專利名稱：：L-核糖-lna類似物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及L-核糖-構型雙環狀核苷類似物領域，以及用于合成寡核苷酸形成的核苷酸類似物的合成，該合成寡核苷酸可形成具有互補單鏈與雙鏈核酸的核堿基特定性雙顯性組合(duplexes)。本發明還涉及可用來作為治療藥物并可結合于寡核苷酸的L-核糖-構型雙環狀核苷類似物的領域。
背景技術：
：合成寡核苷酸是在不同領域廣泛使用的化合物，例如用于分子生物及以DNA為基礎的診斷和治療。綜合考慮為了廣泛地用于不同的應用范圍，寡核苷酸必須滿足許多不同的要求。以作為治療劑為例，有用的寡核苷酸必須能夠穿過細胞膜，具有良好的抗細胞外及細胞內核酸酶的性能，優選具有補充如RNAseH的內源酶的能力。在以DNA為基礎的治療及分子生物學中，其它性能，例如寡核苷酸對于作用在天然核酸的大量不同酶成長作為有效基質的能力很重要，該天然核酸如聚合酶、激酶、連接酶和磷酸酶。然而，各種用途的基礎是寡核苷酸的基本性能寡核苷酸可辨識和雜交互補單鏈核酸的特異性序列，采用Watson-Crick氫鍵(A-TandG-C)或其它氫鍵結構如Hoogsteen模式。有兩個重要術語即親和力和特異性，常用于表現寡核苷酸的雜交性能。親合性為該寡核苷酸對其互補目標序列的鍵合強度的測量(用該雙顯性組合的熱穩定性(Tm)表示)。該雙顯性組合中各核堿基對增加熱穩定性，因此親合性隨該寡核苷酸尺寸(核堿基)增大而增加。特異性為該寡核苷酸在完全互補和錯配目標序列之間的辨別能力的測量。換言之，特異性為目標物中與錯配核堿基有關的親合性損失的測量。在寡核苷酸尺寸恒定時，特異性隨著該寡核苷酸及其目標物之間的錯配數目增加而增加(亦即，錯配的百分比增加)。反之，在錯配數目恒定時，當寡核苷酸尺寸增加時，特異性會減少(即錯配的百分比減少)。換言之，寡核苷酸親合性的增加是以犧牲其特異性為代價的，反之亦然。—般而言，考慮到天然寡核苷酸的缺點，增強特異性及親合性的新方法對于以DNA為基礎的治療、診斷及對于分子生物技術極為令人期待。受構型限制的核苷已知寡核苷酸在雜交成為目標序列期間會經過構型轉化，由單鏈態的相對任意線圈結構變成雙顯性組合態的規則結構。因此，構型限制近年來已應用在寡核苷酸，以尋找較未改性(2’_脫氧)寡核苷酸顯示改良的雜交性能。例如具有附加的C-3’、C-5’-橋亞乙基的雙環[3.3.0]核昔(M.Tarkoy3M.Bolli,B.SchweizerandC.Leumann,Helv.Chem.Acta,1993,76,481；TarkdyandC.Leumann,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,1993,32,1432；M.Egli,P.Lubini,Μ.DoblerandC.Leumann,J.Am.Chem.Soc.,1993115,5855；M.Tark5y,M.BolliandC.Leumann,Helv.Chem.Acta,1994,77,716；M.BolliandC.Leumann,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,1995,34,694；M.Bolli,P.LubiniandC.Leumann,Helv.Chem.Acta,1995,78,2077；J.C.Litten,C.EppleandC.Leumann,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1995,5,1231；J.C.Litten,C.Leumann,Helv.Chem.Acta,1996,79,1129；M.Bolli,J.C.Litten,R.SchiiltzandC.Leumann,Chem.Biol.,1996,3,197；M.Bolli,H.U.TrafeletandC.Leumann,NucleicAcids徹8.，1996，24，4660)、具有一附加(-1，、(-6，或C_6，、C_4，-橋亞甲基的雙碳環[3.1.0]核苷(K.-H.Altmann,R.Kesselring,Ε.FrancotteandG.Rihs,TetrahedrnLett.,1994,35,2331；K.-H.Altmann,R.Imwinkelried,R.KesselringandG.Rihs,TetrahedronLett.,1994,35,7635；V.