專利名稱：包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的長效抗凝多肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種載體結合的長效抗凝多肽及其制備方法，尤其涉及到一種含免疫球蛋白Fc片段作為載體的長效抗凝多肽及其制備方法(C07K17/00)。
背景技術：
水蛭素(hirudin)是一種單鏈環肽化合物。肽鏈由65個氨基酸殘基組成，相對分子量為7000道爾頓。分子N端有三個二硫橋鍵(-S-S-)，分別在6位、14位、16位、28位和 22 位、39 位的半胱氨酸殘基(Cys6. . . Cysl4，Cysl6. . . Cys28，Cys22. . . Cys39)，使 N 端肽鏈繞迭成密集形核心環肽結構。C端富含酸性氨基酸殘基，63位的酪氨酸被硫酸化。水蛭素存在十種以上變異體，主要的三種變體簡稱為HV1、HV2和HV3。其氨基酸序列如下所示。HVl VVYDTCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQHV2 ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEEIPEEYLQHV3 ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEEPIPEDAYDE這些變異體肽鏈中都不含精氨酸、色氨酸和蛋氨酸。它們具有較高的同源性和基本相似的一級結構，其主要差別是N端氨基酸序列不同，但都具有相似的抗凝活性。核磁共振研究表明，水蛭素的變異體中不存在二級結構的α螺旋構型。N端的5個氨基酸殘基為疏水基團，C端則為親水基團，并游離在分子的表面。研究認為水蛭素肽鏈的二級和三級結構對其抗凝活性起決定性作用，其N端的三個二硫橋鍵則是決定分子二級和三級結構及其穩定性的關鍵，將二硫鍵氧化，或分子發生蛋白降解，則失去抗凝活性。若C端羧基被酯化， 或失去C端氨基酸，也會失去與凝血酶結合的能力。可見水蛭素的C端部分是抗凝活性所必需的，含二硫鍵N端疏水結構對水蛭素抗凝血酶作用亦有重要影響。水蛭素能夠直接與凝血酶發生不可逆的結合，使凝血酶失活，為目前發現的最強有力的凝血酶抑制劑。作為一種抗血栓藥物，水蛭素已經被用于血栓相關性疾病的治療和預防，如肝素引起的血小板減少癥II型、深靜脈血栓和不穩定型心絞痛等。但是，水蛭素在人體內的半衰期只有1至2小時，臨床給藥間隔較短，用藥量較大。 對水蛭素進行長效化處理，如以聚乙二醇修飾水蛭素，以及將水蛭素與白蛋白融合表達等， 均可增大水蛭素分子尺寸，降低水蛭素在體內的清除率，進而延長其半衰期，減少用藥次數，同時又可利用血藥濃度維持時間長這一優點降低水蛭素的給藥量，減小其抗凝活性強所帶來的出血風險。專利US536^58及專利US5663141即是用聚乙二醇修飾的方法來達到這一目的，但水蛭素的血漿半衰期提高有限，并且，采用長鏈聚乙二醇雖然能夠進一步延長血漿半衰期，但同時也會降低其生物活性。文獻(Syed S，Schuyler PD, Kulczyckx Μ, et al. Blood, 1997 ；89 =3243-3252)將水蛭素通過肽鏈C端與血清白蛋白利用大腸桿菌融合表達，從而在不明顯降低抗凝活性的基礎上延長了半衰期，但這一手段明顯加大了生產的難度。申請號為CN200480001775的中國專利申請公開了一種新的藥物長效化技術，即將免疫球蛋白Fc片段作為載體并通過如聚乙二醇之類的連接物與目標蛋白相連，不僅大大提高藥物的血漿半衰期，而且降低了藥物引起免疫應答的幾率，同時又可在保留活性的基礎之上降低藥物長效化處理的難度。聚乙二醇作為蛋白的修飾物，常用的反應功能基團有，可修飾伯胺或仲胺的琥珀酰亞胺琥珀酸酯聚乙二醇(PEG Succinimidyl Succinate, PEG-SS)、琥珀酰亞胺丙酸酯聚乙二醇(PEG Succinimidyl Propionate, PEG-SPA)、琥珀酰亞胺聚乙二醇(PEGSuccinimide，PEG-NHS)、醛類聚乙二醇(PEG-Aldehyde，PEG-ALD)等；可修飾羧基的聚乙二醇胺類衍生物(PEG-0-CH2CH2-NH2，PEG-NH2)；以及可修飾巰基的馬來酰亞胺聚乙二醇(PEG Maleimide，PEG-MAL)等。CN200480001775列舉了多種可與免疫球蛋白Fc片段連接的生理學活性多肽藥物，其中包括水蛭素，但是并沒有記載將免疫球蛋白Fc片段作為載體并通過聚乙二醇與目標蛋白相連的具體制備工藝。本發明人在研究中發現，當聚乙二醇作為連接物而在其兩端分別修飾免疫球蛋白 Fc片段以及水蛭素時，應首先保證Fc部分的均質性，因此，最好選用可在一定條件下穩定且特異性修飾1-氨基的醛類聚乙二醇衍生物。在這種情況下，水蛭素部分也應以醛基連接聚乙二醇，目的是降低連接物以及終產物制備過程的復雜性。但是，對于水蛭素來說，N端氨基酸的修飾可使其喪失活性。
