專利名稱：一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，具體是一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
全世界目前感染乙型肝炎病毒(HBV)的人有3. 5億左右，我國目前有慢性HBV感染1. 3億人。慢性HBV感染嚴(yán)重威脅著人類健康，持續(xù)感染會發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。目前，醫(yī)學(xué)界尚無根治乙肝的良藥，大規(guī)模接種乙肝疫苗是預(yù)防HBV感染的最經(jīng)濟(jì)、 最有效的方法，也是降低HBV危害的根本措施。乙肝疫苗的主要成分是乙肝表面抗原(HbsAg)，佐劑為傳統(tǒng)的氫氧化鋁。1擬6年Glermy首先發(fā)現(xiàn)鋁佐劑沉淀的白喉類毒素(DT)懸液要比類毒素本身具有更高的抗原性，自此各種佐劑成為研究的焦點(diǎn)。現(xiàn)有資料表明，新型佐劑乙肝疫苗有脂質(zhì) A與鋁鹽配伍的佐劑系統(tǒng)乙肝疫苗、納米佐劑乙肝疫苗、脂質(zhì)體乙肝疫苗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Gm-CSF)佐劑乙肝疫苗、植物佐劑乙肝疫苗、免疫激活序列佐劑乙肝疫苗、 微球投遞佐劑系統(tǒng)乙肝疫苗等(馮利、趙歡、薛士科、齊憲榮“乙型肝炎疫苗及其佐劑的研究進(jìn)展”。中國新藥雜志2007年第16卷第20期)。但新型佐劑乙肝疫苗并未投入產(chǎn)業(yè)化的疫苗生產(chǎn)，而只處于研究階段。對于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還需進(jìn)一步的考察和驗(yàn)證。迄今為止，鋁鹽佐劑是唯一被美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)批準(zhǔn)用于人用疫苗的免疫佐劑，經(jīng)過長期的應(yīng)用，氫氧化鋁佐劑的有效性和安全性得到了實(shí)踐的驗(yàn)證。因此，將目前廣泛應(yīng)用的氫氧化鋁佐劑進(jìn)行必要的優(yōu)化，使其在現(xiàn)有的有效性和安全性基礎(chǔ)上得到進(jìn)一步的優(yōu)化與提升，對于提高乙肝疫苗的免疫原性是很有必要的。世界衛(wèi)生組織(WHO)近年統(tǒng)計(jì)，在0、1、6個(gè)月進(jìn)行3針乙肝疫苗接種的人群中，約有5%的人是無效的。Gupta等已經(jīng)證實(shí)鋁佐劑吸附疫苗的免疫效果取決于佐劑對抗原的吸附度，抗原與佐劑的吸附率是決定免疫效果的重要因素。吸附率越高，免疫效果越好；反之，吸附率越低，免疫效果越差(Gupta Rk, Rost BE, Relyveld Ε, et al. Vaccine design the subunit and adjuvant approach. NEffYork :Plenum Press, 1995 :229-248 ；^Oj開云、當(dāng)P 全明、“鋁佐劑在幽門螺桿菌疫苗中的應(yīng)用”。免疫學(xué)雜志，2004. 20(3) :S50)。WHO要求白喉和破傷風(fēng)類毒素苗的吸附率至少要達(dá)到80%。常規(guī)的鋁佐劑疫苗分鋁沉淀疫苗和鋁吸附疫苗兩種，鋁沉淀疫苗是將鋁佐劑懸液加入到抗原中；鋁吸附疫苗是將抗原溶液加入到氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑中?，F(xiàn)有的乙肝疫苗鋁吸附工藝中是先配制Al (OH)3K劑，即AlCl3溶液與NaOH溶液反應(yīng)生產(chǎn)lmg/ml的 Al (OH) 3再加入乙肝表面抗原，從而制成乙肝疫苗。現(xiàn)有的乙肝疫苗鋁佐劑吸附工藝存在佐劑吸附率低、疫苗接種量高和抗體陽轉(zhuǎn)率不理想等問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法。現(xiàn)有的乙肝疫苗鋁吸附工藝中是先配制Al (OH) 3佐劑，即AlCl3溶液與NaOH溶液反應(yīng)生產(chǎn)lmg/ml的Al (OH) 3再加入乙肝表面抗原，從而制成乙肝疫苗。其制備工藝如下先用注射用水配制10%々1(13溶液、0. 5mol/L NaOH溶液、0. 9% NaCl溶液；開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中按鋁佐劑終濃度為1. Omg/ ml的量加入10% AlCl3溶液，再加0. 5mol/L NaOH溶液，當(dāng)pH值達(dá)到7. 0時(shí)，停加溶液，補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液至所需體積，經(jīng)12rC，30min濕熱滅菌后為待用的鋁佐劑；按半成品中抗原終濃度為20μ g/ml的含量量取乙肝表面抗原原液，加入到等體積的鋁佐劑中，攪拌充分，即為乙肝疫苗半成品。