專利名稱：一種寬宿主譜雞白痢沙門氏菌噬菌體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種寬宿主譜雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體及其在養殖環境中的應用，尤其是能夠特異性的殺滅養殖環境中雞白痢沙門氏菌的應用。屬于微生物工程領域。
背景技術：
在禽類，沙門氏菌可引起雞白痢、雞傷寒和副傷寒。其中，雞白痢沙門氏菌引起雞的一種常見多發性傳染病，嚴重影響雛雞成活率，成年雞多為慢性或隱性感染，一般不表現明顯的臨床癥狀。雞白痢沙門氏菌感染往往是終生帶菌的，感染母雞所產生的蛋，高達1/3 帶菌。帶菌蛋的孵化率低，孵出的雛雞的成活率也低。所以，雞白痢所造成的經濟損失是巨大的。雞白痢呈世界性分布，美國和歐洲一些國家基本控制了本病，目前該病主要在發展中國家流行，比如中國等。帶菌雞是本病蔓延與傳播的重要方式。感染雞可通過互啄、啄食帶菌蛋及皮膚傷口傳播。感染禽的糞便、污染的飼料、飲水及籠具也是雞白痢的來源。控制和解決沙門氏菌污染一直是全世界的難題。養殖場多利用凈化手段和飼喂抗生素的方法控制沙門氏菌感染，但由于該病呈垂直和水平兩種方式傳播，這些控制措施并不理想，并且抗生素的大量使用不僅造成耐藥菌株不斷出現，而且抗生素殘留問題也愈發嚴重。因此，亟待研究開發一種新型的療法和產品，以解決和應對細菌對抗生素的耐藥性問題，以控制食物細菌性污染。噬菌體是依賴細菌的病毒，能特異性地感染并裂解宿主菌，正是噬菌體特異性裂解細菌，而不影響機體或正常菌群這一特性，使得其有廣闊的應用前景。噬菌體在溶解其特異性宿主細菌時非常有效，且殺死細菌的機制與抗生素不同，不易產生耐藥性和殘留，是一種潛在的新型抗菌劑。噬菌體的裂解譜正在發生變化，某些噬菌體已不再是單一裂解性的噬菌體，其裂解譜正在擴展，比如，Bielke等Q007)分離到的腸炎沙門氏菌噬菌體成功以1 株克雷白氏桿菌(Klebsiella)和3株大腸桿菌分離株為宿主菌擴增；徐焰等Q007)分離到的大腸桿菌噬菌體XY對5株大腸桿菌具有裂解作用。廣譜噬菌體是今后研究的主要方向，克服了噬菌體裂解細菌具有種和型的特異性的缺點，用這種寬噬噬菌體可以治療細菌混合感染，具有極好的臨床價值。
發明內容
本發明的目的在于提供一種寬宿主譜的雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體，它不僅能夠有效地殺滅養殖環境中雞白痢沙門氏菌臨床分離株SPu-116 ；而且對雞白痢沙門氏菌其他臨床分離株(SPu-115、SPu-27、SPu_95、SPu_905)、副傷寒沙門氏菌ATCC 50073、 鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、禽沙門氏菌CVCC 2184、大腸桿菌K88或雞白痢沙門氏菌CMCC 533也具有裂解活性。本發明的另一目的是針對目前禽業養殖中雞白痢沙門氏菌引起的疾病并沒有有效的控制措施，提供一種有效的防治產品。開發對雞白痢沙門氏菌具有強裂解作用的噬菌體制劑，該制劑可以單獨或與其他噬菌體復配使用，能夠有效殺滅養殖場中雞白痢沙門氏菌，為目前控制養殖環境中雞白痢沙門氏菌提供一種安全、無毒副作用的噬菌體產品，為工業化生產噬菌體殺菌劑提供噬菌體來源。本發明的又一目的是提供一種有效的防治手段，將所述的噬菌體制備成液體、凍干粉或藥片形式，單獨使用或與其他噬菌體復配后，經口服、噴霧或注射等方式，用于殺滅畜禽體內、畜禽體表、畜禽飼料、養殖器具或養殖空間環境中的雞白痢。本發明的目的是這樣實現的一種寬宿主譜雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體，其特征在于保藏號為CCTCC M 2011042，該噬菌體命名為PSPu-4-116，其對雞白痢沙門氏菌(SPu-116, SPu-115、SPu-27、SPu-95、SPu-905)、副傷寒沙門氏菌 ATCC 50073、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、禽沙門氏菌CVCC 2184、大腸桿菌K88或雞白痢沙門氏菌CMCC 533均具有裂解活性。