發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的在于提供一種包含免疫球蛋白Fc 片段作為載體的長效抗凝多肽，其既保持原抗凝多肽的活性又使其血漿半衰期大大提高。本發明的另一目的在于提供所述長效抗凝多肽的制備方法。本發明的再一目的在于提供包含所述長效抗凝多肽的藥物組合物。本發明的還一目的在于提供所述長效抗凝多肽在制備防治血栓性疾病的藥物中的應用。根據本發明的目的，本發明提供了一種包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的長效抗凝多肽，所述長效抗凝多肽是由抗凝多肽分子通過聚乙二醇(PEG)與免疫球蛋白的Fc片段共價連接而成。根據本發明的另一目的，本發明提供了所述長效抗凝多肽的制備方法，其包括以下步驟al)將免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽與活化的PEG的一端共價連接；a2)從所得反應混合物中分離含有與所述PEG共價連接的免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽的復合物；以及a3)將免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽與所述分離復合物中PEG的另一端共價連接，得到含有與PEG各端連接的免疫球蛋白Fc片段和抗凝多肽的長效抗凝多肽。本發明提供的長效抗凝多肽，在保持抗凝多肽的原有抗凝活性基本不變的基礎上大大提高了藥物的血漿半衰期，延長了臨床給藥間隔時間，改善了抗凝藥品的使用性。
現通過以下實施方式并且結合附圖來進一步描述本發明的有益效果，應理解為這些實施方式僅用于例證的目的，不限制本發明的范圍，同時本領域普通技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發明范圍之內。
圖1為本發明中N-PEG化反應后收集N-PEG-Hirudin洗脫餾分的洗脫曲線圖譜。圖2A和圖2B分別為經純化N-PEG化水蛭素分子量的電噴霧質譜檢測結果以及尺寸排阻高效液相色譜純度檢測結果。圖3為本發明中K-PEG化反應后收集K-PEG化水蛭素洗脫餾分的洗脫曲線圖譜。圖4A和圖4B分別為經純化K-PEG化水蛭素分子量的電噴霧質譜檢測結果以及尺寸排阻高效液相色譜純度檢測結果。圖5為本發明中PEG化位點的檢測圖譜。圖6A和圖6B分別為長效水蛭素即HV2 (Lys47) _3. 4kPEG_Fc的聚丙烯酰胺凝膠電泳及尺寸排阻高效液相色譜的檢測結果。
具體實施例方式根據本發明的一方面，本發明提供了一種包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的長效抗凝多肽，所述長效抗凝多肽是由抗凝多肽分子通過聚乙二醇與免疫球蛋白的Fc片段共價連接而成。在本發明中，所述抗凝多肽為基因重組或天然來源的具有抗凝血作用的多肽，例如，水蛭素、比伐盧丁、阿加曲班等。抗凝多肽部分肽鏈的長度優選為12-100個氨基酸。在一個具體實施方式
中，抗凝多肽部分為基因重組水蛭素變體2 (HV2-Lys47)。HV2_Lys47部分優選通過賴氨酸殘基與聚乙二醇共價連接。在本發明中，所述聚乙二醇分子是線性的，并且兩端均有功能基團。所述功能基團可為醛基(ALD)、琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺碳酸酯(SC)或者是琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA)。聚乙二醇分子兩端的功能基團可以是一種，也可以是上述的基團中不同的兩種，優選均為醛基。聚乙二醇的分子量在500至60000道爾頓之間，優選在2000至5000道爾頓之間。在本發明中，所述的免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。