專利名稱：：一種雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體及其制備方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥領域，更具體地，本發明公開了一種雙重靶向腫瘤的納米脂質體及其制備方法。
背景技術：
：近年來惡性腫瘤的發病率和死亡率呈明顯上升趨勢，已經成為威脅人類健康和生命的主要疾病。國際癌癥研究機構的報道顯示，1975年到2000年間，全球癌癥病例數增長了一倍，每年新發病例約1200萬，死亡患者超過700萬。2010年癌癥將躍居為全球的首要死因，2030年腫瘤患者人數將為現在的三倍，新發病例數將增至2000-2600萬。化療是惡性腫瘤綜合治療中的主要手段之一，合理的化療策略可顯著延長腫瘤患者的生存時間，極大改善患者的生存質量。紫杉醇是一種二萜類化合物，最早是從太平洋紫杉樹皮中獲得的天然產物，因其能夠穩定腫瘤細胞的微管，抑制有絲分裂而具有獨特抗癌活性(Wani,M.C.,etal.,Plantantitumoragents.VI.Theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia.JAmChemSoc，1971.93(9):p.2325-7.)，目前被廣泛應用于卵巢癌(Thomas，H.andP.Rosenberg,Roleofweeklypaclitaxelinthetreatmentofadvancedovariancancer.CritRevOncolHematol，2002.44Suppl:p.S43—51.)、乳腺癌(Saloustros,Ε.,D.Mavroudis,andV.Georgoulias,Paclitaxelanddocetaxelinthetreatmentofbreastcancer.ExpertOpinPharmacother,2008.9(15):p.2603—16.)、頭頸部癌(Aisner,J.andH.Cortes-Funes,Paclitaxelinheadandneckandothercancersfutureprospects.SeminOncol，1997.24(ISuppl2):p.S2-113-S2-115.)和非小細胞月市癌的治療(Greco,F.A.,Paclitaxel-basedcombinationchemotherapyinadvancednon-smallcelllungcancer.LungCancer,2001.34Suppl4S53—6.)。但紫杉醇是一禾中脂溶性物質，在水溶液和其它許多溶劑中都難以溶解(Ceruti，Μ.，etal.，Preparation,characterization,cytotoxicityandpharmacokineticsofliposomescontainingwater-solubleprodrugsofpaclitaxel.JControlRelease,2000.63(1-2):p.141-53·)。臨床上使用的紫杉醇制劑(Taxol，商品名為泰素)采用的溶媒為非離子表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL,CrEL)和無水乙醇(11，V/V)混合物，但該劑型伴隨很多難以解決的臨床問題(Hennenfent，K.L.andR.Govindan,Novelformulationsoftaxanes:areview.Oldwineinanewbottle？AnnOncol,2006.17(5):p.735-49.)。傳統紫杉醇制劑的臨床應用可導致一系列過敏反應(Hermenfent，K.L.andR.Govindan,Novelformulationsoftaxanes-.areview.Oldwineinanewbottle？AnnOncol,2006.17(5):p.735-49.)，輕者表現瘙癢、皮疹，重者表現為血管性水腫、低血壓、呼吸衰竭等(Weiss,R.B.,etal.,Hypersensitivityreactionsfromtaxol.JClinOncol,1990.8(7):p.1263-8.ffiemik,P.H.,etal.,PhaseIclinicalandpharmacokineticstudyoftaxol.CancerRes,1987.47(9):p.2486-93.)。95%以上的患者過敏反應發生于第一次或第二次紫杉醇制劑給藥期間，80%的癥狀發生于藥物輸注的前10分鐘，且往往紫杉醇僅僅輸注了lmg。由于CrEL可誘導動物產生類似的反應(Wiernik，P.H.，etal.,PhaseIclinicalandpharmacokineticstudyoftaxol.CancerRes,1987.47(9)p.2486-93.)，因此認為是CrEL的存在導致了上述不良反應的發生。且不良反應的發生與輸注速度相關(Lorenz,W.，etal.，HistaminereleaseandhypotensivereactionsindogsbysolubilizingagentsandfattyacidsanalysisofvariouscomponentsincremophorElanddevelopmentofacompoundwithreducedtoxicity.AgentsActions，1982.12(1-2):p.64-80.)，但延長輸注時間并不能消除過敏反應的出現。研究者嘗試用其他溶劑來替代CrEL，如聚乙二醇，但動物實驗發現聚乙二醇的存在可降低紫杉醇的抗腫瘤活性。因此CrEL仍是目前紫杉醇的標準溶媒(Wiernik,P.H.，etal.，PhaseIclinicalandpharmacokineticstudyoftaxol.CancerRes,1987.47(9)2486—93.)。臨床上普遍采用大劑量的糖皮質激素和組胺受體拮抗劑作為其使用前的常規預處理，但其療效尚不確切。美國西北大學芬伯格醫學院的藥物警戒項目中藥物不良反應事件及艮告研究(ResearchonAdverseDrugEventsandReports,RADAR)發現，1997年至Ij2007年間美國、歐洲和日本報道了171例使用聚氧乙烯蓖麻油紫杉醇后發生過敏反應的病例，其中58例患者發生死亡(34%)，96例報道采用了預處理方案的患者中21例發生死亡，BoehnkeMichaud·白勺石開胃(Michaud,L.B.,V.Valero,andG.Hortobagyi,Risksandbenefitsoftaxanesinbreastandovariancancer.DrugSaf,2000.23(5)p.401-28.)也表明，預處理方案采用后仍有約40%的患者會發生輕癥的過敏，3%的患者過敏反應可致命。同時預處理方案的施行限制了腫瘤合并潰瘍、糖尿病、高血壓等的患者對該藥的使用，且預處理方案中激素的使用還可能增加治療相關的死亡率。采用CrEL作為溶媒還可導致周圍神經系統毒性(Onetto，N.，etal.，OverviewofTaxolsafety.JNatlCancerInstMonogr,1993(15):p.131-9.)。電生理檢查發現紫杉醇CrEL溶液使用后發生周圍神經病變的患者存在軸突降解和脫髓鞘。環胞霉素CrEL溶液靜脈給藥后有約25%的患者會發生周圍神經病變，口服給藥則無此不良反應出現，而CrEL并不經胃腸道吸收(deGroen,P.C.，etal.，Centralnervoussystemtoxicityafterlivertransplantation.Theroleofeyelosporineandcholesterol.NEnglJMed，1987.317(14):p.861-6.)。治療劑量的紫杉醇或環胞霉素CrEL溶液所產生的CrEL血漿濃度可導致小鼠背根神經節神經元軸突腫脹、空泡變性和降解(Windebmk，A.J.，Μ.D.Blexrud,andP.C.deGroen,Potentialneurotoxicityofthesolventvehicleforcyclosporine.JPharmacolExpTher,1994.268(2):p.1051-6.)。目前的研究表明，CrEL產生的環氧乙烷衍生物是導致神經損傷的最主要的因素(Brat，D.J.，A.J.ffindebank,andS.Brimijoin,Emulsifierforintravenouscyclosporininhibitsneuriteoutgrowth,causesdeficitsinrapidaxonaltransportandleadstostructuralabnormalitiesindifferentiatingNlE.115neuroblastoma.JPharmacolExpTher,1992.261(2)p.803-10.)。紫杉醇CrEL溶液每周三次，每次輸注3小時的用法使紫杉醇的血漿濃度超出了機體清除代謝的能力，因此紫杉醇CrEL溶液在體內的消除呈非線性動力學，亦稱為零級消除動力學(Sparreboom，Α.，etal.，CremophorEL-mediatedalterationofpaclitaxel4distributioninhumanblood:clinicalpharmacokineticimpIications.CancerRes，1999.59(7):p.1454-7.vanTellingen,0.，etal.，CremophorELcauses(pseudo-)non-linearpharmacokineticsofpaclitaxelinpatients.BrJCancer,1999.81(2)p.330-5.)。動物實驗證實，紫杉醇非線性藥代動力學特征與CrEL有關(Sparreboom，Α.，etal.，NonlinearpharmacokineticsofpaclitaxelinmiceresultsfromthepharmaceuticalvehicleCremophorEL.CancerRes,1996.56(9):p·2112-5.)，人體內的實驗也獲得了類似的結果(vanTellingen，0.