該噬菌體具有呈正多面體的頭部結構和可伸縮性的尾部，頭部直徑約74. 3nm，尾部長約114. 2nm;噬菌體在固體培養基上可以形成較大透亮空斑，周圍無暈環，邊緣清晰規則，直徑為1. 5 2mm ；根據國際病毒分類委員會(ICTV) 2005年發表的《病毒分類-國際病毒分類委員會第八次報告》為標準，該噬菌體應屬于肌尾病毒科。一種上述噬菌體的應用，其特征在于純化后的噬菌體能夠用于抑制雞白痢沙門氏菌。在噬菌體的應用中，其特征在于用于抑制雞白痢沙門氏菌是指將純化的噬菌體制備成液體、凍干粉或藥片形式，單獨使用或與其他噬菌體復配后用于控制養殖環境中的雞白痢沙門氏菌。在噬菌體的應用中，其特征在于養殖環境是指畜禽體內、畜禽體表、畜禽飼料、 養殖器具或養殖空間環境。在噬菌體的應用中，其特征在于，使用方式為口服、噴霧或注射。本發明的優點在于分離到的雞白痢沙門氏菌噬菌體對好幾個血清型的沙門氏菌具有裂解活性，并且具有跨種屬裂解的特性，是一種寬宿主譜的噬菌體；而且，是一種新型的防治畜禽養殖中細菌疾病的產品和手段；經雛雞試驗證明，該噬菌體毒副作用甚小，安全性高；由于制備的噬菌體具有較好的親水相，容易配制成滴注液、噴灑液或淋洗液，可以方便有效的殺滅養殖環境中雞白痢沙門氏菌。
圖1為噬菌體PSRi-4-116電鏡照片；圖2為噬菌體PSPu-4-116雙層平板檢測結果；圖3為噬菌體PSPu-4-116在機體內殺菌結果。
具體實施例方式實施例1、噬菌體PSPu-4-116的分離制備本發明中的糞液污水樣品采自南京祿口蛋雞場糞便池；噬菌體宿主菌為雞白痢沙門氏菌SPu-116 (從發病肉雞腸道分離，由本實驗室按照國標GB/T 4789. 4-2008分離、鑒定并保存)。將糞液污水樣品經雙層濾紙過濾，8000rpm離心20min，再分別用0. 45 μ m和0. 22 μ m濾膜過濾上清。取50mL上清，加入500 μ 1噬菌體宿主菌過夜培養物，再加入CaCl2 母液至終濃度2mM混勻后，加入20mLTSB-YE液體培養基，放置于37°C培養12 16h。次日， 取上述培養物以12000rpm離心lOmin，取上清并加入0. 3%氯仿，形成噬菌體原液。取三塊1.5% TSB-YE瓊脂平板，標記為1、2和3，分別吸取宿主菌液0. ImL滴于正中央，用涂棒將菌液均勻地涂開，5min后，平板1滴加0. 05mL噬菌體原液，平板2滴加 0. 05mL0. 85%生理鹽水，平板3不滴加任何溶液，待自然晾干后，置于37°C溫箱培養IOh后， 觀察三塊平板的變化。對上述鑒定后含有噬菌體的水樣(即出現空斑的水樣)進行以下操作取噬菌體原液0. lmL，進行10倍稀釋，取IO2UO4和IO6稀釋液各0. ImL與過夜培養的宿主菌液0. ImL 混勻，室溫作用15min后，加入約3. 7mL 0.7% LB培養基，混勻后迅速傾倒入TSB-YE瓊脂平板上層，搖勻平置5min，待其凝固，置于37°C培養1 后觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板。實施例2、噬菌體的擴增培養和純化在形成噬菌斑的雙層平板上，用移液器的槍頭挑取直徑較大的單個噬菌斑，接種于3 5mL TSB-YE液體培養基中，加入噬菌體宿主菌液0. lmL，混勻，室溫作用15min，37°C 培養10 14h，12000rpm，4°C離心lOmin，取上清，加入0. 3%氯仿。取ImL新鮮培養的宿主菌，加0. ImL噬菌體裂解液(以單個噬菌體培養物與宿主菌分別按照1 1、1 10和1 100的比例)。37°C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入IOOmLTSB-YE液體培養基，再加入CaCl2母液至終濃度2mM，37°C搖振培養12 16h，12000rpm，4°C離心lOmin，取上清，得到大量噬菌體裂解液。在裂解液中加入RNaseA、DNase I至終濃度為1 μ g/mL, 37°C溫育30min ；加9. 3g PEG8000,5. 