專利名稱：一種提高cik細胞增殖速率的中藥提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥技術領域，具體的說是涉及能提高CIK細胞增殖速率的中藥提取物的配方及其制備方法和應用。
背景技術：
腫瘤生物治療是當今腫瘤研究領域的一大熱點，腫瘤生物治療包括細胞因子、基因治療、單克隆抗體、腫瘤疫苗和過繼性免疫治療等方法，其中腫瘤細胞過繼性免疫治療在腫瘤生物治療中占據著重要地位。細胞過繼免疫治療是目前研究較多并已進入臨床試驗的生物治療方法。它是將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，殺滅患者體內的腫瘤細胞；適合細胞免疫功能低下的患者，如大劑量化療、放療后、骨髓移植后、病毒感染損 傷免疫細胞數量及功能的患者。腫瘤過繼性免疫治療中的一個關鍵問題是尋找合適的腫瘤殺傷細胞，自上世紀80年代以來，包括LAK、TIL、⑶3AK、CTL等細胞已先后應用于臨床，但由于存在著擴增倍速較低、細胞來源困難、細胞毒力不高等諸多問題，該療法在臨床應用上受到一定限制。細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine-Induced Killer cell) CIK的出現,為腫瘤過繼性免疫治療帶來了新的希望。CIK細胞是由美國斯坦福大學的Schmidt Wolf等于1991年率先發現的，他們將人外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得了一群異質細胞，該細胞共同表達了 CD3和CD56兩種膜蛋白分子，是目前所知殺傷活性最強的一種腫瘤生物治療效應細胞，該細胞兼具T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤等優點，又稱為NK樣T淋巴細胞(NKT細胞)，被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。該療法既可單獨使用，也可以作為手術、化療和放療后的有力輔助手段，效果顯著。結合手術切除、介入、射頻、氬氦刀等治療，可清除不能用手術切除的極微小瘤灶或是體內散存的瘤細胞，在延緩或阻止腫瘤的轉移或復發方面有重要作用；對于部分暫時不適宜做手術、介入或其它治療的腫瘤患者，也可以先進行CIK細胞治療，提高身體機能狀況，改善生活質量，爭取其它治療機會。由此可見，CIK細胞的體外大量增殖，即進一步提高其體外增殖速率，是大規模使用CIK細胞免疫治療的關鍵所在。中醫藥制劑是我們中華民族對世界醫學的一大貢獻，大量的科學研究表明中醫藥不僅能發揮抗腫瘤治療的靶點作用，而且還有調整免疫，改善造血功能，誘導腫瘤細胞凋亡、促進分化，抑制RNA、DNA合成，逆轉多藥耐藥，影響細胞通訊等作用。中醫藥如扶正中藥，尤其是補氣助陽藥，可激活機體免疫細胞活性，使之吞噬功能增強，同時提高機體免疫功能，加強化療效果。本發明的目的是通過一些免疫增強功能的中醫藥制劑對CIK細胞的誘導和調節能力進行研究，利用CIK細胞免疫治療在腫瘤治療中的強大優勢，充分發揮中醫藥輔助誘導細胞免疫治療的長處，即促進免疫細胞的大量增殖，從而間接改善腫瘤患者的生活質量，延長生存期。
發明內容
利用傳統中醫藥可以有機地結合CIK細胞免疫治療在腫瘤治療中的強大優勢，針對一些免疫增強功能的中醫藥制劑對免疫細胞有誘導增殖作用，從而間接改善腫瘤患者的生活質量，延長生存期。本發明目的在于提供一種提高CIK細胞增殖速率的中藥提取物及其制備方法。本發明提供了一種提高CIK細胞增殖速率的中藥提取物，所述中藥提取物由下列重量配比的原料藥所制成紅參5 15g、麥冬5 15g、黃芪15 30g。本發明還提供了一種制備該中藥提取物的方法，包括以下步驟
1)將3味原料藥加水煎煮，過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液I;
2)取提取液I精制
取上述提取液I用乙醇沉淀，過濾，回收乙醇，得精制提取液II ;
3)精制的提取液II純化
