專利名稱：一種可用于光動力療法的光敏微膠囊及其制備方法
技術領域：
本發明屬于光敏聚合物薄膜材料技術領域，具體涉及一種可用于光動力療法的光 敏微膠囊及其制備方法。
背景技術：
癌癥是威脅人類生命的主要疾病之一。目前控制和綜合治療癌癥是各國衛生戰略 的重點，也是世界關注的研究熱點。傳統的癌癥治療手段，即手術、放療和化療經過不斷改 進，可以控制、治愈多種腫瘤，但仍然存在很大缺陷，例如，手術會嚴重損害患者的功能或形 貌，放療和化療則會有較大的毒副作用。興起于上世紀90年代的光動力療法(PDT)是一種局部處理病灶組織的光化學反 應。近年來，PDT作為一種治療淺層癌的有效方法，以其對特定腫瘤細胞的良好的靶向性、 安全性，以及局部損傷性等優勢，成為了頗受各國學者重視的一種新型癌癥治療法。然而， 用于PDT療法的許多光敏劑具有疏水性，限制了 PDT的臨床實踐。為解決此問題，多種親水 性的載體被引入到PDT中，如凝膠、脂質體、膠質等。其中，利用層層自組裝技術構筑的親水 性天然聚電解質微膠囊引起了普遍關注，特別是其具有獨特的大小、形貌、組成和通透性的 可控性，此外還具有較大的內腔結構來包覆功能小分子。負載了光敏藥物小分子的光敏微 膠囊可以在特定波長光照條件下，使光敏分子到達激發態，通過系間竄躍變為三線態，這部 分光敏分子與周圍氧分子通過能量轉移發生反應，產生可導致細胞不可逆損傷或死亡的單 線態氧，完成PDT治療過程。目前，利用層層自組裝技術制備的微膠囊已有報道。如，國際專利(W09947252)以 三聚氰胺甲醛(MF)為模板，交替吸附帶有相反電性的聚苯烯胺和聚苯乙烯磺酸鈉，最后溶 去MF制得中空微膠囊。上述專利是采用了非生物降解與相容的壁材，無法在生物醫藥領域 實踐。國際專利(wo2008(^8M6)構筑了具有良好生物相容性的海藻酸鈉(ALG)/殼聚糖 (CHI)包覆磁性狗304納米粒子的微膠囊，其微膠囊粒徑大于100 μ m，無法實現體內送藥。 國內專利(CN101703490)公開了一種以欖香烯等脂溶性藥物為囊芯，CHI或其季銨鹽/ λ 角叉膠或ALG為壁材來包覆磁性納米粒子或光敏納米粒子的聚合物/無機納米粒子雜化的 微納米載藥膠囊。另有文獻報道李峻柏等人通過直接浸漬法，制備了一種負載了小分子光 敏劑HB的光敏微膠囊，該膠囊受光激發后對腫瘤細胞產生了高毒性。但是上述報道中，小 分子光敏粒子隨機吸附于囊壁材料上或者富集于膠囊內部，這樣的光敏粒子會隨著富集濃 度的加大而團聚，進而導致光敏效率下降或單線態氧產率減少。此外，吸附的小分子光敏粒 子在到達病灶部位前很容易由囊壁孔道泄露，降低單線態氧產量，并容易對正常組織造成 毒副作用。因此，在光敏微膠囊中實現光敏劑的預固定就顯得尤為重要。
發明內容
本發明的目的在于解決現有技術中的問題，提供一種具有生物相容性及高效光活 性的光敏微膠囊及其制備方法，將直接接枝了小分子光敏劑的天然聚合物作為壁材，采用層層自組裝技術制備微膠囊。本發明的光敏微膠囊有效預固定了光敏劑分子，并可定量控 制光敏劑含量，單線態氧產率高，微膠囊粒徑均一、性能可控。本發明的一種可用于光動力療法的光敏微膠囊，其特征在于，是囊壁材料中含有 以化學鍵直接接枝光敏劑的天然聚合物聚糖(CHI)或葡聚糖的多層囊壁自組裝的中空膠曩。