Ε..Marquez,Μ.A.Siddiqui,Α.Ezzitouni,P.Russ,J.Wang,R.W.WagnerandM.D.Matteucci,J.Med.Chem.,1996,39,3739；A.EzzitouniandV.E.Marquez,J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1，1997，1073)、含有一與一未經改性核苷合成為二聚物的附加C-2’、C-3’-二氧戊環的雙環狀[3.3.0]-和[4.3.0]核苷，其中該附加環為核苷間鍵替代天然磷酸二酯鍵的部份(R.J.Jones,S.Swaminathan,J.F.Millagan,S.Wadwani,B.S.FroehlerandΜ.Matteucci,J.Am.Chem.Soc.,1993,115,9816；J.WangandM.D.Matteucci，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，229)、包含一具有C_2，、C_3，-橋亞甲基作為酰胺及磺酰胺型核苷間鍵部份的二聚物(C.G.Yannopoulus,W.Q.Zhou,P.Nower,D.Peoch,Y.S.SanghviandG.Just,Synlett，1997，378)、雙環狀[3.3.0]葡萄糖衍生的核苷類似物透過甲醛核苷間鍵加入三聚物中間(C.G.Yannopoulus,W.Q.Zhou，P.Nower,D.Peoch,Y.S.SanghviandG.Just,Synlett,1997，378)，具有C_2，、C-3，連接六元環和五元環的雙環狀[4.3.0]-與[3.3.0]核苷(P.Nielsen,H.Μ.Pfundheller,J.Wenge1,Chem.Commun.,1997,826；P.Nielsen,H.Μ·Pfundheller,Jffengel,XIIInternationalRoundtable!Nucleosides,NucleotidesandTheirBiologicalApplication；LaJolla,California,September15-19,1996；PosterPPI43)已合成并結合到寡脫氧核苷酸中。在所發現的適度改善雙顯性組合穩定性的情形中，僅涉及DNA或RNA目標物，或關于完全改性而非部分改性的寡核苷酸，反之亦然。已經報告的大部分類似物的評估，由于缺乏含G、A及C核堿基類似物的數據，以及缺乏指示雜交特異性及雜交模式數據，因而益發復雜。在許多情形中，已經報告單體類似物的合成極為復雜，而在另外一些情況下，完全改性寡核苷酸的合成與廣為人使用的標準phosphoramidite化學不兼容。近來，已報導含鎖定核酸(LNA)的寡聚物(Nielsen,P.，Pfundheller,H.M.，Olsen,C.E.andWenge1.J.,J.Chem.Soc.,PerkinTrans.1,1997,3423；Nielsen,P.,Pfundheller,H.Μ.,Wenge1,J.,Chem.Commun.,1997,9,825；Christensen,N.K.,Petersen,Μ.,Nielsen,P.,Jacobsen,J.P.andffengel,J.,J.Am.Chem.Soc.,1998,120,5458；Koshkin,A.A.andffengel,J.，J.Org.Chem.，1998,63,2778；Obika,S.，Morio.K.-I.，Han,Y.andImanishi,Τ.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，515)。令人感興趣的是，含有2’-0,4'-C-橋亞甲基LNA單體結合到寡核苷酸序列導致該改性寡核苷酸雜交能力前所未有的改善(Singh,S.K.,Nielsen,P.,Koshkin,Α.Α.,Olsen,C.Ε.andffengel,J.,Chem.Commun.,1998,455；Koshkin,Α.K.,Singh,S.K.,Nielsen,P.,Rajwanshi,V.K.,Kumar,R.,Meldgaard,Μ.,Olsen,C.Ε.,andWenge1,J.,Tetrahedron,1998,54,3607；Koshkin,A.A.Rajwanshi,V.K.,andWengel,J.,TetrahedronLett.,1998,39,4381；Singh,SanjayK.andWenge1,J.,Chem.Commun.,1998,1247；Kumar,R.,Singh,S.K.,Koshkin,A.A.Rajwanshi,V.K.,Meldgaard,Μ.,andWenge1,J.