將精制提取液II經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，經0. 45 u m微孔濾膜濾過，濾液濃縮至5g生藥/ ml，活性炭煮沸吸附熱源，除炭，調PH值，又經0. 22 y m微孔濾膜濾過除菌，分裝，即得本發明的中藥提取物。本發明所述的中藥提取物在提高CIK細胞增殖速率中的應用。本發明的有益效果是(I)本發明所述的中藥提取物(SMH)與其他化學誘導增殖因子相比，符合細胞培養要求，即對人體無毒副作用，故誘導增殖后的CIK細胞直接可以用于臨床試驗。(2)與相應的中藥刺激因子相比，本發明所述的中藥提取物(SMH)處方精練，劑型先進，該中藥提取液功效提高，成分明確，質量可控。(3)本發明所述的中藥提取物(SMH)具有明顯提高CIK細胞增殖速率的作用，激活后的細胞殺傷療效高于以前的無中藥提取物(SMH)的CIK細胞治療，會產生較好的社會效益和經濟效益。
圖I不同處理對CIK細胞增殖的影響。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細的說明。這些具體的實施例僅僅是在不違背本發明精神下的有限列舉，并不排除本領域的一般技術人員把現有技術和本發明結合而產生的其他具體的實施方案。本發明是通過以下的技術方案來實現的
I、主要材料的準備。一種對CIK細胞增殖速率有明顯提高作用的中藥提取物(簡稱SMH)，其特征在于該提取物由下列重量配比的原料藥所制成紅參5 15g、麥冬5 15g、黃芪15 30g。2、所述中藥提取物的方法，其特征在于其方法步驟如下
1)將3味原料藥加水煎煮，過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液I;
2)取提取液I精制
取上述提取液I用乙醇沉淀，過濾，回收乙醇，得精制提取液II ；3)精制的提取液II純化
將精制提取液II經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，經0. 45 u m微孔濾膜濾過，濾液濃縮至5g生藥/ ml，活性炭煮沸吸附熱源，除炭，調PH值，又經0. 22 y m微孔濾膜濾過除菌，分裝，即得本發明的中藥提取物。上述步驟I)中加水的水量為藥材量的10-15倍，煎煮0. 5-1. 0小時，過濾收集提取液濃縮至0. 5g生藥/ ml。上述步驟2)中用與提取液I等量的80%乙醇沉淀一次。上述步驟3)中用10 40%的乙醇洗脫,收集洗脫液濃縮至5g生藥/ mlo上述的中藥提取物在提高CIK細胞增殖速率的應用。實施例I 一種制備中藥提取物(SMH)的配方及制備方法
取紅參5g、麥冬5g、黃芪15g。加熱純化水煎煮提取，加水量為10倍；煎煮時間為0. 5小時。過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液I ;將上述提取液I用乙醇沉淀，過濾，回收乙醇至無醇味，得精制提取液II ;將精制提取液II經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，經0. 45 y m微孔濾膜濾過，濾液濃縮至5g生藥/ ml，活性炭煮沸吸附熱源，除炭，調PH值，又經0. 22 y m微孔濾膜濾過除菌，分裝，制成SMH中藥提取物。實施例2另一種制備中藥提取物(SMH)的配方及制備方法
取紅參15g、麥冬15g、黃芪30g。加熱純化水煎煮提取，加水量分別為15倍；煎煮時間分別為I小時。過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液；將上述提取液經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，經0. 45 y m微孔濾膜濾過，濾液濃縮至5g生藥/ ml，活性炭煮沸吸附熱源，除炭，調pH值，又經0. 22 u m微孔濾膜濾過除菌，分裝，制成SMH中藥提取物。實施例3加入中藥提取物(SMH)的CIK細胞培養和常規的CIK細胞培養在誘導增殖及增殖后的細胞對腫瘤細胞的殺傷力的對比實驗
(I)中藥提取物(SMH)和各細胞因子共同刺激培養