本發明提出的上述可用于光動力療法的光敏微膠囊，采用如下技術方案1)光敏囊壁材料的制備將聚合物天然殼聚糖(CHI)或葡聚糖配制成濃度為1 50mg/mL的聚合物溶液A， 調節PH至4-9 ；將光敏劑配成濃度為1 50mg/mL的光敏劑溶液B ；將溶液A緩慢滴加到 溶液B中，混合反應并同時加以攪拌，其中溶液A與溶液B的體積比為(1 40) 1，攪拌 速度為500 lOOOrpm，在25 80°C條件下反應1 3天；將上述反應物用截留分子量為 7000的透析袋透析5 20天，經水洗/離心2 3次后，將得到的沉淀物冷凍干燥2 4 天，得到粉末狀光敏聚合物產物；溶于去離子水中，配制成濃度為0. 1 lOmg/mL的光敏聚 合物水溶液。2)光敏微膠囊的制備采用層層自組裝的方法，在帶有電荷的微球模板上組裝帶有相反電荷的聚電解 質，交替吸附多層，然后組裝步驟1)中的光敏聚合物，去核后得到中空的光敏微膠囊，分散 于去離子水溶液中保存。步驟1)中制備溶液A或B時所用的溶劑為可溶解相應物質的常用溶劑，可以是去 離子水、醇、醋酸、氫氧化鈉水溶液等。步驟1)所述的調節pH所用試劑為碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液或2-(N-嗎啡啉)乙 磺酸(MEQ緩沖液。步驟1)中所述的光敏劑為帶有可與相應的聚合物縮合反應的活性基團的光敏物 質，活性基團如氨基、羧基、鹵素取代基等，以實現光敏物質的預固定。所述的光敏劑優選玫 瑰紅、熒光素或9-氯甲基蒽，但并不限于上述光敏劑。步驟2、所述的微球模板為表面帶正電荷的三聚氰胺甲醛(MF)微球，表面帶負電 荷的聚苯烯微粒(PS)、聚乳酸或用聚乙烯亞胺(PEI)或聚-4-乙烯基苯磺酸鈉(PSQ處理 的SiO2微球、CaCO3, MnCO3等無機晶體。所述的帶電荷的模板可直接吸附與其帶有相反電 荷的聚電解質物質，本領域的技術人員可根據現有文獻自行制備。步驟2、所述的聚電解質溶液分別為帶負電荷的聚電解質為海藻酸鈉、硫酸葡聚 糖或羧甲基纖維素鈉，其水溶液濃度為lmg/mL ；帶正電荷的聚電解質為殼聚糖、聚賴氨酸， 其水溶液濃度為lmg/mL，或按步驟1)的方法制備的光敏聚合物的水溶液。步驟2)所述的去核方法取決于所選模板材料的性質，其中，MF微球在pH< 1. 6的 酸性條件下分解；碳酸鹽模板可用鹽酸或絡合劑去除；PS球可在THF中溶解；SiO2微球可用 氫氟酸去除等；本領域的技術人員可根據現有文獻自行查閱去除模板方法。在特定波長光照下，光敏微膠囊響應產生單線態氧將200L光敏微膠囊的去離子 水分散液置于電子順磁共振儀，以40 μ L濃度為2. OM的2，2，6，6-四甲基哌啶為單線態氧 捕獲劑，在550nm波長激光照射下，檢測到單線態氧的生成。與現有技術相比較，本發明具有以下有益效果
1)以化學鍵直接接枝具有高單線態氧量子產率的光敏分子到天然聚合物上，將此 光敏聚合物作為一種囊壁材料組裝光敏微膠囊，能夠固定光敏劑分子，并防止其局部團聚， 可以維持高效單線態氧量子產率。本發明方法簡單易行，所得光敏聚合物材料具有較高的 表面電荷，易于組裝膠囊。2)本發明所制備的光敏微膠囊水分散性好，粒徑均一，在特定波長光照下具有高 的單線態氧量子產率，可殺死腫瘤細胞，可潛在應用于PDT中。3)本發明所提供的制備光敏微膠囊的材料，為天然聚電解質，安全無害，原料易 得。制備的光敏微膠囊尺寸、組成、通透性易控制，工藝簡單，可重復性強。
圖1、對比例1和實施例1中制備的純殼聚糖CHI和接枝了光敏劑殼聚糖囊壁材料 RB-CHI的傅里葉紅外譜圖。圖2、實施例1中制備的光敏微膠囊的掃描電鏡圖。圖3、實施例1中制備的光敏微膠囊的熒光共聚焦圖片。圖4、對比例2和實施例1中制備的空白微膠囊和光敏微膠囊的電子順磁共振波譜 圖。以下結合附圖和實例來對本發明作進一步說明。
