一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的生產(chǎn)方法

專利名稱：一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1949年，Lawrence首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌素陽(yáng)性供者的活淋巴細(xì)胞能使皮試陰性受者轉(zhuǎn)變?yōu)槠ぴ囮?yáng)性。以此為依據(jù)，1953年至1955年，Lawrence等將其對(duì)應(yīng)的白細(xì)胞可透析物質(zhì)(DLE)重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)DLE具備活淋巴細(xì)胞同樣的功能，即其提取物仍具有轉(zhuǎn)移遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用，并將這種能將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地傳給受體，使受體也具有該種細(xì)胞免疫力的物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)移因子(Lawrence HS. Transfer Factor *Advan Immunol,1969,(2) :195 ；Lawrence HS. The transfer in human of delayed skin sensitivity to Streptococcal M Substance and to tuberculinwith Disrupted Leucocytes · Clin Invest,1955,34) :219)。目前，在抗病毒的預(yù)防和治療中，急需的是一種具有良好的活化機(jī)體細(xì)胞免疫功能的免疫增強(qiáng)劑和能夠恢復(fù)機(jī)體正常免疫水平的免疫調(diào)節(jié)劑。二者應(yīng)具有以下特性能促進(jìn)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，也能作用于弱免疫性抗原；能以不同途徑使用，也能用于不同抗原；能在免疫抑制個(gè)體中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；用于食用動(dòng)物不應(yīng)有毒素殘留；能有效影響免疫反應(yīng)，質(zhì)量穩(wěn)定；廉價(jià)且容易生產(chǎn)。當(dāng)今在生物制品中關(guān)于免疫增強(qiáng)劑方面是研究的熱點(diǎn)， 其中又以微量、高效、無(wú)殘留特性的轉(zhuǎn)移因子更受關(guān)注。據(jù)報(bào)道，動(dòng)物TF的化學(xué)本質(zhì)為一種小肽與寡核苷酸復(fù)合物，能自由通過(guò)半透膜。粗制TF是小分子多肽和多核苷酸物質(zhì)，含有 K、Na、Ca、Mg、Zn等金屬元素，多核苷酸含核糖和堿性腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、6種以上氨基酸，等電點(diǎn)為4. 48，其多肽部分富含天冬氨酸，肽鏈N末端可能封閉，多肽與小分子RNA比例為2 1。由于TF分子質(zhì)量小，不具抗原性，應(yīng)用后不刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，而不會(huì)被抗體中和，可以反復(fù)使用，結(jié)合并激活淋巴細(xì)胞(Lawrence HS. Transfer Factor 'Advan Immunol, 1969，(2) 195 ；孫衛(wèi)民，王惠琴.細(xì)胞因子研究方法學(xué).北京人民衛(wèi)生出版社，2001 ；祁海燕，萬(wàn)芷芳.山羊單純疙疹病毒I型特異性轉(zhuǎn)移因子活性成分的生化鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，14(2) :113-115;何理平.轉(zhuǎn)移因子在動(dòng)物醫(yī)學(xué)上的研究進(jìn)展.湖北畜牧獸醫(yī)， 2003， (6) 44-49).)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以健康豬脾臟為原料，經(jīng)預(yù)處理、勻漿、超聲裂解、超濾分離、滅活等一系列生產(chǎn)工藝，用于生產(chǎn)豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液。豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的生產(chǎn)方法，主要是1.預(yù)處理取健康新鮮或冷凍的豬脾臟，去除外包裝解凍(勿損內(nèi)包裝)，放入緩沖區(qū)，用1%TH4+(TH4+為復(fù)方季銨鹽消毒劑，商品名稱為“法國(guó)TH4消毒液”,法國(guó)S0GEVAL 生產(chǎn)，上海羅曼動(dòng)物保健品公司代理銷售)浸泡消毒5min后，去除內(nèi)包裝。