所述的免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、CH2、CH3、CH4結構域中的1個到4個結構域組成。所述免疫球蛋白Fc片段還包含鉸鏈區。優選地，所述的免疫球蛋白Fc片段選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。更優選地，所述的免疫球蛋白Fc片段選自IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。還優選地，所述的免疫球蛋白Fc 片段是IgG4的Fc片段。在一個較佳實施方式中，所述的免疫球蛋白Fc片段為人非糖基化 IgG4Fc 片段。在本發明的一個優選實施方式中，所述抗凝多肽為水蛭素。本發明通過將同種雙功能基團聚乙二醇(ALD-PEG-ALD) —比一地修飾在水蛭素的特定賴氨酸殘基上，制備出高均質性的PEG化水蛭素，進而與免疫球蛋白Fc片段相連接，可得到既保持原水蛭素活性又使血漿半衰期大大提高的產物，即Hirudin-PEG-Fc。
在本發明中，藥物活性部分并不局限于基因重組來源的水蛭素，天然水蛭素或具有抗凝血作用的多肽都可以是本發明的應用對象，優選重組水蛭素。根據本發明的另一方面，本發明提供了所述長效抗凝多肽的制備方法，其包括以下步驟al)將免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽與活化的PEG的一端共價連接；a2)從所得反應混合物中分離含有與所述PEG共價連接的免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽的復合物；以及a3)將免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽與所述分離復合物中PEG的另一端共價連接，得到含有與PEG各端連接的免疫球蛋白Fc片段和抗凝多肽的長效抗凝多肽。所述制備方法可進一步包括以下步驟b)從反應液中分離純化所述長效抗凝多肽。其中，在步驟al)中，抗凝多肽和PEG以反應摩爾比例1 1. 25至1 25使用； 或免疫球蛋白Fc片段和PEG以反應摩爾比例1 5至1 10使用；且其中，在步驟a3)中，獲自步驟a2)的復合物與免疫球蛋白Fc片段或所述抗凝多肽以反應摩爾比例1 0. 5至1 20使用；其中所述PEG通過其自身兩端的反應性基團與抗凝多肽和免疫球蛋白Fc片段共價連接，其中所述PEG的反應性基團選自醛基、琥珀酰亞胺基丙酸酯、和羥基琥珀酰亞胺， 以及其中所述長效抗凝多肽中的抗凝多肽、PEG、免疫球蛋白Fc片段的摩爾比為 1:1:1。在上述方法中，所述醛基優選為丙醛基或丁醛基。在上述方法中，步驟(al)和(U)優選在還原劑的存在下進行，其中所述還原劑可選自氰基硼氫化鈉、硼氫化鈉、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。當所述抗凝多肽為水蛭素時，所述制備方法可包括以下步驟1)水蛭素的PEG化，即水蛭素與ALD-PEG-ALD進行親核反應；以及2) PEG化水蛭素與Fc進一步連接。其中，同種雙功能基團聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)與水蛭素反應方法的條件為1)將所述ALD-PEG-ALD與水蛭素在堿性緩沖液中混合，在氰基硼氫化鈉(SCB)的存在下進行反應，反應的PH為7 11，優選9.5 ；2)混合的比例為5 1 25 1，優選20 1 ；3)反應溫度為1 °C 40°C，優選4°C ；4)水蛭素濃度為 0. lmg/mL 100mg/mL，優選 5mg/mL ；5)反應時間為1小時 M小時，優選1小時。另外，水蛭素的PEG化還涉及到將特異性位點單修飾水蛭素從上述反應液中分離出來的一步純化方法。在該純化方法中，純化所用吸附劑為陽離子交換吸附劑，所述陽離子交換吸附劑可以為強陽離子交換吸附劑，如磺丙基型(SP)吸附劑，也可以為弱陽離子交換吸附劑，如羧甲基型(CM)吸附劑，優選強陽離子型離子交換吸附劑。