具體實施例方式實施例1光敏囊壁材料的制備A 將0. Ig的CHI加入25mL的體積比為1 %乙酸水溶液中，在200 IOOOrpm的 攪拌轉速下攪拌12h以上，以MES緩沖液調節pH = 5 6 ；B:將0.028g的RB (玫瑰紅)溶于25mL無水甲醇溶液中，在攪拌速度為200 IOOOrpm下，加入催化劑1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺， 活化羧基約30min ；C 將A步驟的CHI乙酸溶液緩慢滴加進B步驟的RB無水甲醇溶液中，并同時以攪 拌速度為500 IOOOrpm加以攪拌1 3天，溫度控制在25 60°C ；D 將C步驟的反應物用截留分子量為7000的透析袋透析5 20天，經水洗/離 心2 3次后，將得到的沉淀物冷凍干燥2 4天，得到粉末狀淡粉色的光敏聚合物產物 RB-CHI。E 將D步驟的RB-CHI溶于去離子水中，配制成濃度為lmg/mL的RB-CHI溶液；光敏微膠囊的制備A 取ImL表面帶正電荷的MF微球模板的水分散液于1. 5mL的離心管中，放入離心 機中離心分離3 lOmin，移去上層水溶液；B 帶負電荷的電解質溶液ALG(海藻酸鈉)吸附在離心管中加入1. 5mL配好并 過濾的lmg/mL的ALG溶液，振動搖勻，讓球型粒子MF均勻分散在聚合物溶液中，靜止放置 1 2h，中間還需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進行；C 水洗離心分離7 8min，移去上層液，加入1. 5mL去離子水振動搖勻，然后離心分離。然后移去上層液再加入1. 5mL去離子水，重復振動搖勻離心分離步驟，總共進行 2 3次水洗；D 帶正電荷的電解質溶液CHI吸附移去上述C步驟中水洗/離心后的上層液，加 入配好并過濾的lmg/mL的CHI溶液1. 5mL，振動搖勻，讓球型粒子均勻分散在聚合物溶液 中，靜止放置1 2h，中間還需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進行；E 重復B D步驟，交替吸附5個雙層，在最后一層使用上述制備的正電性光敏聚 合物溶液RB-CHI作為囊壁組成；F 去核向組裝好10層的微膠囊中加入ImL濃度為0. IM的鹽酸溶液，振動搖勻， 放置20 60min直至離心管內的懸浮液變透明，再離心分離移去上層液；水洗后，振動搖 勻，得到中空的光敏微膠囊，于去離子水溶液中保存。如圖1，對比純殼聚糖CHI和接枝了光敏劑的殼聚糖RB-CHI的傅里葉紅外譜圖， 接枝反應以前，1655cm"1和1599CHT1處的峰歸因于CHI分子鏈上的C = 0、N-H鍵。CHI與 RB反應后，在1643cnT1和1548CHT1處出現了明顯的吸收峰，分別歸屬于C = O伸縮振動和 N-H伸縮振動，是酰胺鍵的特征峰。與CHI在1595cm—1處的自由氨基吸收峰不同。此外，在 1730cm—1處沒有新的峰出現，證明沒有脂基生成，這也說明CHI鏈上的N-H基團是主要的活 性反應基團，能與RB的羧基發生脫水縮合反應。上述檢測結果說明通過縮合反應，小分子的光敏分子成功接枝到了聚合物殼聚糖 上。如圖2，在空氣中干燥的中空光敏微膠囊表面出現許多不規則褶皺，粒徑分布均 一，分散性好。如圖3，實施例1中制備的光敏微膠囊的熒光共聚焦顯微鏡圖片顯示膠囊外周展 示出紅色的熒光光環，直接證明了接枝了光敏劑的殼聚糖RB-CHI作為囊壁被包覆在膠囊 上，有效固定了光敏劑，并保持了熒光特性。如圖4，對比未吸附光敏聚合物質的空白微膠囊(對比例2)和光敏微膠囊的電子 順磁共振(ESR)波譜圖，對于光敏微膠囊，隨著照射時間的增加，ESR信號強度迅速增加，隨 后速率減慢，最終達到一個平臺。