稱取脾臟，先用純化水清洗3次，再用注射用水清洗1次，洗畢控水。剔除脾臟被膜上的脂肪組織、系膜，用滅菌生理鹽水清洗脾臟2次，稱重。2.勻漿將脾臟用絞肉機(jī)(JR-100D，諸城市華都機(jī)械科技有限公司)絞碎，按1 1比例加入滅菌注射用水后用勻漿機(jī)O4CB10C，美國(guó)Waring生產(chǎn))勻漿。3.超聲裂解取勻漿液在超聲波粉碎儀(B⑶-2000，必能信(美國(guó))有限公司生產(chǎn))中超聲裂解0 8°C)，收取裂解后的漿液，-20°C凍存待用。4.超濾分離漿液經(jīng)4°C，6000r/min離心15min，收集上清液，經(jīng)5μπι濾柱 (5μπι，天津膜天膜有限公司生產(chǎn))預(yù)濾后，再通過(guò)30KDa的中空纖維超濾柱過(guò)濾(30KDa，天津膜天膜有限公司生產(chǎn))，然后經(jīng)過(guò)6KDa的中空纖維超濾柱(6KDa，天津膜天膜有限公司生產(chǎn))過(guò)濾即為原液。5.滅活向原液中加入最終濃度為0. 05%的甲醛溶液，37°C滅活12h，2 8°C保存，應(yīng)不超過(guò)14日。
具體實(shí)施例方式一、豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的制備1.脾臟的預(yù)處理取出采集或定點(diǎn)存放的豬脾臟，去除外包裝解凍(勿損內(nèi)包裝)，放入緩沖區(qū)，用TH4+浸泡消毒5min后，去除內(nèi)包裝。清洗稱取脾臟，先用純化水清洗3次，再用注射用水清洗1次，洗畢控水。除脂肪剔除脾臟被膜上的脂肪組織、系膜，用滅菌生理鹽水清洗脾臟2次，稱重。2.勻漿將脾臟用絞肉機(jī)(JR-100D，諸城市華都機(jī)械科技有限公司生產(chǎn))絞碎， 按1 1比例加入滅菌注射用水后用勻漿機(jī)(24CB10C，美國(guó)Waring生產(chǎn))勻漿。3.超聲裂解取勻漿液在超聲波粉碎儀(B⑶-2000，必能信(美國(guó))有限公司生產(chǎn))中超聲裂解0 8°C)，收取裂解后的漿液，-20°C凍存待用。4.超濾分離漿液經(jīng)4°C，6000r/min離心15min，收集上清液，經(jīng)5μπι濾柱 (5μπι，天津膜天膜有限公司生產(chǎn))預(yù)濾后，再通過(guò)30KDa的中空纖維超濾柱(30KDa，天津膜天膜有限公司生產(chǎn))過(guò)濾，然后經(jīng)過(guò)6KDa的中空纖維超濾柱(6KDa，天津膜天膜有限公司生產(chǎn))過(guò)濾即為原液。5.滅活向原液中加入最終濃度為0.05%的甲醛溶液，37°C滅活12h。，2 8°C保存，應(yīng)不超過(guò)14日。6.半成品檢驗(yàn)1.無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。2. pH值測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定。3.蛋白質(zhì)定性取20%磺基水楊酸溶液2ml與半成品anl，混合，仔細(xì)觀察混合后溶液是否有白色沉淀或渾濁。4.鑒別檢驗(yàn)將半成品做1 10稀釋，按分光光度法(見(jiàn)現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄)測(cè)定ODa5tln^ OD28tlnm值，并掃描圖譜，在051±2)nm波長(zhǎng)處是否有最大吸收。計(jì)算在
的比值。5.多肽含量測(cè)定按福林酚法(《中國(guó)藥典》中轉(zhuǎn)移因子溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的附注 1)進(jìn)行測(cè)定。6.核糖含量測(cè)定按核糖含量測(cè)定法(《中國(guó)藥典》中轉(zhuǎn)移因子溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的附注2)進(jìn)行測(cè)定。7.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)按細(xì)菌內(nèi)毒素法(參照由美國(guó)ACC生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū))進(jìn)行檢驗(yàn)。8.分裝根據(jù)多肽和核糖含量測(cè)定結(jié)果，將檢驗(yàn)合格的半成品無(wú)菌定量分裝，加塞，軋蓋即成成品。二、豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液成品檢驗(yàn)1.性狀微黃色或淡黃色透明液體。2. pH值測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，PH值應(yīng)為6. 0 7. 0。3.無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。4.