專利名稱：一種用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種shRNA基因試劑，特別是一種抑制caspase-3基因表達的shRNA， 該shRNA基因試劑為一種以慢病毒為載體的抑制caspase-3基因表達的shRNA及相關輔助試劑，用于治療阿爾茨海默病動物模型。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)現象是一種在進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制，是一種序列特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。它已在許多不同種屬的生物體中被發現，并在生物體細胞之間進行傳遞，具有抵抗病毒入侵和維持基因組穩定的作用。RNAi技術不僅能大大推進人類后基因組計劃的發展，還能高通量地篩選藥物靶基因，促進基因治療、新藥開發等，為治療癌癥、 遺傳病等疾病開辟新的途徑。RNAi的研究與應用具有極其重要的理論和實際意義，將對醫學生物學的發展產生深遠的影響。雖然RNA干擾技術的研究歷程較短，但其發展速度卻超乎人們的想象。在過去的幾年時間里，RNAi作為一種新基因療法，被廣泛的應用于病毒感染、癌癥、顯性遺傳病等醫學研究中，開辟了“基因治療(gene-specific therapeutics) ”的新理念，小發卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)甚至被稱為“治病藥物”。目前，人們已經開始利用RNAi技術從基因組水平分析哺乳動物體內基因的功能，可以更迅速地鑒定出許多與疾病相關的基因，使我們可以更好地研究生物體內基因調控的網絡系統。現在RNAi技術已經能夠成功治愈哺乳動物細胞、器官及活體的病變，預示著不久的將來，RNAi會成功用于人類疾病的治療，使得shRNA的“治病藥物”稱號名副其實。公知人體內的細胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關細胞死亡過程的研究，近年來已成為生物學、醫學研究的一個熱點，到目前為此，人們已經知道細胞的死亡起碼有兩種方式，即細胞壞死與細胞凋亡。目前的研究認為，細胞壞死是細胞接受刺激后的一種被動的細胞死亡方式，而細胞凋亡則是一種主動的程序性的細胞死亡方式，它是細胞的一種基本生物學現象，細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2基因家族、caspase基因家族、癌基因等，隨著分子生物學技術的發展，對多種細胞凋亡的過程有了相當的認識，但是迄今為止凋亡過程確切機制尚不完全清楚，而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系，如神經退行性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等。如果能應用RNA干擾技術特異性地阻抑凋亡相關基因的表達及其蛋白質水平，將可以有效沉默凋亡相關基因，幫助細胞減少凋亡，增進細胞活力。 因此，對凋亡相關基因的RNA干擾研究與應用具有極其重要的理論和實際意義，能有效地篩選藥物靶基因，促進基因治療、新藥開發等，為治療神經退行性疾病等與細胞凋亡相關的疾病開辟新的途徑。目前RNAi技術作為一種主要的分子生物學研究手段，被廣泛應用于特異性抑制基因的表達研究。RNAi的作用機制表明雙鏈RNA分子首先被細胞內RNA酶Dicer降解成 21 23個堿基大小的小分子干擾RNA (small interfering RNA, si RNA), si RNA結合一個核酶復合物形成RNA誘導沉默復合物(RNA — induced silencing complex，RISC)，RISC通過堿基配對定位到有同源序列的mRNA上，并在特定位置切割該mRNA，從而抑制該同源基因的表達。siRNA被認為是RNAi的主要效應物。雖然直接轉染合成的siRNA能特異性抑制哺乳動物細胞內同源基因的表達，但是細胞內siRNA很容易被降解，不能實現穩定的RNAi。 屬于RAN聚合酶III類的TO啟動子可轉錄產生小發卡RNA，即轉錄產生一段含有RNA正義鏈、 環(loop)和反義鏈的小發卡RNA。若向細胞中導入TO干擾質粒(由TO啟動子與被干擾基因的發卡樣短片段摸板組成)，則由此介導的RNA干擾可較好地克服以上缺點，質粒載體或病毒載體就能在細胞內長時間、穩定地生成siRNA。但質粒載體轉染哺乳動物細胞的效率不如病毒載體，尤其是無法轉染非分裂相細胞。病毒載體克服了質粒載體不能轉染非分裂相細胞的缺點和不足，并能在哺乳動物各類細胞中穩定表達siRNA，長期抑制基因表達。