而空白微膠囊未產生代表單線態氧的ESR信號。說明本 發明制備的光敏微膠囊能有效產生單線態氧，可潛在用于PDT中。實施例2光敏囊壁材料的制備A 將0. 5g的CHI溶于50mL的1 %乙酸溶液中，以碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液調節 pH = 5 6 ；B 將0. 05g的熒光素溶于5mL無水甲醇溶液中，攪拌速度為200 IOOOrpm ；C 將A步驟的CHI乙酸溶液緩慢滴加進B步驟的熒光素無水甲醇溶液緩中反應 48h以上，并同時以攪拌速度為500 1000rpm，60 80°C真空下得到反應物；D 將C步驟的反應物用截留分子量為7000的透析袋透析5 20天，經水洗/離 心2 3次后，將得到的沉淀物冷凍干燥1 2天，得到粉末狀光敏聚合物產物。E 將D步驟的粉末狀光敏聚合物產物溶于去離子水中，配制成濃度為lmg/mL的光 敏聚合物水溶液待用；光敏微膠囊的制備
A 取ImL表面帶有負電荷的PS微粒模板于1. 5mL的離心管中，放入離心機中離心 分離3 lOmin，移去上層水溶液；B 帶正電荷的CHI水溶液吸附在離心管中加入1. 5mL配好并過濾的lmg/mL的 CHI水溶液。振動搖勻，讓PS微粒模板均勻分散在聚合物溶液中，靜止放置1 池，中間還 需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進行；C 水洗離心分離7 8min，移去上層液，加入1. 5mL去離子水振動搖勻，然后離 心分離。然后移去上層液再加入1. 5mL去離子水，重復振動搖勻離心分離步驟，總共進行 2 3次水洗；D 帶負電荷的硫酸葡聚糖水溶液吸附移去上述C步驟中水洗/離心后的上層 液，加入配好并過濾的lmg/mL的硫酸葡聚糖水溶液1. 5mL,振動搖勻，讓PS微粒均勻分散 在聚合物溶液中，靜止放置1 2h，中間還需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進 行；E 重復B D步驟，交替吸附5個雙層，在膠囊最外層再使用上述制備的正電性光 敏聚合物溶液作為囊壁組成；F 去核向組裝好的光敏微膠囊中加入ImL的THF溶液，振動搖勻，放置20 60min直至離心管內的懸浮液變透明，再離心分離移去上層液；水洗后，振動搖勻，得到中 空的光敏微膠囊，于去離子水溶液中保存。實施例3A 將Ig的葡聚糖溶于40mL的NaOH水溶液中，以MES緩沖液調節pH = 5 6 ；B 將0. 06g的9-氯甲基蒽溶于2mL甲苯溶液中，攪拌速度為500 IOOOrpm ；C:將A步驟的葡聚糖溶液緩慢滴加進B步驟的9-氯甲基蒽溶液中，并同時以攪拌 速度為100 600rpm加以攪拌1_3天，在隊保護下，控制溫度40 80°C反應；D 將C步驟的反應物用截留分子量為7000的透析袋透析5 20天，經水洗/離 心2 3次后，將用環己烷萃取得到的沉淀物冷凍干燥1 2天，得到粉末狀的光敏聚合物 產物。E 將D步驟的光敏聚合物配制成lmg/mL的光敏聚合物水溶液待用；光敏微膠囊的制備A 取ImL已用PSS處理的CaCO3粒子水溶液于1. 5mL的離心管中，放入離心機中 離心分離3 lOmin，移去上層水溶液；B 帶正電荷的聚賴氨酸溶液吸附在離心管中加入1. 5mL配好并過濾的lmg/mL 的聚賴氨酸溶液。