根據本發明的再一方面，本發明提供了包含所述長效抗凝多肽的藥物組合物，其包含本發明的長效抗凝多肽以及適量的藥劑學上可接受的輔料。本發明的藥物組合物可通過任何可行的常規途徑施用，例如注射、口服等，優選注射途徑。由于在口服給藥時某些抗凝多肽會被消化，因此口服給藥組合物的活性成分應被特殊配制或者包裹以保護其在胃中免于降解。對口服給藥而言，藥劑學上可接受的輔料可包括賦形劑、崩解劑、分散劑、粘合劑等。對注射給藥而言，藥劑學上可接受的輔料可包括緩沖劑、穩定劑、增溶劑等。本發明的藥物組合物可與藥劑學上可接受的輔料組合制備成各種劑型，例如片劑、膠囊劑、注射液等。根據本發明的還一方面，本發明提供了所述長效抗凝多肽在制備防治血栓性疾病的藥物中的應用。所述血栓性疾病是由以下兩種病理過程所引起的疾病1)血栓形成是指在一定條件下，血液有形成分在血管(多數為小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞、相應部位血供障礙的病理過程。依血栓組成成分可分為血小板血栓、紅細胞血栓、纖維蛋白血栓、混合血栓等4種。按血管種類可分為動脈性、靜脈性及毛細血管性血栓。2)血栓栓塞是血栓由形成部位脫落，在隨血流移動的過程中部分或全部堵塞某些血管，引起相應組織和(或)器官缺血、缺氧、壞死(動脈血栓)及瘀血、水腫(靜脈血栓)的病理過程。本發明采用了獨特的反應條件及純化手段，將同種雙功能基團聚乙二醇 (ALD-PEG-ALD) 一比一地修飾在水蛭素的特定賴氨酸殘基上，從而可制備出高均質性的 PEG化水蛭素，進而，通過將其與免疫球蛋白Fc片段連接，可得到既保持原水蛭素活性又使血漿半衰期大大提高的產物，即Hirudin-PEG-Fc。從以下實施例中可更好地理解本發明，然而這些實施例僅為舉例說明，而不應被認為是對本發明的限制。如無特別說明，在以下實施例中所用原料均為市售產品。實施例1 雙功能基團聚乙二醇(propionaldehyde-3. 4KPEG-propionaldehyde, ALD-PEG-ALD)單修飾水蛭素HV2 (Lys47)的制備1) PEG化反應及產物分離①N端修飾PEG化(N-PEG化)水蛭素的制備反應所用的水蛭素為第47位天冬酰胺突變成賴氨酸的變體2 (HV2 (Lys47))，氨基酸序列為 ITYTDCTESG QNLCLCEGSN VCGKGNKCILGSNGKGNQCV TGEGTPKPES WGDFEEIPEE YLT, 由重組畢赤酵母表達而來，通過反相高效液相色譜分析其純度，結果大于95%。反應體系為16mg水蛭素，濃度為5mg/mL ；溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液(pH6. 0)；以水蛭素聚乙二醇 =1 10的摩爾比添加聚乙二醇；并添加氰基硼氫化鈉(SCB)至其終濃度為20mM ；4°C下反應1小時。采用AKTAexplorer 100型蛋白純化系統(GE Healthcare)以及強陰離子交換色譜柱Source Q(16mm I. D.，105mL，GE Healthcare)進行純化。首先以流動相A即20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7. 5)平衡色譜柱，并通過超濾將上述步驟所得反應混合物的緩沖液更換為同流動相A相同的緩沖液，之后進行上樣，流速為3ml/min，并進行沖洗，然后以梯度方式進行洗脫，流動相B為在流動相A中添加IM氯化鈉而成，洗脫條件為先以10% B等度洗脫3倍柱體積，后在6倍柱體積內由10%B升至20%B。洗脫圖譜如圖1所示。收集所標示的洗脫峰，分別用尺寸排阻高效液相色譜(所用儀器型號為Agilent 1200型高效液相色譜儀)及電噴霧-離子阱質譜(HCT Series, Bruker Daltonics)進行純度測定及鑒定， 結果分別如圖2A和2B所示。由圖2A所示質譜結果推算的分子量可以判定圖1所標示洗脫峰所收集的反應產物應為雙功能團聚乙二醇單修飾水蛭素HV2，從圖2B所示尺寸排阻高效液相色譜結果可以判定圖1所標示的洗脫峰中收集的反應產物純度為97%，進一步根據本反應的具體反應條件可知所得產物應為N端修飾PEG化(N-PEG化)水蛭素。②賴氨酸修飾PEG化(K-PEG化)水蛭素的制備反應所用的水蛭素為第47位天冬酰胺突變成賴氨酸的變體2 (HV2 (Lys47))，氨基酸序列為 ITYTDCTESG QNLCLCEGSN VCGKGNKCILGSNGKGNQCV TGEGTPKPES WGDFEEIPEE YLT, 由重組畢赤酵母表達而來，通過反相高效液相色譜分析其純度，結果大于95%。反應體系為30mg水蛭素，濃度為5mg/mL ；溶劑為IOOmM硼酸(pH 9. 