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)不同的是:A1 (OH)3佐劑不是前期配制完成的，而是將PBS緩沖液、KAl (S04) 2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在線反應(yīng)生成的 Al (OH)3佐劑，在不斷生成Al (OH)3K劑的同時(shí)不斷包裹和吸附乙肝表面抗原，稱之為“原位吸附”。制備的樣品為乳白色的凝膠狀半固體，它能從溶液中強(qiáng)烈吸附蛋白質(zhì)抗原，形成沉淀。當(dāng)其接種到機(jī)體內(nèi)后可形成一個(gè)“抗原庫”，緩慢釋放出抗原，充分延長了抗原的作用時(shí)間，起到長期保護(hù)的作用。同時(shí)還能促進(jìn)局部(注射部位)巨噬細(xì)胞的應(yīng)答。本發(fā)明的技術(shù)方案具體為一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于鋁佐劑Al (OH) 3是在線反應(yīng)生成， 即將PBS緩沖液、KAl (S04) 2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在生成Al (OH)3佐劑的同時(shí)包裹和吸附乙肝表面抗原，其步驟是①注射用水分別配制3mmol/L PBS緩沖液、質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的KAl (S04) 2溶液、 0. 5mol/L NaOH溶液、質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 9%的NaCl溶液，并用0. 22 μ m的濾膜除菌過濾，備用；②向反應(yīng)器皿中加入200mlPBS溶液，在攪拌條件下向PBS溶液中加入乙肝表面抗原原液，使其終濃度為20 μ g/ml (按照制備體積600ml，抗原終濃度為20 μ g/ml計(jì)算，需要加入抗原12mg)；繼續(xù)加入150ml PBS溶液，然后加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的KAl (S04)2溶液，使其終濃度為0. 5mg/ml (按照制備體積600ml，鋁離子終濃度為0. 5mg/ml計(jì)算，需要加 Λ KAl (S04) 2溶液54ml)；再加入0. 5mol/LNaOH溶液至pH值為7. 0時(shí)，補(bǔ)加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 0. 9%的NaCl溶液至600ml，密封混合液，經(jīng)沉淀洗滌工藝制成乙肝疫苗半成品；所述乙肝表面抗原原液，是按照常規(guī)技術(shù)制成；步驟②所述沉淀洗滌工藝是i將密封的混合液沉淀12-19小時(shí)后，棄掉上清液，留沉淀，加入0. 9% NaCl溶液至半成品原體積，攪拌30分鐘，再次密封沉淀；i i重復(fù)上述步驟i兩次；iii第四次沉淀20小時(shí)后取上清液棄掉，加入0. 9% NaCl溶液至半成品原體積， 攪拌30分鐘，混勻，制成乙肝疫苗半成品；所述乙肝表面抗原包括重組酵母乙肝表面抗原和重組CHO乙肝表面抗原；所述乙肝表面抗原為重組酵母乙肝表面抗原；所述重組酵母乙肝表面抗原為重組漢遜酵母乙肝表面抗原；所述重組漢遜酵母乙肝表面抗原原液的是由下述制備工藝制成I收集發(fā)酵液取國家批準(zhǔn)的重組漢遜酵母乙型肝炎疫苗的原始菌種，經(jīng)四代擴(kuò)增，制成工作種子批菌種，將其接種于300ml培養(yǎng)基中，30 35°C培養(yǎng)M小時(shí)后轉(zhuǎn)接到3L培養(yǎng)基中，30 35°C培養(yǎng)M小時(shí)，再轉(zhuǎn)接到30L培養(yǎng)基中30 35°C培養(yǎng)15小時(shí)，最終轉(zhuǎn)接到200L培養(yǎng)基中30 35°C培養(yǎng)，控制溶氧大于20%、pH6. 8、空氣流量30 200ml/h， 培養(yǎng)65 70小時(shí)后，收集表達(dá)乙肝疫苗表面抗原的漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液；II初步提純用物理破碎法研磨破碎漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液，使其達(dá)到90%以上的破碎率；以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心去除細(xì)胞碎片，用氯化鈉/PEG6000進(jìn)行雙水相萃取8_10小時(shí)后，于6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，留上