振動搖勻，讓CaC03粒子均勻分散在聚合物溶液中，靜止放置1 池，中 間還需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進行；C 水洗離心分離7 8min，移去上層液，加入1. 5mL去離子水振動搖勻，然后離 心分離。然后移去上層液再加入1. 5mL去離子水，重復振動搖勻離心分離步驟，總共進行 2 3次水洗；D 帶負電荷的羧甲基纖維素鈉溶液吸附移去上述C步驟中水洗后的上層液，加 入配好并過濾的lmg/mL負電性羧甲基纖維素鈉水溶液1. 5mL，振動搖勻，讓球型粒子均勻 分散在聚合物溶液中，靜止放置1 2h，中間還需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全 地進行；
E 重復B D步驟，交替吸附5個雙層，在最外層再使用上述制備的正電性光敏聚 合物水溶液作為囊壁組成；F 去核在組裝好10層的微膠囊離心管內加入ImL濃度為0. 2M的EDTA溶液，振 動搖勻，放置20 60min直至離心管內的懸浮液變透明，再離心分離移去上層液；水洗后， 振動搖勻，得到中空的光敏微膠囊，于去離子水溶液中保存。實施例4光敏囊壁材料的制備A 將0. 2g的CHI加入25mL的體積比為1 %乙酸水溶液中，在200 IOOOrpm的 攪拌轉速下攪拌12h以上，以MES緩沖液調節pH = 5 6 ；B:將0.028g的RB (玫瑰紅)溶于25mL無水甲醇溶液中，在攪拌速度為200 IOOOrpm下，加入催化劑1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺， 活化羧基約30min ；C 將A步驟的CHI乙酸溶液緩慢滴加進B步驟的RB無水甲醇溶液中，并同時以攪 拌速度為500 IOOOrpm加以攪拌1 3天，溫度控制在25 60°C ；D 將C步驟的反應物用截留分子量為7000的透析袋透析5 20天，經水洗/離 心2 3次后，將得到的沉淀物冷凍干燥2 4天，得到粉末狀淡粉色的光敏聚合物產物 RB-CHI。E 將D步驟的RB-CHI溶于去離子水中，配制成濃度為lmg/mL的RB-CHI溶液；光敏微膠囊的制備A 取ImL表面帶正電荷的MF微球模板的水分散液于1. 5mL的離心管中，放入離心 機中離心分離3 lOmin，移去上層水溶液；B 帶負電荷的電解質溶液ALG吸附在離心管中加入1. 5mL配好并過濾的lmg/mL 的ALG溶液，振動搖勻，讓球型粒子MF均勻分散在聚合物溶液中，靜止放置1 池，中間還 需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進行；C 水洗離心分離7 8min，移去上層液，加入1. 5mL去離子水振動搖勻，然后離 心分離。然后移去上層液再加入1. 5mL去離子水，重復振動搖勻離心分離步驟，總共進行 2 3次水洗；D 帶正電荷的電解質溶液CHI吸附移去上述C步驟中水洗/離心后的上層液，加 入配好并過濾的lmg/mL的CHI溶液1. 5mL，振動搖勻，讓球型粒子均勻分散在聚合物溶液 中，靜止放置1 2h，中間還需振動搖勻2 3次，使得吸附更好更完全地進行；E 重復B D步驟，交替吸附2個雙層，在第3 5個雙層中，使用上述制備的正 電性光敏聚合物溶液RB-CHI代替CHI作為囊壁組成，步驟同B D，即形成含有三層光敏劑 層的光敏微膠囊(ALG/CHI)2(ALG/RB-CHI)3 ；F 去核向組裝好10層的微膠囊中加入ImL濃度為0. IM的鹽酸溶液，振動搖勻， 放置20 60min直至離心管內的懸浮液變透明，再離心分離移去上層液；水洗后，振動搖 勻，得到中空的光敏微膠囊，于去離子水溶液中保存。對比例1所述的對比例1為天然的聚合物殼聚糖固體粉末。對比例2