可以說，病毒載體的出現使RNAi技術經歷了一次歷史性的跨越。常用的病毒載體包括單純皰疹病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體 (adeno-associated virus, AAV)和慢病毒載體。腺病毒是一種無包膜DNA缺陷病毒，屬細小病毒科，是目前世界上動物病毒中最小的病毒，病毒顆粒直徑只有20nm，呈二十面體，正負鏈各半。基因組DNA約有36kb，可編碼14種蛋白，具有2個開放性閱讀框架和反向末端重復序列，在病毒復制中有重要作用，是病毒的重要順式順序。慢病毒是一類反 轉錄病毒的總稱，包括多種靈長類慢病毒和非靈長類慢病毒。慢病毒載體則是一類重組反轉錄病毒載體，由慢病毒經過改造而成，具有更高的生物安全性和外源基因的表達效率。各種慢病毒載體的結構和作用機制基本相同，主要由三種包含不同結構的質粒構成，分別是轉移質粒、輔助質粒、包膜糖蛋白表達質粒。其中，轉移質粒除包含我們感興趣的外源基因外，同時還保留了病毒的LTR區和其他對病毒的整合復制起重要作用的元件。其中LTR區包含了慢病毒的啟動子、增強子、包裝信號、整合位點(attachment site, Att)等結構。包裝序列能夠使識別病毒RNA將其衣殼化并裝配到病毒顆粒中，Att位點使病毒基因可以整合入宿主基因。 同時轉移質粒中還加入了內部啟動子驅動外源基因轉錄。輔助質粒整合進入包裝細胞后表達蛋白多聚體gag，編碼病毒的衣殼蛋白及病毒的其他模序結構(matrix structure)，同時表達蛋白pol，pol蛋白具有反轉錄酶及整合酶的活性，負責對病毒載體基因的結構元件進行切割，促使載體基因整合入宿主細胞基因組中。AAV和慢病毒載體的特點是能作用于非分裂相細胞，而且能與宿主細胞基因組發生整合。但當應用于整體動物時，AAV會被機體內本身存在的AAV抗體識別并發生免疫反應，從而削弱了 AAV轉導基因的效率。慢病毒載體則不存在這樣的問題，與其他反轉錄病毒載體相比，主要具有如下優點首先，慢病毒載體既可以感染分裂相細胞，又可以感染分裂緩慢或非分裂期的細胞，包括造血干細胞、神經干細胞、肝實質細胞等等；其次，由慢病毒載體攜帶整合入宿主基因組的目的基因具有較強的轉錄后基因沉默作用，在體外細胞培養和體內移植實驗中，由慢病毒載體攜帶導人的目的基因可以在宿主細胞中得到長期穩定的表達，免疫反應很小；再次，慢病毒載體可以兼容多個轉錄啟動子，包括細胞特異性啟動子和基因組中普遍存在的管家基因的啟動子，應用組織特異性啟動子和增強子來驅動慢病毒載體中的外源基因能夠使其在特定的組織細胞中表達，為慢病毒載體介導的基因靶向治療提供理論基礎；最后，慢病毒載體經過改建后可以容納約IOkb左右的大片段外源基因，因此大多數的cDNA都能被克隆入慢病毒載體。慢病毒載體的上述優點使其成為體內和體外基因轉移的一 種有效工具。使用RNAi治療疾病的思路是根據病原體的致病基因序列以及生物體內與疾病發生相關的基因序列，設計和制備與這些基因序列具有同源性的siRNA，轉錄產生一段含有 RNA正義鏈、環(loop)和反義鏈的shRNA。向細胞中導入U6干擾質粒形成shRNA，然后通過某種方式將shRNA轉移到動物體內使有關疾病基因發生沉默，從而達到治療的目的。其優勢在于只抑制疾病相關蛋白的表達，而不損傷正常細胞功能，其序列特異性及基因抑制作用的強大性是其他藥物難以匹敵的。shRNA可用于治療任何由于基因發生突變或過度表達所引起的疾病，只要確定了與疾病相關的靶點，即靶基因，就可以通過shRNA特異性地使靶基因保持沉默。所以，尋找最適宜的shRNA，對于RNA干擾的廣泛應用至關重要。caspase基因家族是一類基因結構相似并參與細胞凋亡的基因。根據它們對細胞凋亡結果的不同分為兩類，一類是抑制細胞凋亡的基因，另一類是促進細胞凋亡基因，其中 caspase-3基因是促進細胞凋亡的基因，其過度表達能夠加速與該凋亡基因相關的疾病細胞凋亡，因此對caspase-3 RNAi的研究與應用具有極其重要的理論和實際意義。進一步研究表明，caspase-3不僅是起著凋亡的效應器作用，還能直接與阿爾茨海默病、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈病、脊椎小腦失調等疾病的致病蛋白質分子相互作用，參與致病機制。因此， 高效、高選擇性的caspase-3抑制劑可以為神經退行性疾病的治療提供新途徑。由于阿爾茨海默病的發病機制尚不完全明確，治療上也缺乏主動有效的干預手段，因此基因治療已成為治療包括阿爾茨海默病在內的神經退行性疾病的研究靶點。基因治療的關鍵技術之一是有效的siRNA序列設計和篩選。靶基因不同位點的siRNA作用效果差異很大，可能與siRNA的堿基分布、兩端自由能大小等有關。