清液，再用硅膠溶液吸附10-16個(gè)小時(shí)后，于60°C進(jìn)行脫吸附反應(yīng)1小時(shí)，再于4000rpm的轉(zhuǎn)速離心，留上清液；III精細(xì)純化將初步提純樣品進(jìn)行陰離子柱層析，使用lOOmmol/L的Tris緩沖溶液，監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，將蛋白峰用50K膜進(jìn)行體積濃縮10倍左右，再進(jìn)行等密度區(qū)帶離心，監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，之后再用分子篩柱層析，使用生理緩沖溶液進(jìn)行蛋白分離、脫鹽，監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于0. 8的 HBsAg蛋白峰，使其純度達(dá)到99. 0 %以上，最終稀釋HBsAg蛋白質(zhì)含量在100-300 μ g/ml，經(jīng) 0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌，即為重組漢遜酵母乙肝表面抗原原液；所述培養(yǎng)基配方為甘油、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫銨，每升組分質(zhì)量比為 5 2 1 0. 1 4，用注射用水配制，經(jīng)121°C，30min滅菌；所述國家批準(zhǔn)的重組漢遜酵母乙型肝炎疫苗的原始菌種的菌種號為 HBsAgU35-16-9 (中華人民共和國藥典，2010年版，三部，重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)，第 132頁)，由大連漢信生物制藥有限公司保存，可通過商業(yè)購買的方式從該公司購得。本發(fā)明方法制備的乙肝疫苗半成品，按照常規(guī)技術(shù)加工處理后制成乙肝疫苗成
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ΡΠ O本發(fā)明的有益效果為與傳統(tǒng)工藝相比，本發(fā)明(原位吸附法)所用溶液均經(jīng)除菌過濾，不必進(jìn)行高壓滅菌，簡化工藝步驟且降低生產(chǎn)成本；本發(fā)明中的Al (OH)3佐劑為原位反應(yīng)生成，使乙肝表面抗原吸附率大大提高，從而提高了抗原的免疫原性，疫苗的小鼠ED5tl 檢測結(jié)果也顯著優(yōu)于前者，能更有效地引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更多的保護(hù)性抗體。實(shí)踐證明用此種方法生產(chǎn)的鋁佐劑乙肝疫苗具有接種量小、不良反應(yīng)少，免疫后可誘導(dǎo)高水平的抗體應(yīng)答，抗體陽轉(zhuǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施示例與比較示例詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受以下實(shí)施示例的任何限制。原料說明菌種由大連漢信生物制藥有限公司自主研發(fā)的以DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)HBsAg 的重組漢遜酵母工程菌株，菌種號為HBsAgU35-16-9 (中華人民共和國藥典，2010年版，三部，重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)，第132頁)，由大連漢信生物制藥有限公司保存；發(fā)酵培養(yǎng)基配方甘油、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫銨，每升組分質(zhì)量比是 5 2 1 0. 1 4，用注射用水配制，經(jīng)121°C，30min滅菌；氯化鈉溶液濃度3mol/L，使用注射用水配制，經(jīng)0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌；PGE6000溶液濃度50%，使用注射用水配制，經(jīng)121°C，30min滅菌；硅膠溶液濃度7. 5 %，使用注射用水配制，經(jīng)12rC，30min滅菌；