安全檢驗(yàn)(1)熱原質(zhì)檢驗(yàn)用體重1. 7 3. Okg健康家兔(雌兔應(yīng)無(wú)孕)3只，單獨(dú)飼養(yǎng)2 日，應(yīng)無(wú)異常。每隔30min測(cè)量體溫1次，測(cè)量2次，兩次溫差不能超過(guò)0. 2°C，以此兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。當(dāng)日使用的家兔，正常體溫應(yīng)在38. 0 39. 6°C的范圍內(nèi)，且各兔間正常體溫之差不得超過(guò)1°C。試驗(yàn)用的注射器、針頭及一切與本品接觸的器皿， 應(yīng)滅熱原。家兔在測(cè)定其正常體溫15min以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量(注射量為每公斤體重0. 5ml)并溫?zé)嶂良s38°C的本品，然后每隔30min測(cè)溫1次，共測(cè)6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫升高的溫度(當(dāng)家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以0°C 計(jì))。3只家兔體溫升高的溫度應(yīng)均低于0. 6°C，且3只家兔體溫升高總和應(yīng)低于1. 40C。(2)用雞檢驗(yàn)用1日齡SPF雛雞10只，將本品用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍后，每只雞口服lml(相當(dāng)于10倍使用劑量)，24h重復(fù)口服一次，觀察5日。雛雞應(yīng)全部健活，且精神、采食、飲水、羽毛、糞便應(yīng)均無(wú)異常。(3)異常毒性檢驗(yàn)用體重18 22g健康小鼠5只，每只小鼠腹腔注射本品 0.5ml，觀察7日。小鼠應(yīng)全部健活，且精神、采食、飲水、糞便應(yīng)均無(wú)異常。(4)動(dòng)物過(guò)敏檢驗(yàn)用體重250 350g健康豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射本品1.0ml，共3次，進(jìn)行致敏。然后將其均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日，由肌肉注射本品1.0ml進(jìn)行攻擊。每日觀察每只動(dòng)物的行為和體征。觀察攻擊后30min內(nèi)，動(dòng)物有無(wú)豎毛、呼吸困難、抽搐等過(guò)敏反應(yīng)癥狀。肌肉注射本品池內(nèi)，不得出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。如有豎毛、噴嚏、干嘔、連續(xù)咳嗽3聲和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上， 或出現(xiàn)抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者，判本品不符合規(guī)定。5.效力檢驗(yàn)下列方法任擇其一。(I)T淋巴細(xì)胞活性檢驗(yàn)按脫E受體法進(jìn)行檢驗(yàn)，樣品管淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)百分率與對(duì)照管之差應(yīng)不低于10. 0%。(2)免疫法檢驗(yàn)用21 觀日齡SPF雞20只，隨機(jī)分成2組，每組10只，第1組為對(duì)照組，點(diǎn)眼免疫用無(wú)菌生理鹽水稀釋的雞新城疫活疫苗(Clone 30株或La Sota株)1 羽份/只；第2組為試驗(yàn)組，點(diǎn)眼免疫用豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液稀釋液(用無(wú)菌生理鹽水稀釋)稀釋的雞新城疫活疫苗(Clone 30株或La Sota株)1羽份/只，豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液原液用量為0.01ml/只，所有試驗(yàn)雞均于雞新城疫活疫苗免疫后21日采血，分離血清，檢測(cè)雞新城疫HI抗體。試驗(yàn)組雞新城疫HI抗體幾何平均滴度應(yīng)至少比對(duì)照組的高0. 81呢2。6.多肽含量測(cè)定按福林酚法進(jìn)行測(cè)定，每毫升多肽含量應(yīng)不低于1.5mg。7.核糖含量測(cè)定按核糖含量測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，每毫升核糖含量應(yīng)不低于 45 μ g0