，etal.，CremophorELcauses(pseudo-)non-linearpharmacokineticsofpaclitaxelinpatients.BrJCancer,1999.81(2)p.330-5.)。紫杉醇的清除率的降低導致機體組織暴露于高濃度的藥物時間延長，產生嚴重全身毒副反應的幾率增加。CrEL還可在血液中形成微小顆粒，包裹紫杉醇分子，從而影響藥物分子在腫瘤組織中的分布、代謝與排泌(Sparreboom，Α.，etal.，CremophorEL—mediatedalterationofpaclitaxeldistributioninhumanblood:clinicalpharmacokineticimplications.CancerRes,1999.59(7):p.1454-7.)。紫杉醇的耐藥機制很多，P-糖蛋白的表達升高是重要的原因之一。P-糖蛋白是由多藥耐藥基因編碼的一種跨膜轉運蛋白，具有ATP酶活性，能將化療藥物從細胞內泵出，降低細胞內的有效藥物濃度而致耐藥。有研究認為，CrEL可以通過調節P-糖蛋白、抑制多藥耐藥基因的表達而增強紫杉醇的抗腫瘤作用，但在體內實驗中未獲得成功(Woodcock，D.Μ.，etal.，ReversalofthemultidrugresistancephenotypewithcremophorEL,acommonvehicleforwater-insolublevitaminsanddrugs.CancerRes,1990.50(14)p.4199-203.Schuurhuis,G.J.,etal.,ThepolyoxyethylenecastoroilCremophorELmodifiesmultidrugresistance.BrJCancer,1990.62(4):p.591-4.Friche，E.，etal.，ThesolventscremophorELandTween80modulatedaunorubicinresistanceinthemultidrugresistantEhrlichascitestumor.CancerCommun,1990.2(9):p·297—303·)。相反有研究發現，CrEL可通過阻滯細胞周期，降低腫瘤細胞對紫杉醇的攝取而拮抗紫杉酉享的細胞毒作用(Liebmann，J.，etal.，TheinfluenceofCremophorELonthecellcycleeffectsofpaclitaxel(Taxol)inhumantumorcelllines.CancerChemotherPharmacol,1994.33(4):p.331-9.)。研究表明，紫杉醇CrEL溶液存在穩定性和相容性的問題，如藥物一經稀釋紫杉醇就易發生沉淀；可從臨床上常規使用的PVC輸液袋和輸液管路中溶出增塑劑(二乙烯己基鄰苯二甲酸鹽)，因此整個使用過程必須釆用玻璃或非PVC輸液器；與塑料或玻璃容器有非特異性吸附等等(Waugh,W.N.，LA.Trissel,andV.J.Stella，Stability,compatibility,andplasticizerextractionoftaxol(NSC-125973)injectiondilutedininfusionsolutionsandstoredinvariouscontainers.AmJHospPharm,1991.48(7):p·1520-4.Song,D.,L.F.Hsu,andJ.L.Au,Bindingoftaxoltoplasticandglasscontainersandproteinunderinvitroconditions.JPharmSci，1996·85(1):p·29-3L)。綜上所述，紫杉醇現有劑型中CrEL的存在導致了一系列臨床毒副反應的出現，CrEL對紫杉醇的療效及藥代動力學也可產生復雜的作用，因此臨床上迫切需要研制出不含CrEL的紫杉醇新劑型，以克服表面活性劑的缺陷。眾多學者致力于紫杉醇新劑型的研發，目前已經研發成功或正在研發的新劑型包括白蛋白納米粒(Abraxame)(Ibrahim，N.K.，etal.，PhaseIandpharmacokineticstudyofABI-007,aCremophor—free，protein—stabilized，nanoparticleformulationofpaclitaxel.ClinCancerRes,2002.8(5):p.1038—44.Yamada,K.，etal.，PhaseIandPharmacokineticStudyofABI-007，Albumin-boundPaclitaxel，AdministeredEvery3WeeksinJapanesePatientswithSolidTumors.JpnJClinOncol,2010.).紫杉醇前藥二十二碳六烯酸紫杉酉享(Taxoprexin)(Wolff，Α.C.，etal.