Tris-HCl+2mol/LNaCl 溶液Tris (批號 WF0131LA01，美國)，濃度 0. lmol/L, pH8. 5，使用注射用水配制，經(jīng)0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌；溴化鉀溶液密度分別為1. 04g/ml、l. 28g/mlU. Mg/ml，使用注射用水配制，經(jīng) 0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌；氯化鈉溶液濃度0. 9%，使用注射用水配制，經(jīng)0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌；磷酸鹽緩沖液磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，濃度3mmol/L，使用注射用水配制，經(jīng) 0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌；AlCl3溶液濃度10%，使用注射用水配制；氫氧化鈉溶液濃度0. 5mol/L,使用注射用水配制；硫酸鉀鋁溶液濃度10%，使用注射用水配制，經(jīng)0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌。實(shí)施例1重組(漢遜酵母)乙肝表面抗原原液的制備發(fā)酵取重組漢遜酵母工作種子批菌種1支(由菌種號為HBsAgU35-16_9的重組漢遜酵母乙型肝炎疫苗的原始菌種擴(kuò)增而得)，接種于300ml培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)M小時(shí)后轉(zhuǎn)接到3L培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)M小時(shí)，再轉(zhuǎn)接到30L培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)15小時(shí)，最終轉(zhuǎn)接到200L培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)，控制溶氧大于20%、pH6. 8、空氣流量30 200ml/h，培養(yǎng) 65小時(shí)后，收集表達(dá)乙肝病毒表面抗原的漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液約M0L。初步提純用物理破碎法研磨破碎漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液，達(dá)到92%的破碎率， 以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心去除細(xì)胞碎片，用氯化鈉/PEG6000進(jìn)行雙水相萃取9小時(shí)后，于 6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集上清液約230L，再用硅膠溶液吸附15個(gè)小時(shí)，于60°C進(jìn)行脫吸附反應(yīng)1小時(shí)，再于4000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集上清液約110L，完成初步純化。精細(xì)純化將初步提純上清液進(jìn)行DEAE Sepharose FF陰離子柱層析，上樣量為柱體積的10倍，流速為60L/h，用lOOmmol/L的Tris緩沖液洗脫，監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，將收集的蛋白峰進(jìn)行濃縮，再進(jìn)行等密度區(qū)帶離心，監(jiān)測A280nm值，收集 OD值大于1的蛋白峰，之后再用分子篩柱層析，使用0. 9%氯化鈉溶液進(jìn)行蛋白分離、脫鹽， 監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于0. 8的HBsAg蛋白峰共28. 2L。使用HPLC法檢測其純度達(dá)到99. 0%以上，最終用磷酸鹽緩沖液稀釋HBsAg蛋白質(zhì)含量在220 μ g/ml，經(jīng)0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌60L，即為重組漢遜酵母乙肝表面抗原原液。實(shí)施例2乙肝疫苗半成品制備(鋁佐劑+HBsAg工藝-現(xiàn)有技術(shù))，半成品批號為
5201001鋁佐劑制備開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中加入10% AlCl3溶液5細(xì)1，以50ml/min的速度加入0. 5mol/L NaOH溶液，隨時(shí)取樣測量pH值，當(dāng)pH值達(dá)到7. 00時(shí)，停加溶液，加入 0. 5mol/L NaOH 溶液 110ml，再補(bǔ)加 0. 9% NaCl 溶液 436ml 終體積 600ml，再經(jīng) 121°C，30min 濕熱滅菌為待用的鋁佐劑。原液稀釋取蛋白質(zhì)含量220μ g/ml的原液(由實(shí)施例1制得)54. 5ml放置于 500ml三角瓶中，加入0. 9% NaCl溶液300ml，使其蛋白質(zhì)含量為40 μ g/ml。半成品吸附開啟攪拌，向另一反應(yīng)瓶中加入300ml鋁佐劑，再加入稀釋后的原液 300ml，攪拌30min后，即為乙肝疫苗半成品，半成品批號為S201001。實(shí)施例3乙肝疫苗半成品制備(鋁佐劑+HBsAg工藝-現(xiàn)有技術(shù))，半成品批號為