8.甲醛殘留量測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)不超過(guò)0.05%。三、本發(fā)明(改進(jìn)生產(chǎn)方法)與傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的對(duì)比傳統(tǒng)生產(chǎn)方法以原料預(yù)處理、絞碎、勻漿、反復(fù)凍融、離心、透析、離心、過(guò)濾生產(chǎn)5 批，本發(fā)明采用脾臟預(yù)處理、除脂肪、絞碎、勻漿、超聲裂解、超濾分離、滅活生產(chǎn)5批，10批制品進(jìn)行性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、PH值測(cè)定、蛋白質(zhì)定性、游離氨基酸含量、多肽含量、核糖含量、鑒別檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)(異常毒性檢驗(yàn)、雞檢驗(yàn)、熱原質(zhì)檢驗(yàn)、動(dòng)物過(guò)敏檢驗(yàn))、細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)、免疫活性測(cè)定。生產(chǎn)工藝流程及生產(chǎn)結(jié)果表明，從投料量來(lái)看，改進(jìn)生產(chǎn)方法具有處理原料量大，單批次可處理40kg脾臟，而傳統(tǒng)生產(chǎn)方法單批次最多可處理7kg脾臟；從生產(chǎn)周期看，傳統(tǒng)生產(chǎn)方法至少需要7天，而改進(jìn)生產(chǎn)方法僅需要4 天的時(shí)間，具有省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)；從操作來(lái)看，傳統(tǒng)生產(chǎn)方法需要反復(fù)凍融工藝，需要隨時(shí)有人不斷地?cái)嚢枋蛊浠瘍?，而改進(jìn)生產(chǎn)方法僅需要一次凍融工藝和一臺(tái)超聲波粉碎儀完成聲波破碎，省時(shí)省力；傳統(tǒng)生產(chǎn)方法均需要使用透析袋，要人工對(duì)透析袋(MD77 (HOOODa)，上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司提供)進(jìn)行上下口結(jié)扎，每個(gè)透析袋最多可透析250ml的離心液， 而改進(jìn)生產(chǎn)方法采用三種孔徑的中空纖維濾柱取代了透析工藝，易于控制，省時(shí)省力，詳見(jiàn)表1。表1脾臟分離物及產(chǎn)量對(duì)比試驗(yàn)
權(quán)利要求
1. 一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的生產(chǎn)方法，其特征主要包括以下幾個(gè)步驟(1)預(yù)處理取健康新鮮或冷凍的豬脾臟，去除外包裝解凍，放入緩沖區(qū)，用TH4+ 浸泡消毒5min后，去除內(nèi)包裝；稱取脾臟，先用純化水清洗3次，再用注射用水清洗1次，洗畢控水；剔除脾臟被膜上的脂肪組織、系膜，用滅菌生理鹽水清洗脾臟2次，稱重；(2)勻漿將脾臟用絞肉機(jī)絞碎，按1 1比例加入滅菌注射用水后用勻漿機(jī)勻漿；(3)超聲裂解取勻漿液在超聲波粉碎儀中在2 8°C超聲裂解后收取裂解后的漿液，-20°C凍存待用；(4)超濾分離漿液經(jīng)4°C，6000r/min離心15min，收集上清液，經(jīng)5μ m濾柱預(yù)濾后， 再通過(guò)30KDa的中空纖維超濾柱過(guò)濾，然后經(jīng)過(guò)6KDa的中空纖維超濾柱過(guò)濾即為原液；(5)滅活向原液中加入最終濃度為0.05%的甲醛溶液，37°C滅活12h;抽樣進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，2 8°C保存，應(yīng)不超過(guò)14日。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的生產(chǎn)方法。改進(jìn)生產(chǎn)方法采用的是低溫超聲波裂解法，比較上述工藝技術(shù)其主要特點(diǎn)在于，低溫超聲波裂解法產(chǎn)生的超聲波和局域超高壓物理強(qiáng)化條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)脾臟組織和細(xì)胞的破碎，能夠保護(hù)加工材料原有生物活性成分不被破壞，并能獲取純天然的高效生物活性物質(zhì)和全價(jià)氨基酸。該方法在保證產(chǎn)品安全性的基礎(chǔ)上，不但避免了傳統(tǒng)高溫生物滅活方法所帶來(lái)的活性成分損失的弊端，使生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)條件大大簡(jiǎn)化，極大地降低了生產(chǎn)成本，顯著提高了生產(chǎn)效率，具備規(guī)?；a(chǎn)的必備條件。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102198155SQ201110126248
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者劉蕾, 杜元釗, 申洪銀, 胡瀟, 范根成, 鄒敏, 陶曉珊 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司