關鍵技術之二是怎樣將目的基因轉入靶細胞并持續表達，這就需要選擇有效安全的基因轉染載體。目前基因轉染載體主要分為非病毒載體和病毒載體，在眾多的轉染載體中，只有慢病毒載體能高效感染分裂期和非分裂期細胞，并把基因整合到靶細胞，實現基因的長期穩定表達。多數實驗證明，慢病毒載體在體內應用免疫反應小，安全性較好，因此慢病毒載體是當前基因治療載體研究的熱點。用慢病毒載體介導caspase-3基因RNAi的體內外研究，顯示了該技術策略在內源性基因功能研究和基因治療前沿領域的重大意義。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有技術中還沒有適宜的治療阿爾茨海默病的shRNA 基因試劑的問題，提供一種用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒。本發明提供的用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒是一種以慢病毒為載體的能有效抑制神經細胞caspase-3基因表達的shRNA藥物。本發明所提供的試劑盒中包括有特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體濃縮液200μ ，陰性對照的shRNA慢病毒表達質粒載體濃縮液200μ 。其中，所述的特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體由抑制 caspase-3基因表達的siRNA構建，抑制caspase-3基因表達的siRNA由21個核苷酸組成， 其序列為5’-GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3’。該基因序列的方向從左至右為5’端至3’端， 自5’端的第1至第19位核苷酸為核糖核苷酸，第20至第21位核苷酸為脫氧核糖核苷酸。所述特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體的構建方法是設計上述特異性抑制caspase-3 siRNA序列，合成針對caspase-3基因的shRNA序列，其序列為
正義鏈5' -TGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATTCAAGAGATTCGGCTTTCCAGTCAGAC TCTTTTTTC-3，；
反義鏈5' -TCGAGAAAAAAGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATCTCTTGAATTCGGCTTT CCAGTCAGACTCA-3'；
退火形成兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA，與經I和損ο I雙酶切回收的 pFU-GW-RNAi載體連接，以連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，培養，對克隆產物進行PCR鑒定、DNA測序，鑒定陽性克隆即為構建成功的特異性抑制caspase-3基因的shRNA 慢病毒表達質粒載體，用包裝質粒PGC-LV載體、pHelper 1. O載體和pHelper 2. O載體共轉染293T細胞，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。本發明所提供的以慢病毒為載體的caspase-3 shRNA試劑盒可用于阿爾茨海默病動物模型的基因治療。該shRNA序列或由此得到的試劑通過某種方式進入到動物模型體內時，可以比以往任何手段更高效、特異、方便的抑制疾病相關蛋白的表達，使有關疾病基因發生沉默，從而達到治療的目的，其優勢在于不損傷正常細胞功能，其序列特異性及基因抑制作用的強大性是其他藥物難以匹敵的。本發明針對caspase-3基因序列設計合成出的shRNA，經QRT-PCR及免疫組織化學法檢測，可以有效抑制caspase-3基因表達，從而顯著降低神經細胞的凋亡和壞死，并在原代培養神經細胞上驗證了設計合成并篩選出的以病毒為載體的caspase-3 shRNA對神經細胞凋亡的抑制作用。本發明所提供的caspase-3 shRNA試劑盒不但可以用于阿爾茨海默病動物模型的基因治療，也可以用于體外培養細胞的RNAi實驗，或者用于體內實驗。對動物腦神經細胞損傷和原代培養神經細胞損傷的抑制作用，可以降低損傷神經細胞的凋亡、壞死率、改善動物腦神經細胞的學習記憶功能損傷和降低阿爾茨海默相關標志蛋白的表達。
圖1為pGCsiL-GFP質粒載體圖譜。圖2為pFU-GW-RNAi質粒載體圖譜。圖3為酶切電泳圖譜。圖4為瓊脂糖凝膠電泳圖片。圖5為pGC-LV載體圖譜。圖6為pHelper 1. 0載體圖譜。圖7為pHelper 2. 0載體圖譜。圖8為各組c-caspase-3蛋白表達情況。