5201002
鋁佐劑制備開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中加入10% AlCl3溶液5細(xì)1，以50ml/min的速度加入0. 5mol/L NaOH溶液，隨時(shí)取樣測量pH值，當(dāng)pH值達(dá)到6. 95時(shí)，停加溶液，加入 0. 5mol/L NaOH 溶液 108ml，再補(bǔ)加 0. 9% NaCl 溶液 438ml 終體積 600ml，再經(jīng) 121°C，30min 濕熱滅菌為待用的鋁佐劑。原液稀釋取蛋白質(zhì)含量220μ g/ml的原液(由實(shí)施例1制得)54. 5ml放置于 500ml三角瓶中，加入0. 9% NaCl溶液300ml，使其蛋白質(zhì)含量為40 μ g/ml。半成品吸附開啟攪拌，向另一反應(yīng)瓶中加入300ml鋁佐劑，再加入稀釋后的原液 300ml，攪拌30min后，即為乙肝疫苗半成品，半成品批號為S201002。實(shí)施例4乙肝疫苗半成品制備(鋁佐劑+HBsAg工藝-現(xiàn)有技術(shù))，半成品批號為 S201003鋁佐劑制備開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中加入10% AlCl3溶液5細(xì)1，以50ml/min的速度加入0. 5mol/L NaOH溶液，隨時(shí)取樣測量pH值，當(dāng)pH值達(dá)到7. 00時(shí)，停加溶液，加入 0. 5mol/L NaOH 溶液 115ml，再補(bǔ)加 0. 9% NaCl 溶液 431ml 終體積 600ml，再經(jīng) 121°C，30min 濕熱滅菌為待用的鋁佐劑。原液稀釋取蛋白質(zhì)含量220μ g/ml的原液(由實(shí)施例1制得)54. 5ml放置于 500ml三角瓶中，加入0. 9% NaCl溶液300ml，使其蛋白質(zhì)含量為40 μ g/ml。半成品吸附開啟攪拌，向另一反應(yīng)瓶中加入300ml鋁佐劑，再加入稀釋后的原液 300ml，攪拌30min后，即為乙肝疫苗半成品，半成品批號為S201003。實(shí)施例5乙肝疫苗半成品生產(chǎn)工藝(原位吸附-本發(fā)明)，半成品批號為S201004開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中，加入200ml PBS溶液；加入220 μ g/ml的原液(由實(shí)施例 1制得)54. 5ml ；再加入150ml PBS溶液；再加入10 % KAl (S04)2溶液54. 7ml ；之后加入 0. 9% NaCl溶液至總重量520ml時(shí)；開始向反應(yīng)瓶中以50ml/min速度加入0. 5mol/L NaOH 溶液，當(dāng)加入45ml的0. 5mol/L NaOH溶液時(shí)，取樣測pH值，當(dāng)pH值達(dá)到5. 50時(shí)，控制流加0. 5mol/L NaOH溶液速度為20ml/min,隨時(shí)取樣測量pH值，當(dāng)pH值達(dá)到7. 00時(shí)，停加 0. 5mol/L NaOH溶液，共加入56ml ；最后補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液至600ml，攪拌10分鐘后停止攪拌；密封沉淀。第一次洗滌沉淀沉淀19小時(shí)后，將上清液棄掉，再加入0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，攪拌10分鐘，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。第二次洗滌沉淀沉淀12小時(shí)后，將上清液棄掉，加入0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，開啟攪拌10分鐘，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。 第三次洗滌沉淀沉淀12小時(shí)后，將上清液棄掉，補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml。 開啟攪拌10分鐘后，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。半成品配制沉淀20小時(shí)后將上清液棄掉，補(bǔ)加 0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，開啟攪拌30分鐘，混勻，即成乙肝疫苗半成品，半成品批號為 S201004。