁吸附產物，然后將鋁吸附產物混合制備聯合疫苗；或者將腸道病毒71型滅活病毒與甲型肝炎滅活病毒混合后再與鋁佐劑進行吸附；或者先將腸道病毒71型滅活病毒與鋁佐劑進行吸附以后再加入甲型肝炎滅活病毒進行吸附；或者先將甲型肝炎滅活病毒與鋁佐劑進行吸附以后再加入腸道病毒 71型滅活病毒進行吸附。
10.權利要求1 8任一項所述的聯合疫苗在制備預防或治療腸道病毒71型病毒和甲型肝炎病毒引起的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯合疫苗，包括腸道病毒71型滅活病毒以及甲型肝炎滅活病毒，還包括鋁佐劑。本發明還提供制備所述腸道病毒71型與甲型肝炎聯合疫苗的方法，該方法無需添加明膠等保護劑，無需進行pH調節，所制得的疫苗吸附效果與穩定性均較好。接種本疫苗后，甲肝病毒對腸道病毒71型有佐劑效果，腸道病毒71型的免疫原性得到增強，免疫效果達到或超過單價疫苗的免疫效果。本疫苗具有腸道病毒71型與甲型肝炎的雙重免疫性與保護性能，接種本疫苗可以減少接種針次，簡化免疫程序，同時有效預防人及動物由腸道病毒71型和甲型肝炎病毒引起的疾病。
文檔編號A61K39/295GK102210858SQ20111012907
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月18日 優先權日2011年5月18日
發明者尹衛東, 蔡芳, 薛晨寶, 高強 申請人:北京科興生物制品有限公司