專利名稱：一種hvem基因在制備肝癌診斷和預后預測的產品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種HVEM基因的應用，具體地說，是HVEM基因在制備肝癌診斷和預后預測的產品中的應用。
背景技術：
肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，目前已居我國腫瘤致死率的第二位，并有逐步增高的趨勢，嚴重危害我國人民的健康。肝癌的治療目前仍是以手術為主的綜合治療，但中晚期患者常失去手術機會。肝癌的惡性程度高，發展迅速，容易復發，致使目前總體療效仍不理想，每年死亡人數與新增病例數幾乎相等。駕馭免疫系統來攻克肝癌的想法很早以前就有人提出，但是到目前為止都沒有取得預期效果。目前的研究認為，腫瘤細胞能通過變異和進化躲避機體的免疫監視，甚至抑制腫瘤特異的免疫應答，最終進入免疫逃逸階段。在該階段，腫瘤通過癌細胞本身和腫瘤間質，直接和間接地利用多種機制形成一個免疫抑制的腫瘤微環境，如同一個完善的免疫屏障，使得機體的抗腫瘤免疫無功而返。T淋巴細胞在活化時需要來自抗原受體即T細胞受體第一信號和由一系列表達于細胞表面的共刺激分子傳遞的第二信號。這些共刺激能調節淋巴細胞活化的程度、性質和持續時間。皰疫病毒侵入介體(herpes virus entry mediator, HVEM)是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，同時也是屬于共刺激分子。HVEM主要表達于初始T細胞、NK細胞、B細胞和單核細胞，也可表達于一些非免疫細胞如肝細胞、腸上皮細胞和平滑肌細胞等。人們發現HVEM能同淋巴毒素a (LTa)和LT a同源分子配體一LIGHT相互作用。由于LIGHT同時具有誘導腫瘤細胞凋亡和共刺激T細胞活化的功能，它有希望為腫瘤的治療帶來新的方法。有研究表明，位于基質細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞和腫瘤細胞株表面的HVEM與LIGHT結合后，導致腫瘤局部免疫效應細胞顯著增加，產生強烈的抗腫瘤免疫，最終清除原發和轉移的腫瘤。近年來肝癌的免疫治療研究也在不斷進行，如細胞因子、自體淋巴細胞活化回輸、基于樹突狀細胞的免疫治療和甲胎蛋白來源的多肽疫苗等。但是，這些試驗的結果都不太理想。對于療效欠佳的原因，除了免疫治療措施本身在質和量上存在缺陷之外，腫瘤細胞利用各種免疫逃逸機制來擺脫機體免疫監視也為原因之一。基于此，要想成功實現腫瘤免疫治療，探索腫瘤的免疫逃逸機制是極其關鍵的。由于HVEM擔當著T細胞活化的開關分子作用，對T細胞的免疫反應起著共刺激信號，所以HVEM的異常表達，可能在T細胞介導的免疫增強中具有重要作用。絕大多數對HVEM免疫調節的研究，針對的是表達于免疫細胞表面的 HVHM分子。中國專利文獻CN :101896198A公開了一種治療血液惡性腫瘤和自身免疫疾病的HVEM配體，該發明涉及治療血液惡性腫瘤，尤其是慢性淋巴細胞型白血病，以及治療自身免疫性疾病的HVEM配體。中國專利文獻CN 1891714A公開了一種單純皰疹病毒進入介體HVEM的新配體(p30)，p30可用于調節免疫應答并可用于抑制皰疹病毒感染，也提供應用該發明P30治療淋巴細胞疾病患者或患有或懷疑患有皰疹病毒感染的患者的方法。但是關于HVEM在實體腫瘤中的研究及其臨床意義，以及HVEM在抗腫瘤中的作用機制目前還未見報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種HVEM基因在制備診斷肝癌的產品中的應用。所述的診斷肝癌的產品包括用RT-PCR、實時定量PCR或免疫檢測診斷肝癌的產品。所述的用RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增HVEM基因的引物。所述的用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增HVEM基因的引物。所述的用免疫檢測診斷肝癌的產品包括與HVEM蛋白特異性結合的抗體。本發明的再一的目的是，提供一種HVEM基因在制備預測肝癌預后的產品中的應用。本發明的第三個的目的是，提供一種HVEM基因在制備治療肝癌的藥物中的應用。本發明優點在于
首次發現了 HVEM在實體瘤組織的異常表達，本發明的HVEM基因，可作為診斷肝癌和預測肝癌預后的特異標志基因，使肝癌診斷和預后預測更加準確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點和有效新藥。
