專利名稱：一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，本發明方法制備的產品具有直接抑制腫瘤細胞生長和增殖的作用，亦可提高機體免疫力，可作為一種輔助治療腫瘤的藥品或保健品。
背景技術：
自上世紀六十年代，真菌多糖作為抗腫瘤的廣譜免疫促進劑引起了人們極大的興趣。大量藥理和臨床研究表明，真菌多糖類化合物具有復雜的多方面生物活性與功能，對正常的細胞沒有毒副作用，真菌多糖主要通過影響網狀內皮系統、巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞以及蛋白質的合成、抗體生成及干擾素的誘生作用來提高機體免疫功能，增強抗病能力。多糖作為免疫促進劑，可與細胞毒性抗癌藥物如氟尿嘧啶(5-FU)、環磷酰胺(CIX)合用，減輕因化療所致的免疫功能低下，增強細胞毒抗癌藥物的抗腫瘤活性(袁建國，程顯好，侯永勤.冬蟲夏草多糖組份研究及藥理試驗[J].山東食品發酵，2004,4:52-55;林新堅，鄭永標，陳濟琛等.冬蟲夏草粗多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞產生TNF-α的作用[J]. 微生物學雜志，2004，24 (3) 22-23 ；Zhang W, Yang J, Chen J, et al. Immunomodulatory and antitumor effects of exopolysaccharide fraction (EPSF) from a cultivated Cordyceps sinensis fungus on tumor-bearing mice. Biotechnol Appl Biochem,2004, 15(12) :256-259 ；Zhou GF,Hua X,Sheng WX. In vivo growth-inhibition of S180 tumor by mixture of 5-Fu and low molecular—carrageenan from Chondrus ocellatus. Pharmacological research. 2005,51 :153-157)。國內外很多研究表明，蟲草多糖具有抗腫瘤活性，大多數抗腫瘤作用是非直接殺傷癌細胞，即通過刺激人體非特異性防御機能，在癌癥病人經放療、化療機體免疫力受損的情況下，與放療、化療配合治療可達到治愈疾病的目的(吳慶光，趙珍東，王宗偉.冬蟲夏草抗腫瘤作用研究進展[J].中醫藥導報.2005，11 (6) :80-82) 0桑黃是寄生于桑樹等闊葉樹的一種藥用真菌，具有獨特的抗癌等功效，已引起國內外醫藥界與保健品行業不少專家的關注。其抑制腫瘤的研究主要集中在桑黃多糖方面，作用機制是通過細胞調節和體液免疫來提高機體的免疫力，進而達到抑制腫瘤細胞生長和轉移的目的(沈業壽，鄭立軍，王正亮.桑黃胞內多糖抗腫瘤效應的實驗研究[J].癌變畸變突變，2007，19 ) :305-308)。由于國內外市場對蟲草、桑黃的需求量越來越大，致使國內各產地藥農掠奪性采集，子實體孢子無法大量形成，結果造成野生蟲草、桑黃資源在我國已難覓蹤影，即將枯竭。 近年來大量的科研工作者對蟲草、桑黃的人工栽培、液體發酵技術等方面開展了廣泛的研究，但人工栽培、液體發酵產生的蟲草、桑黃子實體和菌絲體多糖抗腫瘤等活性有待進一步研究。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，通過兩類多糖相互協同作用，增強其抗腫瘤活性。體外活性實驗表明，本發明產品對人源性結腸癌細胞 HT-29、人源性肺癌細胞A549、人源性肝癌細胞H印G2的增殖有顯著的抑制作用，且顯著高于單一來源多糖的抑制效果，可作為一種輔助治療腫瘤的藥品或保健品。為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，依次包括以下步驟A.將人工培養蟲草子實體用70°C -90°C烘干，粉碎成20-80目，蒸餾水 90°C-100°C提取4-8h，過濾后濾液用濃度70%-80(%的乙醇沉淀，8000-12000印111離心收集沉淀，復溶于水；B.