實(shí)施例6乙肝疫苗半成品生產(chǎn)工藝(原位吸附-本發(fā)明)，半成品批號為S201005開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中，加入200ml PBS溶液；加入220 μ g/ml的原液(由實(shí)施例1 制得)54. 5ml ；再加入150ml PBS溶液；再加入10% KAl (S04)2溶液Μ. 7ml ；之后加入0.9% NaCl溶液至總重量520ml時(shí)；開始向反應(yīng)瓶中以50ml/min速度加入0. 5mol/L NaOH溶液， 當(dāng)加入45ml的0. 5mol/L NaOH溶液時(shí)，取樣測pH值，當(dāng)pH值達(dá)到5. 5時(shí)，控制流加0. 5mol/L NaOH溶液速度為20ml/min，隨時(shí)取樣測量pH值，當(dāng)pH值達(dá)到6. 88時(shí)，停加0. 5mol/L NaOH溶液，加入52ml ；最后補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液至600ml，攪拌10分鐘后停止攪拌；密封沉淀。第一次洗滌沉淀沉淀19小時(shí)后，將上清液棄掉，再加入0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，攪拌10分鐘，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。第二次洗滌沉淀沉淀12小時(shí)后，將上清液棄掉，加入0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，開啟攪拌10分鐘，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。第三次洗滌沉淀沉淀12小時(shí)后，抽取上清液棄掉，補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml。 開啟攪拌10分鐘后，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。半成品配制沉淀20小時(shí)后將上清液棄掉，補(bǔ)加 0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，開啟攪拌30分鐘，混勻，即成乙肝疫苗半成品，半成品批號為 S201005。實(shí)施例7乙肝疫苗半成品生產(chǎn)工藝(原位吸附-本發(fā)明)，半成品批號為S201006開啟攪拌，向反應(yīng)瓶中，加入200ml PBS溶液；加入220μ g/ml的原液(由實(shí)施例1 制得)54. 5ml ；再加入150ml PBS溶液；再加入10% KAl (S04)2溶液Μ. 7ml ；之后加入0.9% NaCl溶液至總重量520ml時(shí)；開始向反應(yīng)瓶中以50ml/min速度加入0. 5mol/L NaOH溶液， 當(dāng)加入45ml的0. 5mol/L NaOH溶液時(shí)，取樣測pH值，當(dāng)pH值達(dá)到5. 5時(shí)，控制流加0. 5mol/L NaOH溶液速度為20ml/min，隨時(shí)取樣測量pH值，當(dāng)pH值達(dá)到6. 92時(shí)，停加0. 5mol/L NaOH 溶液，加入58ml ；最后補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液至600ml，攪拌10分鐘后停止攪拌；密封沉淀。第一次洗滌沉淀沉淀19小時(shí)后，將上清液棄掉，再加入0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，攪拌10分鐘，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。第二次洗滌沉淀沉淀12小時(shí)后，將上清液棄掉，加入0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，開啟攪拌10分鐘，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。 第三次洗滌沉淀沉淀12小時(shí)后，將上清液棄掉，補(bǔ)加0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml。 開啟攪拌10分鐘后，關(guān)閉攪拌，密封沉淀。半成品配制沉淀20小時(shí)后將上清液棄掉，補(bǔ)加 0. 9% NaCl溶液進(jìn)反應(yīng)瓶至600ml，開啟攪拌30分鐘，混勻，即成乙肝疫苗半成品，半成品批號為 S201006。實(shí)施例8乙肝疫苗半成品吸附完全性、小鼠ED5tl、鋁顆粒沉降速度及外觀檢測吸附完全性試驗(yàn)方法試劑參考品重組(酵母)乙型肝炎疫苗凍干參考品來源于中國藥品生物制品檢定所。乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒來源于上?？