附圖I 是 Real-time PCR 結果圖。附圖2是實時定量PCR結果圖。附圖3 是 Western-blot 結果圖。附圖4是HVEM在肝癌組織顯著低表達。附圖5是HVEM在癌旁肝組織顯著高表達。附圖6是肝癌組織中HVEM表達較低者與較高者的無瘤生存率和總體生存率比較。附圖7是各細胞株HVEM的表達情況。附圖8是合成用于轉染HVEM的質粒。附圖9是成功轉染SMMC-7721。附圖10是上調HVEM后的SMMC-7721增殖減低。附圖11是劃痕實驗示轉HVEM組的肝癌細胞遷移能力明顯下降。附圖12是Transwell分析細胞侵襲能力。附圖13是上調HVEM后的SMMC-7721成瘤的HE染色。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例I HVEM在肝癌和癌旁的表達情況I.材料與方法 1.1實驗材料 I. I. I組織標本
免疫組織化學用組織來源103例肝癌(HCC)及相對應的癌旁組織石蠟切片來自東方肝膽外科醫院病理科2004年I月-2004年6月行肝癌根治性切除術標本。Realtime-PCR、Western_blot 用組織來源2009 年 I 月-2009 年 6 月東方肝膽外科醫院行肝癌根治性切除術的新鮮組織標本。1.1.2主要試劑 ⑴免疫組織化學用試劑
一抗(所用濃度I :200)，HVEM (N-19，SC-7766)，Stanta公司；抗體稀釋液(長島公司)；二抗(所用濃度I :200), HRP標記的兔抗羊IgG, ICL公司；用0. OlM PH7. 4 PBS稀釋；BSA(鼎國生物)；1%BSA (0. OlM PBSPH7.4 IOml+ BSA IOOmg)；
抗原修復液
原液 A 液(0. 1M) 21. 01 克 C6H807.H20 (枸櫞酸)+ 1000ML 雙蒸水B 液(0. 1M) 29. 14 克 C6H5Na307. 2H20(枸櫞酸鈉)+IOOOml 雙蒸水配液0. OlM枸櫞酸緩沖液PH =6. 0+0. I 6. 0-0. I，A液9ml，B液41ml450 ml雙蒸水，共500ml ；DAB顯色試劑盒DAK0公司，按說明書操作；另外過程中浸洗所用PBS均為0. OlM PH7. 4溶液。(2) Realtime-PCR 試劑
5X RT緩沖液，2. 5 mM dNTP混合液，引物見表I。表I HVEM 和 act in mRNA RT-PCR 檢測引物
權利要求
1.一種HVEM基因在制備診斷肝癌的產品中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的診斷肝癌的產品包括用RT-PCR、實時定量PCR或免疫檢測診斷肝癌的產品。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的用RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增HVEM基因的引物。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增HVEM基因的引物。
5.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的用免疫檢測診斷肝癌的產品包括與HVEM蛋白特異性結合的抗體。
6.一種HVEM基因在制備預測肝癌預后的產品中的應用。
7.—種HVEM基因在制備治療肝癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種HVEM基因在制備診斷肝癌的產品中的應用。本發明還提供一種HVEM基因在制備預測肝癌預后的產品中的應用和一種HVEM基因在制備治療肝癌的藥物中的應用。本發明優點在于首次發現了HVEM在實體瘤組織的異常表達，本發明的HVEM基因，可作為診斷肝癌和預測肝癌預后的特異標志基因，使肝癌診斷和預后預測更加準確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點和有效新藥。
文檔編號A61P35/00GK102653783SQ201110049470
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月2日 優先權日2011年3月2日
發明者夏勇, 李俊, 沈鋒 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院