將步驟A的產物用分子量10000道爾頓的超濾膜高壓過濾，得到透明液體用烘干或冷凍干燥后粉碎得到蟲草子實體多糖；C.在步驟A進行的同時，將液體發酵培養桑黃菌絲體用70°C -90°C烘干，粉碎成20-80目，蒸餾水90°C -100°C提取4-他，過濾后濾液用濃度70% -80%的乙醇沉淀， 8000-12000rpm離心收集沉淀，復溶于水；D.將步驟C的產物用分子量10000道爾頓的超濾膜高壓過濾，得到透明液體用烘干或冷凍干燥后粉碎得到桑黃菌絲體多糖；E.將步驟B中得到的蟲草子實體多糖和步驟D中得到的桑黃菌絲體多糖按 1 0.5 1 3的比例混合均勻后，通過壓片機壓片。優選的，步驟A中蟲草子實體的烘干溫度為80°C，粉碎度為40目，蒸餾水提取溫度 95°C，提取時間為他，濾液用于沉淀的乙醇終濃度為75%;能夠得到最佳質量的蟲草子實體多糖。優選的，步驟C中桑黃菌絲體的烘干溫度為80°C，粉碎度為40目，蒸餾水提取溫度 95°C，提取時間為他，濾液用于沉淀的乙醇終濃度為75%;能夠得到最佳質量的桑黃菌絲體多糖。優選的，步驟E中蟲草子實體多糖與桑黃菌絲體多糖按1 1的比例混合均勻；最佳的混個比例，對人源性結腸癌細胞HT-29、人源性肺癌細胞A549、人源性肝癌細胞H印G2 生長具有顯著抑制作用。與現有技術相比，本發明的優點是現有的研究發現人工培養的蟲草、桑黃子實體和菌絲體多糖具有一定的抗腫瘤活性，但其抗腫瘤效果尚不理想，本發明通過多種腫瘤細胞抑制實驗，篩選出對人源性結腸癌細胞HT-29、人源性肺癌細胞A549、人源性肝癌細胞 HepG2生長具有顯著抑制作用的多糖，通過復配后，利用兩類多糖相互協同作用，可增強其抗腫瘤活性。本發明工藝簡單、所建立的提取方法專業性強、重復性好，且使用醫用酒精提取，不僅環保，同時產品安全可靠，適宜于工業化生產。
圖1為不同多糖對人源性結腸癌細胞HT-四增殖的抑制作用對比圖；圖2為不同多糖組合對人源性結腸癌細胞HT-四增殖的抑制作用對比圖；圖3為不同多糖對人源性肝癌細胞！tepG2增殖的抑制作用對比圖；圖4為不同多糖組合對人源性肝癌細胞!fepG2增殖的抑制作用對比圖；圖5為不同多糖對人源性肺癌細胞A549增殖的抑制作用對比圖6為不同多糖組分對人源性肺癌細胞A549增殖的抑制作用對比圖。
具體實施例方式(1)人工培養的蟲草子實體可以到各大中藥店購買。(2)液體發酵培養的桑黃菌絲體桑黃菌絲體培養方法參考本研究室前期的發明專利“一種高效液體培養桑黃菌絲體的培養基及培養方法(申請號201010255665. 9)”。具體為發酵培養基1L，其各組分的濃度(g/L)為麥芽糖30g，酵母粉20g，MgS04 1. 0g, KH2PO4 1. 0g，檸檬酸三銨1. 0g，維生素Bfrng、維生素B2 4mg、維生素B6 0. 52mg、煙酰胺^mg、泛酸鈣2. 6mg,桑枝水提物5g。將培養基分裝到50mL搖瓶中，裝液量為裝30mL，培養基滅菌溫度121°C，滅菌時間30min ；菌絲體培養將購買的桑黃菌種培養時間5d，接種量15% (V/V)，培養溫度27°C， 搖瓶裝液量60%，往復式搖床轉速120rpm，發酵時間為7d。每24h取樣，8000rpm離心 lOmin，用蒸餾水洗滌菌絲體3次，_50°C真空冷凍干燥至恒重，即得桑黃菌絲體。(3) 一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，依次包括以下步驟A.將人工培養蟲草子實體用80°C烘干，粉碎成40目，蒸餾水95°C提取他，過濾后濾液用濃度75%的乙醇沉淀，8000-12000rpm離心收集沉淀，復溶于水；B.將步驟A的產物用分子量10000道爾頓的超濾膜高壓過濾，得到透明液體用烘干或冷凍干燥后粉碎得到蟲草子實體多糖；C.在步驟A進行的同時，將液體發酵培養桑黃菌絲體用80°C烘干，粉碎成40目， 蒸餾水95°C提取6h，過濾后濾液用濃度75%的乙醇沉淀，8000-12000rpm離心收集沉淀，復溶于水；D.將步驟C的產物用分子量10000道爾頓的超濾膜高壓過濾，得到透明液體用烘干或冷凍干燥后粉碎得到桑黃菌絲體多糖；E.將步驟B中得到的蟲草子實體多糖和步驟D中得到的桑黃菌絲體多糖按1 1 的比例混合均勻后，通過壓片機壓片。采用上述工藝生產的原料粉通過壓片機壓片，每片重0.5克。