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219；Obika,S.etal.TetrahedronLett.,1997,38,8735；Obika,S.etal.TetrahedronLett.，1998，39，5401；Singh,S.K.,Kumar,R.,andffengel,J.，J.Org.Chem.，1998，63，6078；Koshkin,Α.A.,Nielsen,P.,Meldgaard,Μ.,Rajwanski,V.K.,Singh,S.K.andWengel,J.,J.Am.Chem.Soc.,1998,120,13252；Singh,S.K.,Kumar,R.,andWenge1,J.,J.Org.Chem.,1998，63，10035)。包含這種LNA單體的寡核苷酸和對應的2，-硫-LNA類似物與互補的DNA和RNA形成具有熱穩定性且以前未曾發現的雙-或三環狀核苷改性寡核苷酸(△Tm/改性=+3至+irC)的雙顯性組合，并表現改善的選擇性。在一系列論文中，Seela等人已研究包括單一或多個2’-脫氧-β-D-木糖呋喃糖基核苷酸單體(Rosemeyer，H.；Seela,F.Helv.Chem.Acta1991,74,748；Rosemeyer,H.；Krecmerova,M.；Seela,F.Helv.Chem.Acta1991,742054；Seela,F.；Worrier,Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1994,77,883；Seela,F.；Heckel,Μ.；Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1996,79,1451；Rosemeyer,H.；Seela,F.NucleosidesNucleotides,1995,14,1041；Schoeppe,Α.；Hinz,H.-J.；Rosemeyer,H.；Seela,F.Eur.J.Biochem.1996,239,33)的木-DNA(圖1，堿基=腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基、鳥嘌呤-9-基或胸腺嘧啶-1-基)。與對應的天然2’-脫氧-β-D核糖呋喃糖基相比，一般而言，木-DNA表現出如同鏡像的二級結構，此為在熵方面有利的雙顯性組合結構，對于外切核酸酶有增加的穩定性，對于包含少量2’-脫氧-β-D-木糖呋喃糖基單體的寡核苷酸，對互補DNA有減少的熱親合性(Rosemeyer,H.；Seela,F.Helv.Chem.Acta1991,74,2054；Seela,F.；Worner,Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1994,77,883；Seela,F.；Heckel,M.；Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1996，79，1451)。
發明內容基于上述及2’-0,4'-C-亞甲基橋連的LNA單體卓越的性能，決定合成包含單一或多個2’_0，4’-C-亞甲基-a-L-核糖呋喃糖基核苷酸單體。α-L-核糖-LNA計算機模式同樣地指出呋喃糖環的S型構型。故而，這項工作的目的在于合成2’-0,4'-C-亞甲基-a-L-核糖呋喃糖基核苷酸單體以及研究含此單體的寡核苷酸的熱穩定性。結果顯示，改性的L-核糖-LNA有助于互補核酸的高親合性靶標。當慮及在C-3’和C-4’轉化的立體化學性質時，這是一個令人驚訝的事實。因此，本發明人提供了新型的LNA核苷類似物(L-核糖-LNA)及其中包含具有L-核糖-LNA核苷類似物的寡核苷酸。利用胸腺嘧啶作為核堿基合成該新型L-核糖-LNA核苷類似物，但可以利用其它四個核堿基輕易合成，因此，提供了用于結合寡核苷酸的全組核苷類似物。本發明涉及包含至少一種如通式I的核苷類似物(后文稱為”L-核糖-LNA”)的寡聚物權利要求1.一種寡聚物，含有至少一種通式Ia的核苷類似物，其中X選自-0-;B為核堿基，選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二胺基曙呤、8-氧基-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶、N6，N6-乙醇-2，6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、擬異-胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤或肌苷；P表示與后一單體連接的核苷間鍵的自由基位置、或5’-端基；P*表示與前一單體連接的核苷間鍵的自由基位置、或3’-端基；R2*與R4*—起表示-O-CH2-的雙自由基，在此取代基R1*、R2>R3*、R5>R5*分別為氫；和其堿性鹽類和酸加成鹽類。