，PhaseIstudyofdocosahexaenoicacid-paclitaxel:ataxane-fattyacidconjugatewithauniquepharmacologyandtoxicityprofile.ClinCancerRes，2003.9(IOPt1):p.3589-97.)；多聚谷氨酸紫杉酉享(Xyotax)(Sabbatini，P.，etal.，PhaseIIstudyofCT-2103inpatientswithrecurrentepithelialovarian,fallopiantube，orprimaryperitonealcarcinoma.JClinOncol,2004.22(22):p.4523—31.)、紫杉醇類似物(BMS-184476(Rose，W.C.，C.Fairchild,andF.Y.Lee，Preclinicalantitumoractivityoftwonoveltaxanes.CancerChemotherPharmacol,2001.47(2):p.97-105.)、DJ_9270no，C.，A.Takao,andR.Atsumi,Absorption，distribution，andexcretionofDJ—927，anovelorallyeffectivetaxane,inmice,dogs,andmonkeys.BiolPharmBull,2004.27(3):p.345-51.Baas,P.，etal.，PhaseI/IIstudyofa3weeklyoraltaxane(DJ-927)inpatientswithrecurrent，advancednon-smal1celllungcancer.JThoracOncol,2008.3(7)p.745-50·)、BMS_275183(Broker，LE·，etal.,EffectoffoodonthepharmacokineticbehaviorofthepotentoraltaxaneBMS-275183.ClinCaneerRes,2008.14(13)p.4186-91.Broker，L.E.，etal.，PhaseItrialwithBMS-275183,anoveloraltaxanewithpromisingantitumoractivity.ClinCaneerRes，2006.12(6):p.1760-7.)、OrtataxelCassinelli，G·，etal.,CellularbasesoftheantitumoractivityofthenoveltaxaneIDN5109(BAY59-8862)onhormone-refractoryprostatecancer.ClinCaneerRes,2002.8(8):p.2647-54.Polizzi,D.,etal.,Anoveltaxanewithimprovedtolerabilityandtherapeuticactivityinapanelofhumantumorxenografts.CancerRes,1999.59(5)1036-40·)、RPR109881A(Gelmon，K.A.，etal.，PhaseIdose-findingstudyofanewtaxane,RPR109881A，administeredasaone-hourintravenousinfusiondays1and8topatientswithadvancedsolidtumors.JClinOncol,2000.18(24):p.4098-108.Kurata，T.，etal.，PhaseIandpharmacokineticstudyofanewtaxoid,RPR109881A，givenasa1-hourintravenousinfusioninpatientswithadvancedsolidtumors.JClinOncol,2000.18(17):p.3164-71.)、紫杉醇膠束共聚物(Genexol-PM)(Kim,S.C.,etal.，Invivoevaluationofpolymericmicellarpaclitaxelformulation!toxicityandefficacy.JControlRelease,2001.72(1-3):p.191-202·)、紫杉醇維生素E乳劑(T0C0S0L)、紫杉醇微球(Paclimer)(Lissianskaya,Α.，etal.，Paclitaxelinjectableemulsion:Phase2astudyofweeklyadministrationinpatientswithplatinum-resistantovariancancer.JournalofClinicalOncology,2004.22(14):p.460s-460s.Bogdanova,N.,etal.,PaclitaxelinjectableemulsionPhase2astudyofweeklyadministrationinpatientswithnon-smallcelllungcancer(NSCLC).JournalofClinicalOncology,2004.22(14):p.649s_649s.)、紫杉醇脂質體(力樸素)等。其中部分紫杉醇新劑型已經上市(Abraxame于2005年被美國食品藥品管理局批準上市；紫杉醇脂質體力樸素由南京思科藥業研發成功，于2003年批準在國內上市)，大部分紫杉醇新劑型尚處于臨床前研究階段，或I-III期臨床試驗中。上述紫杉醇新劑型的共同點在于避免了采用CrEL作為溶媒，因此具有獨特的優勢，如可縮短藥物的輸注時間、降低過敏、骨髓抑制和脫發等不良反應的發生率等。部分劑型由于結構的改變而不再是P-糖蛋白的作用底物，因此可降低紫杉醇耐藥的發生率，部分劑型甚至可以口服吸收。但紫杉醇新劑型與紫杉醇傳統劑型相比能否改善腫瘤患者的預后尚未可知。