以下是體外腫瘤細胞抑制實驗，利用多種腫瘤細胞，通過多種多糖組合篩選出抗腫瘤活性較強的本發明產品。1.實驗目的通過MTT法測定人工培養的蟲草子實體、蟲草菌絲體、桑黃子實體、桑黃菌絲體提取的多糖以及不同多糖組合物對人源性結腸癌細胞HT-29、人源性肺癌細胞A549、人源性肝癌細胞H印G2生長的抑制作用。2.材料與儀器2. 1儀器設備細胞培養箱，Forma 3111型，Thermo公司；超凈工作臺，蘇州馮氏實驗動物設備有限公司；酶標儀，BIO-RAD 680 ；離心機Sorvall Legend Mach 1. 6R，Thermo公司；蔡氏熒光倒置顯微鏡；YS2-H光學顯微鏡，日本NiKon公司；電子天平，酸度計等。2. 2主要試劑2. 2. IRPMI 1640、胰蛋白酶美國 GIBCO 公司；2. 2. 2 噻唑藍(3- ，5-dimethylthliazol-2-yl)-2，5-dipenyl tetrazoliumbromide, MTT)；2. 2. 3新生牛血清(無菌、無支原體、無嗜菌體)，杭州四季青生物工程有限公司；2. 2. 4臺盼藍(trypan blue)上海化學試劑總廠。2. 3細胞株2. 3. 1腫瘤細胞株人源性結腸癌細胞HT-29、人源性肺癌細胞A549、人源性肝癌細胞!fepG2均購于中科院上海細胞生物所；2. 3. 2細胞培養與細胞懸液制備用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100 μ g/ ml鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37°C、5%C02飽和濕度的培養箱中傳代培養。取對數生長期細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養液配成單個細胞懸液，以臺盼藍拒染法計數后，將細胞懸液稀釋成實驗所需的濃度。2. 4受試藥物人工培養的蟲草子實體、蟲草菌絲體、桑黃子實體、桑黃菌絲體提取的多糖以及不同多糖組合物，褐色片狀，批號100319。配制方法各樣品稱取80mg，以5ml非完全培養液超聲溶解，調整PH至7. 2，針式濾器過濾，制成16mg/ml的母液。臨用前取1. 2ml該母液， 加4. 8ml非完全培養液制成3. 2mg/ml的高濃度藥物稀釋液，依次倍比稀釋為1. 6,0. 8,0. 4、 0. 2mg/ml的藥物稀釋液。3.實驗方法分別取對數生長期的人源性結腸癌細胞HT-29、人源性肺癌細胞A549、人源性肝癌細胞H印G2，PBS洗兩遍之后，0. 05%胰蛋白酶消化，以RPMI 1640培養液制成細胞懸液， 分別以IX 105個/ml細胞濃度接種于96孔細胞培養板中，于37°C、5% C02細胞培養箱內孵育M小時，加入不同濃度的供試品稀釋液。繼續培養48小時，各孔加入MTT溶液，再繼
續培養池。酸性DMSO振蕩溶解甲臜結晶，以酶1-測定OD值，按下列公
式計算抑制率(％)。細胞抑制率(％)=( ι- ^I^qpI ) Χ 100%。4.實驗結果由圖1可見，人工培養蟲草子實體多糖在0. 1 0. 8mg/ml劑量時對人源性結腸癌細胞HT-29的增殖具有顯著的抑制作用，其抑制率為3. 83% 49. 58%，蟲草菌絲體多糖、 桑黃子實體多糖和桑黃菌絲體多糖在0. 1 0. 8mg/ml劑量時對人源性結腸癌細胞HT-29 的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分別為7. 46% 觀.42%, -4. 06% 22. 40%和 2. 01% 18. 13%。當不同多糖進行組合時，由圖2可知，蟲草子實體多糖和桑黃菌絲體多糖(1 1)組合時可顯著提高抑制結腸癌細胞HT-29的增殖，且這種抑制作用顯著高于單一多糖，在0. 2-1. 6mg/ml劑量時，抑制率達17. 47% 72. 17%.由圖3可見，蟲草子實體多糖、蟲草菌絲體多糖、桑黃子實體多糖和桑黃菌絲體多糖在0. 1 0. 8mg/ml劑量時對人源性肝癌細胞H印G2的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分別為-3· 42% 21. 07%, 5. 15% 6. 39%, 7. 03% 9. 77%和 8. 27% 14. 87%。由圖4可知，當不同多糖進行組合時，可顯著提高其抗肝癌細胞!fepG2的增殖作用，其中蟲草子實體多糖和桑黃菌絲體多糖(1 1)組合時抑制作用最顯著，且顯著高于任一單多糖，在 0. 2-1. 6mg/ml 劑量時，抑制率為 35. 01% 43. 99%。