5)水溶液；以水蛭素聚乙二醇=1 15的摩爾比添加聚乙二醇；并添加氰基硼氫化鈉(SCB)至其濃度為20mM;4°C下反應1小時。采用AKTA explorer 100型蛋白純化系統(GE Healthcare)以及強陽離子交換色譜柱Source S (16mm I. D.，105mL，GE Healthcare)進行純化。首先以流動相A即2OmM醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH 3. 5)平衡色譜柱，并通過超濾將上述步驟所得反應混合物的緩沖液更換為同流動相A相同的緩沖液，之后進行上樣，流速為3ml/min，并進行沖洗，然后以梯度方式進行洗脫，流動相B為在流動相A中添加IM氯化鈉而成，洗脫條件為流速3ml/min， 在20分鐘內由0% B升至20% B。洗脫曲線如圖3所示。收集所標示的洗脫峰，并分別用尺寸排阻高效液相色譜(所用儀器型號為Agilent 1200型高效液相色譜儀，TOSOH TSKgel G2000SWxl色譜柱)及電噴霧-離子阱質譜(HCT Series, BrukerDaltonics)對其進行純度測定及鑒定，結果分別如圖4A和圖4B所示。由圖4A所示質譜結果推算的分子量可以判定圖3所標示洗脫峰所收集的反應產物應為雙功能團聚乙二醇單修飾水蛭素HV2，從圖 4B所示尺寸排阻高效液相色譜結果可以判定圖3所標示的洗脫峰中收集的反應產物純度為91. 9 %，進一步根據本反應的具體反應條件可知所得產物應為賴氨酸修飾PEG化(K-PEG 化)水蛭素。2) PEG化位點的檢測首先，對上述步驟所得的2種PEG化水蛭素產品進行酶切。水解酶為 Trypsin (Promega)，酶切反應條件50 μ g 樣品溶于 50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，8M 尿素，50mM DTT，65°C，30min，加入終濃度為IOOmM的碘乙酸鈉，室溫，避光，40min，更換緩沖液為50mM Tris-HCKpH 8. 0), ImM CaCl2，樣品Trypsin = 50 1 (W/W)，37°C 下水解 16 小時。然后，對酶水解產物進行反相高效液相色譜分析。采用安捷倫1200高效液相色譜系統以及 YMC-PackODS-A (5 μ m, 25cm χ 0. 46cm i. d.)色譜柱，流動相 A 為 0. 1 % TFA/ 水，流動相 B 為 0. 1 % TFA/90 %乙腈，流速為lml/min，進樣體積50 μ L，梯度洗脫(0 70min內，5 % B 60% B)，在214nm進行檢測。結果由圖5所示，圖5中各色譜峰所代表的肽段由電噴霧-離子阱質譜儀(HCT Series, Bruker Daltonics)所鑒定。根據圖5所得數據在下表中列出表 權利要求
1.一種包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的長效抗凝多肽，其特征在于，所述長效抗凝多肽是由抗凝多肽分子通過聚乙二醇與免疫球蛋白的Fc片段共價連接而成。
2.權利要求1所述的長效抗凝多肽，其中，所述聚乙二醇的分子為線性并且兩端均有功能基團，分子量在500至60000道爾頓之間，兩端的功能基團為獨立地選自于醛基、琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺碳酸酯以及琥珀酰亞胺丙酸酯。
3.權利要求1或2所述的長效抗凝多肽，其中，所述聚乙二醇的分子量在2000至5000 道爾頓之間，并且所述聚乙二醇的分子兩端的功能基團為醛基。
4.權利要求1或2所述的長效抗凝多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的， 是由選自CH1、CH2、CH3、CH4結構域中的1個到4個結構域組成，且同時還包含鉸鏈區。
5.權利要求1或2所述的長效抗凝多肽，其中，所述抗凝多肽的肽鏈長度為12-100個氨基酸，所述長效抗凝多肽中的抗凝多肽、PEG、免疫球蛋白Fc片段的摩爾比為1 1 1。
6.權利要求1至5中任一項所述的長效抗凝多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc片段選自 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。