發明內容本發明旨在研發一種新型的腫瘤靶向脂質體載藥納米粒，包封紫杉醇后可改善紫杉醇的理化性狀和藥代動力學行為，改善溶解度，從而避免傳統制劑中CrEL導致的各項毒副反應，同時通過該載體的腫瘤主動靶向性，特異性地增加紫杉醇在腫瘤局部的濃度，在增強抗腫瘤作用的同時降低藥物對正常組織器官的毒性。本發明將紫杉醇包封于雙重靶向腫瘤的納米脂質體中，兩個靶分子能維持各自原有的生物學活性，在功能上產生協同效應。本發明提供的雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體主要由三部分組成，雙重靶向腫瘤的多肽，脂質連接物和紫杉醇脂質體。首先，本發明采用固相合成法獲得雙重靶向腫瘤的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下=ARYCRGDCFDATffLPPR0其中ARYC腳CFDG其核心結構為RGD三肽，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列，針對靶點是整合素αV家族。αV整合素為細胞黏附分子家族的重要成員之一，通過參與內皮細胞的激活和遷移、介導內皮細胞增殖、抑制內皮細胞凋亡、參與堿性成纖維細胞生長因子和VEGF誘導的血管生成、誘導環加氧酶2的產生等多種途徑促進新生血管化和腫瘤的發生發展。αV整合素在生理狀態下靜止的血管內皮細胞和正常組織器官內呈低表達，但高表達于活化的腫瘤血管內皮細胞和腫瘤細胞表面。藥物載體連接含R⑶序列的短肽后可顯著增強其靶向腫瘤新生血管的能力。ATWLPra序列是針對的靶點為VEGFR2的共受體神經內皮素-I(Neuropilin-LNRP-I)。VEGFR-2(VascularEndothelialGrowthFactorReceptor-2)是VEGF/VEGFR家族成員，主要識別低分子量的VEGF，在血管內皮細胞遷移、增殖、存活及血管通透性調節中起重要作用。NRP-I是-種非酪氨酸跨膜糖蛋白，是VEGFR-2的輔助受體，和VEGFR-2的共表達可顯著促進VEGF165與VEGFR-2的結合，增強VEGF165介導的生物學作用，促進血管內皮的增殖。NRP-I亦高表達于活化的腫瘤血管內皮細胞和腫瘤細胞表面，在生理狀態下靜止的血管內皮細胞和正常組織器官內呈低表達。本發明采用Fmoc固相合成法合成了多肽配體-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸-棕櫚酸(lysine-glycine-glycine，KGG-pal)聯結物，連接新型多肽和紫杉醇脂質體。本發明采用薄膜超聲分散法制備紫杉醇脂質體，擠壓過濾法或高壓均質法控制脂質體粒徑在60-200nm。小粒徑的納米粒作為藥物載體有其獨特優勢。惡性腫瘤的侵襲性生長和轉移有賴于血管的生成，雖然相對于正常血管來說，腫瘤組織中血管對藥物的選擇性滲透力較弱，但最大直徑仍不超過400nm。大粒徑的脂質體在脾臟的截留更多，從血液中清除更快，到達腫瘤組織的脂質體明顯減少。因此小粒徑長循環藥物脂質體更易透過血管間隙發揮到達腫瘤局部的作用。細胞學研究證實，本發明的含有RGD及ATWLPra序列的雙重靶向腫瘤紫杉醇脂質體，因新型靶向多肽分子量小，核心載藥顆粒粒徑控制在60-200nm，故易穿透內皮細胞屏障進入腫瘤組織。研究證實，R⑶及ATWLPra序列連接后空間構象互不影響，能維持序列各自原有的生物學活性，從而產生協同效應。相較于只含有RGD或ATWLPra序列的單靶向紫杉醇脂質體，研發的雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體有顯著為優的與新生血管內皮細胞及腫瘤細胞的特異性結合力。與無靶向及單靶向腫瘤的紫杉醇脂質體相比，雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體有更強的與新生血管內皮細胞及腫瘤細胞特異性結合能力，及抑制腫瘤生長能力，故可被進一步應用于惡性腫瘤的靶向治療領域。