抗大腸桿菌TolC二十三肽的抗體及應用的制作方法

專利名稱：抗大腸桿菌TolC二十三肽的抗體及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗大腸桿菌TolC片段的抗體。
背景技術：
近年來細菌耐藥日趨嚴峻，成為醫藥界倍受關注的問題。由于抗生素濫用造成細菌耐藥性問題尤為突出。我國臨床分離的一些細菌對某些藥物的耐藥性已居世界首位。除耐青霉素的肺炎鏈球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、腸球菌、真菌等多種耐藥菌外，進入我國僅20多年的喹諾酮類抗生素的耐藥率已經達60% - 70%。據報道，包括廣州在內的國內一些大城市人群感染的金黃色葡萄球菌中，80%已經產生了對青霉素G的耐藥性。凱福隆、頭孢三嗪等第三代的頭孢類菌抗生素的應用已日趨普遍，抗生素品種的選用明顯超前。抗生素的濫用主要是由于抗生素生產和銷售管理薄弱、臨床的誤用和濫用、以及將抗生素作為生長促進劑在動物養殖中廣泛使用所導致。由于在抗生素使用與病原菌耐藥水平之間存在著一種宏觀的量化關系，即一定范圍內的抗生素使用可以導致病原菌整體耐藥水平以及耐藥菌感染率的變化。由此，人和動物的腸道正常菌群暴露于抗生素而普遍產生耐藥性，并通過糞便直接污染環境、水、食品，導致耐藥菌不斷增加，也使人體接觸耐藥菌的機會不斷增加。因此耐藥菌的種類非常廣泛。這樣一來，人體如果再獲得耐藥菌的感染治療起來就比較困難。因此，控制目前已經廣泛存在的耐藥菌已成為一個重要的社會和科學問題。耐藥菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的發現和發明，因為抗生素的生產與發展伴隨著細菌耐藥性的不斷發展，一種新的抗生素投入使用后，很快就發現有相應的抗性菌株出現。在細菌中普遍存在的抗藥性是對抗菌藥物的生產開發及對細菌性疾病防治的一個巨大挑戰，直接危害食品安全和人類健康。對細菌耐藥機理的深入研究，發現其作用靶點是解決這一難題的關鍵。業已報道，大腸桿菌外膜蛋白TolC是耐藥關鍵蛋白，是AcrAB-TolC藥物外排系統中重要組成組分。我們先前證明，采用抗TolC可以負調TolC的耐藥作用，起到靶向抑制耐藥菌生長的目的，但其作用的靶序列不清楚。我們先前采用的抗TolC的抗體，是針對整個 TolC蛋白。根據生物信息分析，整個TolC蛋白具有線性B細胞表位27個，此外還有非線性B細胞表位。由于每個表位均能夠刺激機體產生免疫應答，故針對整個TolC蛋白至少可以產生27個各自表位特異性的抗體。由于各表位氨基酸序列不同，其生物學功能亦具有差異，抗體作用后產生的效應亦存在差異。此外，抗體也存在一定的交叉反應，可以跨物種進行反應，即所謂的抗體異嗜性現象。因此，采用針對整個蛋白的特異性抗體，具有靶序列特異性不明確、副反應不清楚的不足，不利于其有關成藥特性的研究。

發明內容
本發明的目的是在于針對現有技術的不足，提供一種針對TolC耐藥關鍵結構域的抗體，以克服目前的抗體具有靶序列特異性不明確、副反應不清楚的的缺陷，提高抗體的有效性和安全性。
本發明通過以下技術方案實現上述目的
發明提供了一種大腸桿菌(五coh·) TolC抗原，包括如SEQ ID N0:1 (SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM)所示的序列。本發明也提供了一種抗原，由上述大腸桿菌ToIC抗原與血藍蛋白偶連。同時發明保護了編碼如權利要求1所述大腸桿菌TolC抗原的基因片段，具有SEQ ID N0:2 所示的序列。SEQ ID NO:2 5'-TCT GAC ACC TCT TAT AGC GGT TCG AAA ACC CGT GGT GCC GCT GGT ACC CAG TAT GAC GAT AGC AAT ATG -3，。上述兩種抗原可用于制備抗體，所產生的抗體可以與大腸桿菌外膜蛋白TolC特異結合，從而抑制細菌的耐藥性。該抗體具有針對SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽，由以下方法獲得根據NCBI公布的五coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪片段(命名為TolC-二十三肽)，合成多肽產物與血藍蛋白偶連以提高免疫原性。將人工合成SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段和血藍蛋白的偶連物與福氏完全佐劑混合均勻形成油包水乳劑，注射免疫動物，注射量100微克-1 毫克/只；其后采用福氏不完全佐劑；每次間隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低溫下靜置，使血清自然析出。可以優選以下方法制備將人工合成SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段即TolC-二十三肽和血藍蛋白的偶連物500μβ用水溶解成終體積500μ 作用，與福氏完全佐劑按照1:1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，采用背部多點注射免疫動物家兔，注射量每千克動物體注射為500μβ/只(以偶連物的重量計算)；其后采用福氏不完全佐劑，每次間隔2周，第3次免疫后的第10天，心臟取血，擺成最大斜面后在 4°C冰箱中靜置過夜，使血清自然析出。