含有抗凝劑的真空采血管采集靜脈血30 mL，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)，洗滌2次，再用RPMI 1640完全培養液(內含滅活的10 %自體血漿、25 mmol/LHEPESU00 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)重懸細胞，調整細胞濃度為2 X107ml。細胞均分為2組，I組按常規CIK細胞培養方法，即第0天加入IFN-Y (I 000 U/ml)，入CO2培養箱孵育24小時后再加入IL-2 (300 U/ml)、抗⑶3單抗(25 ng/ml)繼續培養。另I組于第0天加入SMH (1%、3%、5%、7%、9%)，24小時后按常規CIK細胞培養方法繼續培養。每3-4天根據細胞濃度添加新鮮RPMI 1640完全培養液，并補加rhIL-2至300 U/ml。至第14天收集細胞進行有關檢測。(2)腫瘤細胞的分離獲得
手術切除的新鮮腫瘤組織剪成細小塊，超聲波打碎，加入RPMI 1640，經60目鋼篩過濾，腫瘤細胞通過鋼篩，收集細胞，用0. 15M磷酸緩沖液(PH 7. 2)沖洗三次，檢測活細胞數目。(3)細胞的增殖、殺傷和表型檢測結果
采用臺盼藍拒染法計數細胞，檢測細胞的增殖水平；MTT法檢測CIK細胞的體外細胞毒活性。上述共同刺激培養激活的細胞于第2天開始數目增多，到14天最高擴增倍數達610±20倍(如圖I所示)。第14天的擴增倍數檢測結果顯示，含5%中藥提取物(SMH)的培養基中細胞絕對數比無中藥提取物SMH (CIK cell group)高2. 8倍。分別對1%、3%、5%中藥提取物(SMH)誘導增殖后的細胞進行腫瘤細胞的殺傷率的檢測，結果發現這三個處理對腫瘤細胞的殺傷率均達到97%以上，對NK敏感的K562細胞殺傷率也達80%以上。這些結 果指標均略高于無中藥提取物SMH(CK)，但無顯著性差異(P〈0. 05)。在進行檢測之前，每次均在培養過程中取少量CIK細胞做流式細胞儀檢測。達到標準(⑶3+⑶56+細胞數> 50%,⑶3+⑶8+ ^ 30%)后，再收集細胞進行相關檢測。
權利要求
1.一種提高CIK細胞增殖速率的中藥提取物，其特征在于該提取物由下列重量配比的原料藥所制成紅參5 15g、麥冬5 15g、黃芪15 30g。
2.一種制備權利要求I所述中藥提取物的方法，其特征在于其方法步驟如下 1)將3味原料藥加水煎煮，過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液I; 2)取提取液I精制 取上述提取液I用乙醇沉淀，過濾，回收乙醇，得精制提取液II ； 3)精制的提取液II純化 將精制提取液II經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，經0. 45 u m微孔濾膜濾過，濾液濃縮至5g生藥/ ml，活性炭煮沸吸附熱源，除炭，調PH值，又經0. 22 y m微孔濾膜濾過除菌，分裝，即得本發明的中藥提取物。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟I)中加水的水量為藥材量的10-15倍，煎煮0. 5-1. 0小時，過濾收集提取液濃縮至0. 5g生藥/ ml。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟2)中用與提取液I等量的80%乙醇沉淀一次。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟3)中用10 40%的乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至5g生藥/ ml。
6.根據權利要求I所述的中藥提取物在提高CIK細胞增殖速率的應用。
全文摘要
本發明涉及一種對CIK細胞增殖速率有明顯提高作用的中藥提取物，它是由原料藥紅參、麥冬、黃芪按一定重量配比制成。所述配方制備包括以下步驟紅參、麥冬、黃芪加水煎煮，乙醇沉淀一次，過濾，回收乙醇，經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經微孔濾膜濾過，濾液濃縮，調pH值，又經微孔濾膜濾過除菌，分裝，即得中藥提取物。經藥效學試驗結果表明該中藥提取物對CIK細胞的增殖速率有顯著的提高作用。
文檔編號A61P35/00GK102755512SQ20111010815
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月28日 優先權日2011年4月28日
發明者徐軍, 陳春 申請人:徐軍, 陳春