8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴Ih或4°C過夜；4°C離心IOOOOrpm lOmin，去上清液； 加2mL SM液，充分洗滌管壁及沉淀，室溫作用Ih;通過加入等體積的氯仿抽提，溫和振蕩 30s ；4°C 5000rpm離心IOmin以分離有機相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純化的噬菌體，雙層平板檢測純化噬菌體(圖2)。純化的噬菌體命名為PSPu-4-116，在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏單位地址中國·武漢·武漢大學，保藏號CCTCC M 2011042，分類命名雞白痢沙門氏菌噬菌體 (Salmonella Pullorum phage)，保藏日期為 2011 年 2 月 21 日。實施例3、噬菌體寬宿主譜檢測試驗選擇27株細菌(包括沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌)對噬菌體PSPu-4-116 的宿主譜進行分析。具體操作如下分別取27株細菌的過夜培養物100 μ 1，滴加在1. 5% TSB-YE平板(針對沙門氏菌)或1. 5% LB平板(針對大腸桿菌和志賀氏菌)中央，用涂棒分別將它們涂制成均勻的菌苔。然后將每個平板平均分成兩個區域，其中一個區域，取10μ 1 噬菌體PSPu-4-116滴加在菌苔表面，另一個區域滴加10 μ 1生理鹽水作對照，待液滴干燥后倒置于37°C培養12 16h，觀察結果。結果表明(表1)試驗選擇的細菌菌液在平板上均生長良好。滴加噬菌體 PSPu-4-l 16的區域在SPu-116生長的平板出現不長細菌的透明區域，并且對所收集的27株細菌中的10株有裂解作用，裂解率為37. 04%。說明分離到的噬菌體PSPu-4-116具有跨種屬裂解的特性，是一種寬宿主譜的噬菌體。
表1噬菌體宿主譜測定結果
權利要求
1.一種寬宿主譜雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體PSPu-4-116，其特征在于保藏號為CCTCC M 2011042，該噬菌體具有相對較寬宿主譜，對所收集的27株細菌(包括沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌)中的10株有裂解作用，裂解率為37. 04 %。
2.根據權利要求1所述寬宿主譜雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體PSPu-4-l16，其特征在于該噬菌體具有呈多面體的頭部結構和可伸縮性的尾部，頭部直徑約74. 3nm，尾部長約114. 2nm，應屬于肌尾病毒科；在固體培養基上可以形成透亮空斑，周圍無暈環，邊緣清晰規則，直徑為1.5 2mm。
3.根據權利要求1所述寬宿主譜雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體PSPu-4-l16，其特征在于純化后的噬菌體能夠用于抑制雞白痢沙門氏菌。
4.根據權利要求3所述，其特征在于用于抑制雞白痢沙門氏菌是指將純化的噬菌體制備成液體、凍干粉或藥片形式，單獨使用或與其他噬菌體復配后用于控制養殖環境中的雞白痢沙門氏菌。
5.根據權利要求4所述，其特征在于養殖環境是指畜禽體內、畜禽體表、畜禽飼料、 養殖器具或養殖空間環境。
6.根據權利要求4所述，其特征在于，使用方式為口服、噴霧或注射。
全文摘要
本發明涉及一種沙門氏菌噬菌體，特別涉及一種寬宿主譜雞白痢沙門氏菌強裂解性噬菌體(Salmonella pullorum bacteriophage)。本發明還涉及將所述的噬菌體用于控制養殖環境中的雞白痢沙門氏菌。上述雞白痢沙門氏菌噬菌體命名為PSPu-4-116，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M2011042。
文檔編號A61K35/76GK102296051SQ201110053518
公開日2011年12月28日 申請日期2011年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者包紅朵, 張輝, 王冉 申請人:江蘇省農業科學院