8
制備步驟與實施例2相同，以MF為模板，交替吸附5個雙層ALG/CHI，最后得到第 一、三、五、七、九層為ALG吸附層，第二、四、六、八、十層為CHI吸附層的中空微膠囊。
權利要求
1.一種可用于光動力療法的光敏微膠囊，其特征在于，是囊壁材料中含有以化學鍵直 接接枝光敏劑的天然聚合物聚糖(CHI)或葡聚糖的多層囊壁自組裝的中空膠囊。
2.按照權利要求1的可用于光動力療法的光敏微膠囊的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟1)光敏囊壁材料的制備將聚合物天然殼聚糖(CHI)或葡聚糖配制成濃度為1 50mg/mL的聚合物溶液A，調節 PH至4-9 ；將光敏劑配成濃度為1 50mg/mL的光敏劑溶液B ；將溶液A緩慢滴加到溶液B 中，混合反應并同時加以攪拌，其中溶液A與溶液B的體積比為(1 40) 1，攪拌速度為 500 lOOOrpm，在25 80°C條件下反應1 3天；將上述反應物用截留分子量為7000的 透析袋透析5 20天，經水洗/離心2 3次后，將得到的沉淀物冷凍干燥2 4天，得到 粉末狀光敏聚合物產物；溶于去離子水中，配制成濃度為0. 1 10mg/mL的光敏聚合物水溶 液；2)光敏微膠囊的制備采用層層自組裝的方法，在帶有電荷的微球模板上組裝帶有相反電荷的聚電解質，交 替吸附多層，然后組裝步驟1)中的光敏聚合物，去核后得到中空的光敏微膠囊；步驟1)所述的調節PH所用試劑為碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液或2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 (MES)緩沖液；步驟1)中所述的光敏劑為帶有可與相應的聚合物縮合反應的活性基團的光敏物質。
3.按照權利要求2的制備方法，其特征在于，所述的光敏劑優選玫瑰紅、熒光素或9-氯甲基蒽。
4.按照權利要求2的制備方法，其特征在于，帶有電荷的微球模板為表面帶正電荷的 三聚氰胺甲醛(MF)微球，表面帶負電荷的聚苯烯微粒(PS)、聚乳酸或用聚乙烯亞胺(PEI) 或聚-4-乙烯基苯磺酸鈉(PSS)處理的SW2微球、CaCO3、MnCO3。
5.按照權利要求2的制備方法，其特征在于，帶電荷聚電解質溶液為帶負電荷的聚電 解質為海藻酸鈉、硫酸葡聚糖或羧甲基纖維素鈉，其水溶液濃度為lmg/mL ；帶正電荷的聚 電解質為殼聚糖、聚賴氨酸，其水溶液濃度為lmg/mL，或按步驟1)的方法制備的光敏聚合 物的水溶液。
全文摘要
本發明公開了一種可用于光動力療法的光敏微膠囊及其制備方法，屬于光敏聚合物薄膜材料技術領域。首先，制備光敏劑分子接枝聚合物的光敏聚合物材料；然后采用層層自組裝技術，在微球模板上組裝帶相反電荷的聚電解質材料，去核后制備出囊壁材料中含有以化學鍵直接接枝光敏劑的天然聚合物聚糖(CHI)或葡聚糖的多層囊壁自組裝的中空膠囊。本發明的光敏微膠囊水分散性好，粒徑均一；具有良好的生物相容性；固定了光敏分子，在特定波長光照下單線態氧量子產率高，能有效殺死腫瘤細胞，可潛在應用于PDT中，工藝簡單，易于操作。
文檔編號A61K47/36GK102133208SQ20111006482
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月17日 優先權日2011年3月17日
發明者王曉磊, 鄭言貞, 陳建峰, 陶霞 申請人:北京化工大學