迫A生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)步驟將待檢樣品于6500轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5分鐘取得上清液，依重組乙型肝炎疫苗(酵母)體外相對效力檢查法測定參考品、待檢樣品及其上清液中HBsiVg含量。以參考品HBsAg 含量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)吸光度值的對數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。將待檢樣品及上清液的的吸光度值代入直線回歸方程，計(jì)算HBsiVg含量。再按下式計(jì)算吸附率。P(%) = (I--^)XlOO
C/式中P為待檢樣品的吸附率，％ ；Cs為待檢樣品上清液的HBsAg的含量，μ g/ml ；Ct為待檢樣品的HBsAg的含量，μ g/ml。小鼠體內(nèi)效力(ED5tl)檢測方法
試劑乙型肝炎病毒表面抗體診斷試劑盒來源于上?？迫A生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動物購于大連醫(yī)科大學(xué)BALB/c小鼠。試驗(yàn)步驟將疫苗連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度接種體重為14 16g的BALB/c小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml。飼養(yǎng)4 6周后，從小鼠眼球處取血約lml，制備免疫血清。使用乙型肝炎病毒表面抗體診斷試劑盒測定抗-HBs，根據(jù)每個(gè)稀釋度的抗體陽性數(shù)，計(jì)算抗體陽轉(zhuǎn)率，進(jìn)一步計(jì)算ED5tl。ED50值=10艦陽轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)點(diǎn)對數(shù)其中50%陽轉(zhuǎn)率終點(diǎn)對數(shù)=高于50%陽轉(zhuǎn)率稀釋度(含量)對數(shù)+距離比X稀
釋系列對數(shù)
權(quán)利要求
1.一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于鋁佐劑Al (OH)3是在線反應(yīng)生成，即將PBS緩沖液、KAl (S04) 2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在生成Al (OH)3佐劑的同時(shí)包裹和吸附乙肝表面抗原，包括如下步驟①用注射用水分別配制3mmol/LPBS緩沖液、質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10 %的KAl (S04) 2溶液、 0. 5mol/L NaOH溶液、質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 9%的NaCl溶液，并用0. 22 μ m的濾膜除菌過濾，備用；②向反應(yīng)器皿中加入200mlPBS溶液，在攪拌條件下，按半成品中抗原終濃度為 20 μ g/ml的含量，向PBS溶液中加入乙肝表面抗原原液；再加入150ml PBS溶液，按半成品中終濃度為0. 5mg/ml的鋁含量加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的KAl (S04)2溶液，再加入0. 5mol/ L NaOH溶液，調(diào)pH值至7. 0，補(bǔ)加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 9%的NaCl溶液至600ml，密封混合液， 經(jīng)沉淀洗滌工藝制成乙肝疫苗半成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于步驟②所述沉淀洗滌工藝是i將密封的混合液沉淀12-19小時(shí)后，棄掉上清液，留沉淀，加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 9%的 NaCl溶液至半成品原體積，攪拌30分鐘，再次密封沉淀；ii重復(fù)上述步驟i兩次；iii第四次沉淀20小時(shí)后將上清液棄掉，加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 