圖1雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體掃描電鏡2雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體粒徑分布3=Taxol及各紫杉醇脂質體細胞攝取4=Taxol及各紫杉醇脂質體MTT檢測5=Taxol及各紫杉醇脂質體抑瘤實驗D60瘤重圖具體實施例方式實驗材料1、試劑、藥品和細胞蛋黃卵磷脂(eggphosphatide,eggPC)、膽固醇(cholesterol,CHOL)購自德國東尚公司；單甲氧基聚乙二醇2000二硬脂酰磷脂酰乙醇胺mPEG2000-DSPE購自美國AvantiPolarLipids公司；脂質多肽均由吉爾生化(上海)有限公司合成；Taxol購自施貴寶公司；紫杉醇購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfonate,SDS)、聚丙烯酰胺、蔗糖、冰醋酸、硝酸銀、戊二醛、抑肽酶等均購自國藥集團上海分公司；HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)，ATCCNo.:CRL_2873；A549細胞(肺腺癌細胞系)，ATCCNo.:CCL-185;DMEM(Dulbecco，sModifiedEagleMedia，高糖細胞培養基)，購自^witrogen公司；新生牛血清購自奧地利PAA公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶等購自華美公司。2、儀器設備和耗材MillexTMFH針式濾器和UltracelYMlOO超濾管(美國Millipore公司)；SK5210HP水浴超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)；R502B旋轉蒸發儀(西安太康儀器設備有限公司)JEM-1200EXII型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；Quanta200FEG場發射環境掃描電子顯微鏡(FEI公司)；MASTERSUER2000激光粒度儀(英國Malvern公司)；冷凍干燥機6L(美國Labconco公司)；余同前。3、溶液配制PBS液(0.01M,pH7.4)=NaCl8.Og；KCl0.2g；Na2HP04·12H201.44g；KH2P040.Mg;超純水800ml；調節pH值至7.4，定容至IL后高壓滅菌，4°C保存。0.25%胰酶消化液(IL)胰酶2.5g；NaCl8g；KCl0.4g；Na2HP04·12H200.06g；KH2P040.06g；NaHC030.35g；酚紅0.02g；加壓過濾除菌，分裝后_20°C保存DMEM培養基(IL):DMEM粉2袋；NaHC037.4g；青霉素0.12g；鏈霉素0.2g；HCl,NaOH調節pH值至7.2-7.4，加壓過濾除菌，4°C保存；細胞凍存液DMEM培養基70%；二甲亞砜(DMSO)10%；新生牛血清20%；分裝后_20°C保存；細胞裂解液Tris10mmol/L；Nacl1OOmmo1/L；EDTAlmmol/L；EGTAlmmol/L；NaFlmmol/L；Na4P207·10H2020mmol/L；釩酸鈉2mmol/L；TritonX-1001甘油10%；十二烷基硫酸鈉0.1%；脫氧膽酸鹽0.5%;PMSF100μg/μL0通過以下實施例進一步說明本發明，但不作為本發明的限制。實施例1雙重靶向腫瘤多肽的合成步驟采用9-芴甲氧羰基(fIuorenylmethyloxycarbonyl，FM0C)固相合成法合成雙重靶向腫瘤的多肽,采用高效液相色譜(highperformance1iqui(!chromatography,HPLC)法純化，采用質譜鑒定。具體合成步驟如下1)樹脂溶漲將FMOC-AA-Wang-Resin樹脂放入反應管中，加二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide,DMF)(15ml/g)30min；脫保護吸棄DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)5min,吸棄后再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)15min；2)檢測抽掉哌啶溶液，取樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀，苯酚溶液各一滴，1050C-110°C加熱5min，變深藍色為陽性反應。3)洗滌=DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次；4)縮合保護氨基酸(FOMC-Asp-OH)三倍過量，1_氧_3_雙二甲胺羧基苯駢三氮唑四氟化硼鹽三倍過量，均用盡量少DMF溶解，加入反應管，立刻加入N-甲基嗎啉十倍過量，反應30min；5)洗滌=DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次；6)重復操作步驟2)—6)，依次連接FM0C-Tyr-0H、FMOC-Thr-OH,FMOC-Met-OH,FM0C-Asn-0H、FMOC-Pro-OH、FM0C-Arg-0H、FMOC-Lys-OH、FMOC-Leu-OH、FMOC-Phe-OH；7)最后一次洗滌:DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次，DCM(10ml/g)兩次；8)裂解裂解液(10ml/g)(含TFA94.5%；水2.5%；EDT2.5%；TIS1%)120min；9)吹干洗滌氮氣盡量吹干裂解液，乙醚洗滌六次，常溫揮干；10)密封，-20度保存。