以未與血藍蛋白偶連的合成多肽產物為抗原，采用 Dot-ELISA技術測定效價為1:10000。本發明提供的抗體，可用于制備抑制細菌耐藥性藥物；所述的細菌為大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、克氏檸檬酸桿菌、戴阿利斯特桿菌屬、肺炎克雷伯菌或鏈霉菌。通過大量的試驗證明，本發明的針對SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽特異性抗體 (即抗TolC- 二十三肽)，可以與大腸桿菌TolC基因編碼蛋白TolC的關鍵耐藥結構域結合， 具有非常特異、穩定的靶向性作用，從而抑制耐藥菌的耐藥性。為了進一步驗證發明的有效性和抗耐藥機理，本發明采用基因突變技術，構建了大腸桿菌1TolC片段SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的突變體I^olC〗。通過抑菌試驗，證明該突變體的耐藥功能較野生型明顯下降。這些結果表明，TolC片段SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM對iTolC的耐藥功能至關重要。接著制備了iTolC 片段 SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM 的抗體(抗 TolC-二十三肽)，采用體外抗體靶向療法，證明抗TolC-二十三肽能夠在含四環素的培養基中明顯抑制包括耐藥大腸桿菌在內的該種細菌的生長。經抗TolC-二十三肽處理后的細菌，其生長被抑制的程度與同條件培養下抗TolC處理的生長情況一致。此結果說明TolC片段 SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM 是抗 iTolC 負調 iTolC 耐藥功能的作用靶點。進一步建立了大腸埃希菌外陰感染小鼠模型，通過抗TolC-二十三肽配合低濃度慶大霉素可以明顯抑制小鼠外陰細菌感染的試驗，進一步證明TolC片段SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪是抗TolC負調TolC作用的靶點。研究結果表明，抗TolC-二十三肽靶向療法能夠明顯抑制耐藥菌的生長，為耐藥菌抗體靶向療法提供了一個有效的作用靶點。本發明通過構建TolC片段的突變體TolC2，以及制備針對此片段即SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪的抗血清，尋找到最為關鍵的TolC抗體靶向抑制耐藥菌生長的作用靶點——SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM，從而建立針對性強、目標明確的抗體靶向作用提高耐藥菌對抗生素敏感性的技術方法。同時針對該結果，提供了抗 TolC- 二十三肽，作為抗大腸桿菌TolC的抗體，該抗體所針對的氨基酸序列僅為23個氨基酸，經預測不含有B細胞表位。我們制備的針對該序列的特異性抗體可靈敏而特異地結合到靶向位點上，從而克服了現有技術中的多個B細胞表位容易產生抗體異嗜性、靶序列特異性不明確、副反應不清楚等缺陷，使用更安全。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
(1)本發明經過大量實驗的摸索和篩選，發現抗TolC片段SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的抗體對抑制細菌耐藥性有重要的作用，其特異性非常強，效價高，在抑菌應用中可以大大降低抗生素的使用量；
(2)明確了所作用的靶序列位點，消除了原有針對整個蛋白質所有位點抗體可能存在的副作用，可以特異而有效地抑制細菌的耐藥性蛋白的耐藥功能，從而克服細菌耐藥性問題；
(3)本發明所提供的抗體，比現有的抗體在作為藥物的應用上，具有更高的安全性和操作性。


圖1為大腸桿菌K12的 ο億基因PCR擴增(Α)、重組子雙酶切(B)及其誘導表達
(C)。圖2為大腸桿菌Κ12 ο/β 基因PCR擴增(Α、Β)、重組子雙酶切(C)及其誘導表達
(D)。圖3為TolC2基因在基因補救菌株(Δ tolC-pET-28a~tolC2)中的表達研究，A為聚丙烯凝膠電泳分析，B為Western blotting分析。圖4為最低抑菌濃度分析，其中五coli K-12為大腸桿菌k-12菌株，Δ ο億為 io/C 基因缺失菌株，Δ io/C-pETJSa-tolC 為 Δ io/C 的補救菌株，Δ ο7^-ρΕΤ-28Β 為 Δ iWC的空載菌株，Δ io/C-pETISa-to^^為Δ iWC的長片段突變補救菌株。圖5為生存率分析，其中五cWi K-12為大腸桿菌k-12菌株，Δ ο億為 ο億基因缺失菌株，Δ io7C,-pET-28a-tolC 為Δ tolC 的補救菌株，Δ ο7^-ρΕΤ-28Β 為Δ tolC 的空載菌株，Δ to/C-pETISa-to^^為Δ iWC的長片段突變補救菌株。圖6為免疫前血清、抗TolC和抗TolC- 二十三肽對不同菌株生長的影響。圖7為免疫前血清、抗TolC和抗TolC- 二十三肽對不同菌株生長的抑制率。圖8為抗TolC- 二十三肽對小鼠外陰感染的治療作用。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1
TolC基因的克隆、原核表達、蛋白純化及兔抗血清的制備