具體實施例方式實施例1 特異性shRNA序列的設計合成。根據caspase-3基因序列(NM_009810)，應用Ambion公司的RNA干擾設計軟件，設計caspase-3基因特異性siRNA序列為正義鏈5，-GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3， 反義鏈5，-TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC-3，。并通過BLAST同源性分析，排除了非特異性抑制其他基因序列的可能。caspase-3 siRNA及其陰性對照的序列為
權利要求
1.一種用于治療阿爾茨海默病動物模型的ShRNA試劑盒，其特征是所述的試劑盒中包括有特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體濃縮液和陰性對照的shRNA 慢病毒表達質粒載體濃縮液。
2.根據權利要求1所述的用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒，其特征是所述的特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體中，shRNA的序列為正義鏈5' -TGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATTCAAGAGATTCGGCTTTCCAGTCAGAC TCTTTTTTC-3，；反義鏈5' -TCGAGAAAAAAGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATCTCTTGAATTCGGCTTT CCAGTCAGACTCA-3’。
3.根據權利要求2所述的用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒，其特征是所述的特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體由抑制caspase-3基因表達的siRNA構建，該抑制caspase-3基因表達的siRNA的序列為5’ -GAGTCTGACTGGAAAGC CGAA-3，。
4.根據權利要求2所述的用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒，其特征是所述的特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體采用以下方法構建設計序列為5，-GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3，的siRNA序列，合成所述針對caspase-3基因的 shRNA序列，退火形成兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA，與黽Hpa I和損ο I雙酶切回收的 pFU-GW-RNAi載體連接，以連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，培養，對克隆產物進行PCR鑒定、DNA測序，鑒定陽性克隆即為構建成功的特異性抑制caspase-3基因的shRNA 慢病毒表達質粒載體，用包裝質粒PGC-LV載體、pHelper 1. O載體和pHelper 2. O載體共轉染293T細胞，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。
全文摘要
一種用于治療阿爾茨海默病動物模型的shRNA試劑盒，試劑盒中包括有特異性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表達質粒載體濃縮液和陰性對照的shRNA慢病毒表達質粒載體濃縮液，其中的shRNA具有序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列。該shRNA序列或由此得到的試劑通過某種方式進入到動物模型體內時，可以比以往任何手段更高效、特異、方便的抑制疾病相關蛋白的表達，使有關疾病基因發生沉默，從而達到治療的目的，因此，本發明的試劑盒可用于阿爾茨海默病動物模型的基因治療。
文檔編號A61K49/00GK102218146SQ201110107038
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者張勤麗, 教霞, 李娜, 李美琴, 牛僑 申請人:山西醫科大學