9%的NaCl溶液至半成品原體積，攪拌30分鐘，混勻，制成乙肝疫苗半成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于所述乙肝表面抗原包括重組酵母乙肝表面抗原和重組CHO乙肝表面抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于所述乙肝表面抗原為重組酵母乙肝表面抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于所述重組酵母乙肝表面抗原為重組漢遜酵母乙肝表面抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于所述重組漢遜酵母乙肝表面抗原原液的是由下述制備工藝制成I收集發(fā)酵液取國家批準(zhǔn)的重組漢遜酵母乙型肝炎疫苗的原始菌種，經(jīng)四代擴(kuò)增，制成工作種子批菌種，將其接種于300ml培養(yǎng)基中，30 35°C培養(yǎng)M小時(shí)后轉(zhuǎn)接到3L培養(yǎng)基中，30 35°C培養(yǎng)M小時(shí)，再轉(zhuǎn)接到30L培養(yǎng)基中30 35°C培養(yǎng)15小時(shí)，最終轉(zhuǎn)接到 200L培養(yǎng)基中30 35°C培養(yǎng)，控制溶氧大于20%、pH6. 8、空氣流量30 200ml/h，培養(yǎng) 65 70小時(shí)后，收集表達(dá)乙肝病毒表面抗原的漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液；II初步提純用物理破碎法研磨破碎漢遜酵母細(xì)胞發(fā)酵液，使其達(dá)到90%以上的破碎率；以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心去除細(xì)胞碎片，用氯化鈉/PEG6000進(jìn)行雙水相萃取8_10小時(shí)后，于6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，留上清液，再用硅膠溶液吸附10-16個(gè)小時(shí)后，于60°C進(jìn)行脫吸附反應(yīng)1小時(shí)，再于4000rpm的轉(zhuǎn)速離心，留上清液；III精細(xì)純化將初步提純樣品進(jìn)行陰離子柱層析，使用lOOmmol/L的Tris緩沖溶液， 監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，將蛋白峰用50K膜進(jìn)行體積濃縮10倍，再進(jìn)行等密度區(qū)帶離心，監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于1的蛋白峰，之后再用分子篩柱層析，使用生理緩沖溶液進(jìn)行蛋白分離、脫鹽，監(jiān)測A280nm值，收集OD值大于0. 8的HBsAg蛋白峰，使其純度達(dá)到99. 0%以上，最終稀釋HBsAg蛋白質(zhì)含量在100-300 μ g/ml，經(jīng)0. 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌，即為重組漢遜酵母乙肝表面抗原原液；所述培養(yǎng)基配方為甘油、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫銨，每升組分質(zhì)量比為 5 2 1 0. 1 4，用注射用水配制，經(jīng)121°C，30min滅菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，其特征在于所述國家批準(zhǔn)的重組漢遜酵母乙型肝炎疫苗的原始菌種的菌種號為HBsAgU35-16-9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含鋁佐劑乙肝疫苗的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于鋁佐劑Al(OH)3是在線反應(yīng)生成，即將PBS緩沖液、KAl(SO4)2溶液、乙肝表面抗原原液混合后，向混合液中加入NaOH溶液，在不斷生成Al(OH)3佐劑的同時(shí)不斷包裹和吸附乙肝表面抗原，稱之為“原位吸附”。本發(fā)明中的Al(OH)3佐劑為原位反應(yīng)生成，使乙肝表面抗原吸附率大大提高，從而提高了抗原的免疫原性，能更有效地引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更多的保護(hù)性抗體。實(shí)踐證明用本發(fā)明方法生產(chǎn)的鋁佐劑乙肝疫苗具有接種量小、不良反應(yīng)少，免疫后可誘導(dǎo)高水平的抗體應(yīng)答，抗體陽轉(zhuǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)還簡化了工藝步驟、大大降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號A61P1/16GK102198270SQ201110126060
公開日2011年9月28日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者張娟, 張平, 張海春, 李曉宇, 李貴興, 陳新亭 申請人:大連漢信生物制藥有限公司