所得為白色粉末狀物質，HPLC純化，純度>95%；實施例2非靶向、單靶向及雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體的制備采用薄膜超聲分散法制備各紫杉醇脂質體非主動靶向紫杉醇脂質體配方PCCHOLmPEG-DSPEPTX910.50.33，主動靶向紫杉醇脂質體在上述配方中加入不同的脂質多肽(ARYCRGDCFDG-KGG.ARYCRGDCFDATffLPPR-KGG)(與總脂摩爾比均為1542)。由于在專利1實施例中，多肽ATWLPI3R及ATWLPPR-熒光脂質體均未顯示出優于多肽ARYCRGDCFDG.ARYCRGDCFDG-熒光脂質體及多肽ARYCRGDCFDATffLPPR.ARYCRGDCFDATffLPPR-熒光脂質體的與細胞特異性親和力，故未合成，且在后繼試驗中亦未予應用。上述配方溶于氯仿，0.2μm平板濾器過濾，置旋轉蒸發儀37°C旋轉成膜后繼續真空抽吸1小時進一步除去氯仿；加適量過濾除菌的9%蔗糖溶液，充分溶脹至薄膜脫落，所得混懸液經Mini-extruder擠出(1μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm各10次)后，分裝至西林瓶，置真空冷凍干燥機中，_38°CX2h，-35°CX18h，-16°CX2h,20°CX濁，干燥后加塞封蓋，-20°C冰箱保存待用。各項檢測均采用凍干脂質體PBS復溶液。掃描電鏡見雙靶向紫杉醇脂質體呈圓形或類圓形，顆粒大小較一致，粒徑<IOOnm(見圖1)。實施例3紫杉醇脂質體體外釋放實驗復溶的非主動靶向紫杉醇脂質體、單靶向及雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體及泰素(Taxol)各3ml置分子量14KD透析袋內，袋外加20ml含45g/L牛血清白蛋白的滅菌水模擬體內環境，恒溫磁力攪拌器攪拌(300rpm)，于30min、lh、2h、4h、6h、》i、24h分別取出透析液80μL備用，同時透析袋外加回80μL含45g/L牛血清白蛋白的滅菌水。取出的透析液加入320μL色譜級的甲醇溶液沉淀蛋白，漩渦混合后高速離心13000gX10min，取上清液行HPLC檢測紫杉醇含量。同時檢測透析前復溶的各紫杉醇脂質體及Taxol溶液中紫杉醇的濃度，以(透析液中紫杉醇濃度/原液中紫杉醇濃度)X100%作為衡量緩釋能力的指標。結果發現(見圖2)，紫杉醇從CrEL輔劑中釋放最快，24h累積釋放達15.96%。紫杉醇采用脂質體作為藥物載體后，體外的釋放速率明顯降低，紫杉醇脂質體、單靶向紫杉醇脂質體、雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體24h累積釋放分別為4.40%,4.55%,3.6%，緩釋作用顯著。同時也提示脂質多肽連接于脂質體表面后未破壞脂質體的結構完整性，增強的緩釋性能可進一步改善紫杉醇在體內的藥代動力學行為。實施例4細胞內吞實驗HUVEC、A549細胞接種于M孔板，1XIO6/孔，置培養箱24h使細胞貼壁，每孔分別加入Taxol、紫杉醇脂質體、單靶向紫杉醇脂質體、雙靶向紫杉醇脂質體(以紫杉醇計5μg)，復孔4個，37°C孵育4h，冰PBS液洗滌2次，加細胞裂解液100μL/孔，收集裂解液，加100μL甲醇溶液沉淀蛋白，漩渦混合5min，IOOOOg離心30min，取上清液行HPLC檢測細胞內的紫杉醇含量。Taxol及各紫杉醇脂質體與細胞孵育后，細胞攝取情況見圖3。由圖可見，A549細胞和HUVEC對傳統紫杉醇溶液(Taxol)的攝取量極低，紫杉醇含量達HPLC檢測最低限(分別為5ng/孔和25ng/孔)。紫杉醇包封于脂質體后，由于脂質體可通過接觸釋放、吸附、內吞、融合、脂質交換等多種途徑與細胞發生作用，故增加了細胞對紫杉醇的攝取能力。A549細胞和HUVEC對非靶向紫杉醇脂質體的攝取量分別達145ng/孔、157ng/孔。連接腫瘤特異性靶向多肽的紫杉醇脂質體進一步增強了細胞對紫杉醇的攝取能力，其中A549細胞和HUVEC對單靶點紫杉醇脂質體的攝取量分別為212ng/孔和232ng/孔，對雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體的攝取量分別為346ng/孔和319ng/孔。同時上述數據還提示，細胞攝取雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體的能力更強，證實雙重靶向腫瘤的新型多肽具有與腫瘤細胞、血10管內皮細胞更好的特異性的結合力。