2.如權利要求1所述的寡聚物，包括1至9個通式Ia的核苷類似物及0至13個選自天然產生的核苷。3.如權利要求2所述的寡聚物，其中該寡核苷酸包括至少7個連續所述核苷類似物單體。4.如權利要求2所述的寡聚物，其中該寡聚物的所有核苷單體為所述核苷類似物。5.如權利要求1所述的寡聚物，其中所述核苷類似物的任一核苷間鍵選自由2至4個選自-CH2-、-0-、-P0(R”)-、和-PO(NHRh)-的基團/原子組成的鍵，其中Rh選自氫或C1^-燒基，R”選自Ci-6~焼基。6.如權利要求1所述的寡聚物，其中P為選自氫、羥基、Cp6-烷基、CV6-烷氧基、或芳氧基的5’-端基。7.如權利要求1所述的寡聚物，其中P*為選自氫、羥基或芳氧基的3’-端基。8.如權利要求1所述的寡聚物，其中B為核堿基，選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞啼唆、5-甲基胞嘧啶或尿嘧啶。9.如權利要求1所述的寡聚物，具有下式IIIG-[Nu-L]n(0)-{[(L-核糖-LNA)-L]m(q)-[Nu_L]n(q)}q-G*111其中q為1至50;各n(0)，···，n(q)分別為0至10000；各m(l)，···，m(q)分別為1至10000；條件為n(0)，...，n(q)及m(l)，···，m(q)的總和為2至15000；G表示5’-端基；各Nu分別表示選自天然核苷的核苷；各L分別表示介于選自Nu或L-核糖-LNA兩基團之間的核苷間鍵，或L與(T表示3’-端基；且各L-核糖-LNA-L分別表示該通式Ia的L-核糖-LNA核苷。10.一種含有至少一種通式IIa的核苷類似物的核苷，11.如權利要求10所述的核苷，其中B為核堿基，選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或尿嘧啶。12.如權利要求10所述的核苷，其中該核苷應用在制備權利要求1中的寡聚物。13.如權利要求10所述的核苷，其中核苷的結合調整寡核苷酸作為核酸活化酶基質的能力。14.如權利要求10所述的核苷，其中該核苷應用在制備寡聚物的軛合物以及選自蛋白質、擴增基因、酶、多醣類、抗體、半抗原、肽和PNA的化合物。15.如權利要求10所述的核苷，其中該核苷作為核酸上酶活性基質的應用。16.如權利要求15所述的核苷，其中該核酸上酶活性為DNA與RNA聚合酶。17.如權利要求10所述的核苷，其中該核苷應用在制備治療藥物。18.如權利要求10所述的核苷，其中該核苷應用在構成固體表面，該固體表面上已經連接不同序列的經LNA改性的寡核苷酸。19.如權利要求1所述的寡聚物在目標核酸序列特異性裂解中的應用。20.如權利要求1所述的寡聚物，其中該寡聚物應用在用作為反訊息、反基因或基因活化的藥物組合物。21.如權利要求20所述的寡聚物，其中該寡聚物補充RNAseH。22.如權利要求1所述的寡聚物，其中該寡聚物包括多于一種該通式Ia的核苷類似物改性的寡核苷酸復合物在用作為反訊息、反基因或基因活化的藥物組合物。23.如權利要求1所述的寡聚物在制備用于治療癌癥的藥物中的應用，其中該寡聚物會特定地與選自tRNAs、rRNAs、snRNAs和scRNAs的RNA相互作用，從而抑制任何選自翻譯、RNA拼接、RNA處理及其它主要細胞處理的細胞處理。24.如權利要求1所述的寡聚物在用于天然或合成核酸的分離、純化、擴增、檢測、辨識、定量或捕獲中的應用。全文摘要本發明涉及L-核糖-LNA類似物。核苷類似物，其中，用在C-3’與C-4’轉化的立體化學合成2’-4’-橋接鎖定核苷構型的核苷類似物，以提供L-核糖-構型LNA核苷。該L-核糖-LNA-核苷合成可應用于所有核堿基，該核堿基包含胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶。這些具有L-核糖-構型的鎖定核酸(LNA)已用于2’-O-4’-亞甲基-α-L-核糖呋喃糖基核苷酸以及其中含有L-核糖-LNA核苷酸的寡核苷酸的合成。利用這些L-核糖-LNA改性寡核苷酸，借助它們對于互補核酸的高親和性，大幅改善靶標互補核酸的方法。文檔編號A61K48/00GK102180924SQ201110034608公開日2011年9月14日申請日期2000年5月4日優先權日1999年5月4日發明者葉斯佩爾·文格爾申請人:桑塔里斯制藥公司