專利名稱：微小分子rna-155的抗動脈粥樣硬化藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及微小分子RNA-155在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的用途。
背景技術：
目前一致公認動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多基因，多因素的疾病，其發病機制與炎癥反應，氧化應激，細胞凋亡以及血流動力學改變等有關，是一個極為復雜的病理過程。AS斑塊的不穩定將導致嚴重心血管事件，免疫炎癥反應在AS發生尤其是斑塊的穩定性中起著關鍵作用。斑塊不穩定也受多因素的影響，某一種蛋白或者分子異常往往無法反映整個病理過程，以往單純針對某個靶基因/蛋白或者某個轉導通路進行干預的傳統方法存在很大局限性，因此了解AS免疫細胞生物學功能的多靶位基因表達機制，將是我們更深入認識AS形成的病理生理機制、尋找調控AS靶點的關鍵，microRNA的出現為這一目標的實現提供了極大的可能。MicroRNAs (miRNAs)是一組長約22個核苷酸、保守的非編碼小RNA，通過轉錄后水平調控基因的表達從而在生物過程中發揮重要的作用。MiRNA表達水平的改變能夠調節許多心血管疾病發生相關的重要生物學過程，如心臟發育，心肌肥厚，心律失常，血管發生等，系統評價某種確定表型AS相關miRNA表達譜的變化將有利于我們更深入的理解AS發生發展和轉歸的機制。miRNA-155是近幾年來發現在免疫炎癥中有重要調控作用的經典 microRNA，并有許多研究證實了其與免疫炎癥相關的靶基因。現階段，針對動脈粥樣硬化、冠心病的預防和治療主要集中在抑制動脈粥樣硬化炎癥反應、調整血脂、抑制血小板聚集、去除/減少致動脈粥樣硬化進展的多種危險因素等措施，根據發明人對本領域的研究和檢索，目前microRNA對動脈粥樣硬化治療方面的研究幾乎近于空白。因而，根據microRNA的作用機制提示進行一系列研究來明確miRNA-155在改善動脈粥樣硬化炎癥反應，實現對冠心病的防治很有必要，并期待通過本發明人的一系列驗證使miRNA-155有望成為一種改善動脈粥樣硬化、治療冠心病的新型核酸藥物。
發明內容
本發明的目的在于提供一種微小分子RNA-155 (miRNA-155)在制備抗動脈粥樣硬化炎癥藥物中的應用，所述miRNA-155的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示 UUAAUGCUAAUC⑶GAUAGGG⑶。本發明所述的miRNA-155作為原料藥用于制備預防和治療動脈粥樣硬化炎癥的核酸藥物，該藥物能有效的防治核酸在生物體內降解，并能高效的作用目的組織，本發明所述的miRNA-155還可以與目前已知的其他治療動脈粥樣硬化炎癥的藥物，如他汀類調脂藥等制成復方制劑，用于治療動脈粥樣硬化炎癥。本發明通過各種實驗證明，無論在體外細胞水平還是體內動脈粥樣模型小鼠水平，都證實了 miRNA-155對動脈粥樣硬化炎癥具有明顯的抑制作用，由于miRNA-155是位
3于基因上游的調控分子，并且同時有多種生物學功能，因此miRNA-155很有可能成為動脈粥樣硬化治療的全新靶點。本發明開辟了 miRNA-155作為一種核酸藥物的新用途，也為動脈粥樣硬化炎癥的治療提供了一種新的途徑。
圖 1 miRNA-155 對 THP-I 細胞 MAI3K 信號通路(p38, JNK, ERK1/2)作用。圖2 miRNA-155體內激動劑agomir-155對APOE動脈粥樣硬化模型小鼠血清，血管以及外周血單個核細胞炎癥因子TNF-a蛋白水平影響。圖3是miRNA-155體內激動劑agomir-155對APOE動脈粥樣硬化模型小鼠血清， 血管以及外周血單核細胞炎癥因子IL-6蛋白水平影響。圖4 miRNA-155體內激動劑agomir-155對APOE動脈粥樣硬化模型小鼠血清，血管以及外周血單個核細胞炎癥因子TNF-a分子水平影響。圖5是miRNA-155體內激動劑agomir-155對APOE動脈粥樣硬化模型小鼠血清， 血管以及外周血單核細胞炎癥因子IL-6分子水平影響。
具體實施例方式本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例1 miR-155轉染THP-I細胞后細胞生物學功能變化
本申請用于體外細胞實驗轉染用的miRNA-155 (SEQ ID NO:2)模擬物/抑制劑均購買于美國ABI公司，用于體內動物實驗的agomir-155 (SEQ ID NO:3)購買于廣州銳博生物技術有限公司，均為商業化產品。1、miR-155模擬物/抑制劑轉染后，用oxLDL刺激48小時，Real-time PCR及 Northern blot檢測各組細胞相應miR-155表達改變的效果，
分組如下空白對照組、單獨oxLDL刺激組、轉染模擬物陰性對照組，轉染抑制劑陰性對照組，轉染miR-155模擬物組，轉染miR-155抑制劑組； 2、ELISA檢測炎癥因子變化TNF- α、11-6分泌(表1) 表1 miRNA-155對THP-I細胞炎癥因子分泌影響
IL-6(ng/ml)TNF-α (ng/L)空白對照1. 04±0. 0670. 6 ±5. 06模擬物對照0. 93±0. 5275. 3±4. 06miR-155模擬物0. 56±0. 04**34. 34 ±1. 32**抑制劑對照0. 96±0. 0574. 06 ±0. 88miR-155抑制劑1. 68±0. 12·110. 51±3. 58##