7.權利要求6所述的長效抗凝多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc片段選自IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4的Fc片段以及它們的組合和雜合體組成的組。
8.權利要求7所述的長效抗凝多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4的Fc片段。
9.權利要求8中所述長效抗凝多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc片段是人非糖基化 IgG4Fc 片段。
10.權利要求1至9中任一項所述的長效抗凝多肽，其中，所述抗凝多肽為水蛭素。
11.權利要求10所述的長效抗凝多肽，其中，所述抗凝多肽為基因重組水蛭素變體2， 所述基因重組水蛭素變體2通過賴氨酸殘基與所述聚乙二醇共價連接。
12.一種制備如權利要求1至11中任一項所述的長效抗凝多肽的方法，包括以下步驟al)將免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽與活化的聚乙二醇的一端共價連接； a2)從所得反應混合物中分離含有與所述聚乙二醇共價連接的免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽的復合物；以及a3)將免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽與所述分離復合物中聚乙二醇的另一端共價連接，得到含有與聚乙二醇各端連接的免疫球蛋白Fc片段和抗凝多肽的長效抗凝多肽。
13.權利要求12所述的方法，其中， 在步驟al)中，抗凝多肽和聚乙二醇以反應摩爾比例1 1.25至1 25使用； 免疫球蛋白Fc片段和聚乙二醇以反應摩爾比例1 5至1 10使用； 在步驟a3)中，獲自步驟a2)的復合物與免疫球蛋白Fc片段或所述抗凝多肽以反應摩爾比例1 0.5 至1 20使用。
14.如權利要求12或13所述的制備長效抗凝多肽的方法，其中，步驟al)和a3)是在還原劑存在下進行的。
15.如權利要求14所述的制備長效抗凝多肽的方法，其中，所述還原劑為選自于氰基硼氫化鈉、硼氫化鈉、硼酸二甲胺以及硼酸吡啶中的一種或者多種。
16.如權利要求12或13所述的制備長效抗凝多肽的方法，其中，所述聚乙二醇通過其自身兩端的反應性基團與抗凝多肽和免疫球蛋白Fc片段共價連接。
17.如權利要求12或13所述的制備長效抗凝多肽的方法，所述聚乙二醇的反應性基團選自于醛基、琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺碳酸酯以及琥珀酰亞胺丙酸酯。
18.如權利要求12或13所述的制備長效抗凝多肽的方法，所述長效抗凝多肽中的抗凝多肽、聚乙二醇、免疫球蛋白Fc片段的摩爾比為1 1 1。
19.如權利要求12或13所述的制備長效抗凝多肽的方法，其中，所述聚乙二醇的反應性基團為醛基。
20.如權利要求19所述的制備長效抗凝多肽的方法，其中，所述醛基為丙醛基或丁醛基。
21.一種用于預防和/或治療血栓性疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含權利要求1至11中任一項所述的長效抗凝多肽以及適量的藥劑學上可接受的輔料。
22.權利要求1至11中任一項所述的長效抗凝多肽在制備預防和/或治療血栓性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的長效抗凝多肽及其制備方法，其中，所述長效抗凝多肽是由抗凝多肽分子通過聚乙二醇與免疫球蛋白的Fc片段共價連接而成。本發明還提供了所述長效抗凝多肽在制備預防和/或治療血栓性疾病的藥物中的應用，以及包含所述長效抗凝多肽的藥物組合物。本發明提供的長效抗凝多肽，在保持抗凝多肽的原有抗凝活性基本不變的基礎上大大提高了藥物的血漿半衰期，延長了臨床給藥間隔時間，改善了抗凝藥品的使用性。
文檔編號A61K38/58GK102309765SQ20111004799
公開日2012年1月11日 申請日期2011年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者劉家望, 周小平, 張磊, 文圣煥, 李炳善, 杜伯雨, 楊依麗, 薛劍鋒, 連忠輝 申請人:北京韓美藥品有限公司