由圖5可見，蟲草子實體多糖和桑黃子實體多糖在0. 1 0. 8mg/ml劑量時對人源性肺癌細胞A549的增殖具有顯著的抑制作用，其抑制率分別為23. 47% 41. 14%和 11. 45% 30. 21% ；蟲草菌絲體多糖和桑黃菌絲體多糖在0. 1 0. 8mg/ml劑量時對肺癌細胞A549的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分別為8. 06% 18. 11%和3. 91% 14. 50%。由圖6可知，當不同多糖進行組合時，可顯著提高其抗肺癌細胞A549的增殖作用， 蟲草子實體多糖和桑黃菌絲體多糖(1 1)組合時這種協同抑制作用增強，在0.2-1. 6mg/ ml劑量時，抑制率為32. 73% 54. 40%。以上所述僅為本發明的具體實施例，但本發明的技術特征并不局限于此，任何本領域的技術人員在本發明的領域內，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發明的專利范圍之中。
權利要求
1.一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟A.將人工培養蟲草子實體用70°C-90°C烘干，粉碎成20-80目，蒸餾水90°C -100°C提取4-8h，過濾后濾液用濃度70% -80 %的乙醇沉淀，8000-12000rpm離心收集沉淀，復溶于水；B.將步驟A的產物用分子量10000道爾頓的超濾膜高壓過濾，得到透明液體用烘干或冷凍干燥后粉碎得到蟲草子實體多糖；C.在步驟A進行的同時，將液體發酵培養桑黃菌絲體用70°C-90°c烘干，粉碎成 20-80目，蒸餾水90°C -100°C提取4-他，過濾后濾液用濃度70% -80%的乙醇沉淀， 8000-12000rpm離心收集沉淀，復溶于水；D.將步驟C的產物用分子量10000道爾頓的超濾膜高壓過濾，得到透明液體用烘干或冷凍干燥后粉碎得到桑黃菌絲體多糖；E.將步驟B中得到的蟲草子實體多糖和步驟D中得到的桑黃菌絲體多糖按1 0.5 1 3的比例混合均勻后，通過壓片機壓片。
2.如權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，其特征在于步驟A中蟲草子實體的烘干溫度為80°C，粉碎度為40目，蒸餾水提取溫度95°C，提取時間為 6h，濾液用于沉淀的乙醇終濃度為75%。
3.如權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，其特征在于步驟C中桑黃菌絲體的烘干溫度為80°C，粉碎度為40目，蒸餾水提取溫度95°C，提取時間為 6h，濾液用于沉淀的乙醇終濃度為75%。
4.如權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，其特征在于步驟E中蟲草子實體多糖與桑黃菌絲體多糖按11的比例混合均勻。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗腫瘤活性多糖組合物的制備方法，將人工培養蟲草子實體和液體發酵培養桑黃菌絲體烘干、粉碎，加蒸餾水提取、乙醇沉淀離心后，再溶于水，用超濾膜高壓過濾得到蟲草子實體多糖和桑黃菌絲體多糖，將蟲草子實體多糖和桑黃菌絲體多糖配比混合均勻后，通過壓片機壓片。本發明的優點是通過復配后，利用兩類多糖相互協同作用，可增強其抗腫瘤活性。本發明工藝簡單、所建立的提取方法專業性強、重復性好，且使用醫用酒精提取，不僅環保，同時產品安全可靠，適宜于工業化生產。
文檔編號A61K36/068GK102178701SQ20111010448
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者呂志強, 朱燕, 李有貴, 林天寶, 胡桂燕, 計東風, 鐘石 申請人:浙江省農業科學院