實施例5細胞毒性試驗A549和HUVEC細胞稀釋至4X104/mL，加入96孔板，每孔100μL，置培養箱24h使細胞貼壁；采用無血清的DMEM培養液將Taxol、紫杉醇脂質體、單靶向紫杉醇脂質體、雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體倍比稀釋為終濃度0.9375mg/L、l.875mg/L、3.75mg/L、7.5mg/L、15mg/L的工作液，每孔加入工作液100μL，再置細胞培養箱孵育72h；加5mg/mL的MTT液20μ1/孔，培養箱中孵育4h，1500rpm離心lOmin，棄去培養液，各孔分別加入DMS0200μL，脫色搖床混勻30min后上酶標儀，選擇波長530nm檢測吸光值，計算IC50，公式如下lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4Xm:IgJi:.L彳丨Jψ.I:lg(iuΙ/川臨U:)PPllilι/)'、-'-IiIIPm:iiiIJ-'11-Πlii."-r(Ju丨、御山Ij-,·、)Pn.]4Ν·ΓΙ,(Ik-J^)HiijIJr)圖4可見，Taxol對A549細胞、HUVEC中的IC50值分別為6.027mg/L、6.56mg/L；紫杉醇脂質體對兩種細胞的IC50值分別為3.37mg/L、4.56mg/L；單靶向紫杉醇脂質體、雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體對兩種細胞的IC50值分別為1.46mg/L、l.16mg/L和3.40mg/L、3.25mg/L。結果提示紫杉醇脂質體表面連接血管靶向多肽后增強了對腫瘤細胞和血管內皮細胞的毒性，其中雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體具有最強的細胞毒性。實施例6體內抑瘤作用評估A549肺腺癌細胞常規培養至對數生長期，0.25%胰酶消化成細胞懸液后取1X107/0.ImL接種于4周齡(18_20g)雌性Balb/c裸鼠右腋皮下，瘤體長至50mm3-80mm3起開始給藥。裸鼠按給藥不同共分5組，每組5只，于dl、d4、d8天分別給予生理鹽水、Taxol、紫杉醇脂質體、單靶向紫杉醇脂質體和雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體。其中生理鹽水組給予生理鹽水0.5mL，余各組給藥量按紫杉醇計為7.5mg/kg。給藥后監測裸鼠體重靴I周)、瘤體大小O次/周)，至d60處死所有裸鼠，剝離瘤體稱重，計算腫瘤抑制率。腫瘤大小計算公式腫瘤體積V=ab2/2，其中a為腫瘤最長徑和b為腫瘤最短徑，腫瘤抑制率計算公式(1-實驗組瘤重)/對照組瘤重X100%。結果顯示(見圖幻，給予生理鹽水的對照組裸鼠移植瘤生長迅速，d60達1925mm3，平均瘤重為(1.62±0.09g)。給予Taxol及各紫杉醇脂質體組裸鼠瘤體積增長相對緩慢，Taxol組d60移植瘤平均體積為1104mm3，抑瘤率為46.9%；紫杉醇脂質體組d60移植瘤平均體積為912mm3，平均瘤重為(0.61士0.IOg)，抑瘤率為62.3%；單靶向紫杉醇脂質體組和雙重靶向腫瘤的紫杉醇脂質體組腫瘤平均體積進一步縮小，分別為590mm3和455mm3，平均瘤重分別為(0.44士0.07g)和(0.30士0.04g)，抑瘤率分別為72.8%和81.5%0間接證實雙重靶向腫瘤的多肽有效連接于紫杉醇脂質體表面，促進了腫瘤組織對藥物載體的攝取，提高了藥物在局部的有效濃度，增強了藥物的抗腫瘤能力。權利要求1.一種雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體，其特征在于其主要由雙重靶向腫瘤的多肽，脂質連接物和紫杉醇脂質體三部分組成。2.權利要求1所述的雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體的制備方法，其特征在于首先合成雙重靶向腫瘤的ARYCRGDCFDATWLPra多肽，然后合成多肽連接物，最后制備雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體。3.權利要求1所述的雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體在制備抑制腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發明屬于生物醫藥領域，更具體地，本發明公開了一種雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體,所述的雙靶向紫杉醇納米脂質體由雙重靶向腫瘤的多肽、脂質連接物和紫杉醇脂質體三部分組成。本發明還公開了所述的雙重靶向腫瘤的紫杉醇納米脂質體的制備方法及其作為制備抑制腫瘤藥物的用途。文檔編號A61P35/00GK102166190SQ201110093530公開日2011年8月31日申請日期2011年4月14日優先權日2011年4月14日發明者周彩存,周蔚,孟淑燕,宋胤,李瑋,粟波申請人:上海市肺科醫院