3、檢測MAI3K信號轉導通路的改變實驗分組(同上)。Westernblot檢測炎癥通路中信號分子P38，JNK，ERK蛋白水平(參見圖1)。
實施例2 miR -155在動脈粥樣硬化模型動物水平治療潛力研究 1、實驗動物(雄性ApoE-/-小鼠，12周齡)的分組及agomir/antagomir-155干預 1. 1膽固醇修飾的agomir/antagomir-155轉染效率的篩選 1)鑒定agomir/antagomir-155體外對細胞的轉染效率
將Cy3標記的膽固醇修飾的而RNA類似參照物與DC細胞共培養，設置濃度梯度為 IOOnmol, 200nmol和400nmol，熒光顯微鏡觀察膽固醇修飾的miRNA陰性對照在沒有轉染輔
4助試劑的情況下的入胞效率；
2)鑒定agomir/antagomir在體對目的組織的轉染效率
將Cy5標記的膽固醇修飾的而RNA類似參照物用納米脂質體包裹，設置注射劑量為 2. 5nmol,5nmol, IOnmol, 15nmol,隔天注射，一周后做目的血管免疫組化切片，熒光顯微鏡觀察膽固醇修飾miRNA陰性對照轉染效率，篩選出轉染效率最高的濃度組。1. 2 agomir -155靜脈注射ApoE小鼠體內 實驗分組
空白對照組注射PBS， 陰性對照組注射agomir-neg，
Agomir處理組注射Agomir最佳濃度，隔天注射，連續一周。2、AS病理進程及相關全身炎癥指標檢測一周后處死小鼠，常規取材，行斑塊面積(穩定斑塊和不穩定斑塊)，纖維帽厚度檢測，脂質核心面積大小測量。同時按照常規生化檢測要求取血并準備各組小鼠血漿樣本，應用全自動生化分析儀測定血脂等相關指標檢測。3、斑塊局部指標檢測小鼠干預1周后，取心臟到主動脈根部標本，取2 - 3cm，進行石蠟切片，切片進行蘇木精染色和免疫組化研究，測定斑塊局部炎癥因子VCAM1，ICAM1, IL-10, 1L-6, TNF-a, MCP1，斑塊平滑肌含量指標SMC α-actin、免疫炎癥細胞浸潤指標 ⑶3，⑶4，⑶68，MAC-2分泌，顯微鏡下拍照留樣，圖片經Image Pro Plus圖像分析軟件分析結果。4、小鼠炎癥因子變化藥物治療一周后，熒光定量PCR分別觀察小鼠血管組織，血漿和骨髓來源的單個核細胞炎癥因子TNF-a和IL-6的變化(參見圖2，3)，同時用ELISA試劑盒檢測其相應的蛋白水平變化(參見圖4，5)。
實施例3 生物信息學預測，基因表達譜篩選miR -155炎癥相關的作用靶點，證明其在細胞內對應的mRNA靶序列，并探討其作用機制。1、根據miR-155靶點預測數據庫及其法則，推測出相應miRNA可能的mRNA靶序列。2、用特異miR-155模擬物/抑制劑作用細胞，進行基因表達譜芯片篩選其改變的 mRNA
實驗分組空白對照組，miR-155模擬物處理組，miR-155抑制劑處理組；轉染細胞 24-48小時后，提取RNA，用mRNA表達譜芯片篩選經過miRNA作用后細胞mRNA水平發生的變化。3、結合生物信息學數據和表達譜芯片數據以及AS免疫炎癥反應病理過程，挑選出最有可能是miR-155靶基因的mRNA— MAPIIO。4、構建miR-155的靶mRNA —MAP3K10的3，端非翻譯區(3，-UTR)的熒光報告載體MAPIlO的3，-UTR片段被克隆入含有螢火蟲熒光素酶表達的pMIR-REPORT vector (Ambion)，記為CMV-靶mRNA_UTR。根據熒光素的表達來判定其靶mRNA的表達強弱。5、將miR-155模擬物/抑制劑和熒光報告載體CMV-靶mRNA_UTR共轉染細胞，觀察細胞熒光表達來判定miR-155相應的mRNA靶序列。
權利要求
1.一種微小分子RNA-155在制備抗動脈粥樣硬化炎癥藥物中的應用，所述miRNA-155 的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示UUAAUGCUAAUC⑶GAUAGGGGU。
2.根據權利要求1所述的一種微小分子RNA-155在制備抗動脈粥樣硬化炎癥藥物中的應用，其特征在于，所制備的藥物還含有其他治療動脈粥樣硬化炎癥的藥物。
3.根據權利要求1或2所述的一種微小分子RNA-155在制備抗動脈粥樣硬化炎癥藥物中的應用，其特征在于，所述藥物的制劑形式為液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。
4.根據權利要求3所述的一種微小分子RNA-155在制備抗動脈粥樣硬化炎癥藥物中的應用，其特征在于，所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發明提供一種miRNA-155在制備抗動脈粥樣硬化炎癥藥物中的應用。本發明通過實驗證明，無論在體外細胞水平還是體內動脈粥樣模型小鼠水平，都證實了miRNA-155對動脈粥樣硬化炎癥具有明顯的抑制作用，由于miRNA-155是位于基因上游的調控分子，并且同時有多種生物學功能，因此miRNA-155很有可能成為動脈粥樣硬化治療的全新靶點。本發明的藥物能有效的防治核酸在生物體內降解，并能高效的作用目的組織，所述藥物還可以與目前已知的其他治療動脈粥樣硬化炎癥的藥物如他汀類調脂藥等制成復方制劑。
文檔編號A61K9/10GK102188441SQ20111011851
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月9日 優先權日2011年5月9日
發明者嚴卉, 朱建華, 楊林, 鄭筱葉, 陳婷 申請人:浙江大學