在該實施例中，將全長的大腸桿菌TolC編碼序列或片段構建入大腸桿菌蛋白質原核表達載體之中，以達到表達和提純目的蛋白。基因編碼序列如SEQ ID N0:3所示。SEQ ID NO:3
1 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc 61 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt 121 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta 181 ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac 241 ggcatcaact ctaacgcgac cagtgcgtcc ttgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg 301 tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacgtat 361 cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat 421 gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat 481 caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc 541 gcacagtacg ataccgtgct ggcgaacgaa gtgaccgcac gtaataacct tgataacgcg 601 gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggctgc gctgaatgtc 661 gaaaacttta aaaccgacaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa 721 cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggcgcgcga gcaaattcgc 781 caggcgcagg atggtcactt accgactctg gatttaacgg cttctaccgg gatttctgac 841 acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat 901 atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt 961 aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgtcggtg ccagcgagca actggaaagt 1021 gcccatcgta gcgtcgtgca gaccgtgcgt tcctccttca acaacattaa tgcatctatc 1081 agtagcatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgctc aaagctcatt agacgcgatg 1141 gaagcgggct actcggtcgg tacgcgtacc attgttgatg tgttggatgc gaccaccacg 1201 ttgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg 1261 aatattaagt cagctctggg tacgttgaac gagcaggatc tgctggcact gaacaatgcg 1321 ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgcac cgcaaacgcc ggaacagaat 1381 gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcaccag tcgttcagca aacatccgca 1441 cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaact ga0TolC氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。SEQ ID N0:4
1 mkkllpilig lslsgfssls qaenlmqvyq qarlsnpelr ksaadrdaaf ekinearspl 61 lpqlglgady tysngyrdan ginsnatsas lqltqsifdm skwraltlqe kaagiqdvty 121 qtdqqtliln tatayfnvln aidvlsytqa qkeaiyrqld qttqrfnvgl vaitdvqnar 181 aqydtvlane vtarnnldna veqlrqitgn yypelaalnv enfktdkpqp vnallkeaek241 rnlsllqarl sqdlareqir qaqdghlptl dltastgisd tsysgsktrg aagtqyddsn 301 mgqnkvglsf slpiyqggmv nsqvkqaqyn fvgaseqles ahrsvvqtvr ssfnninasi 361 ssinaykqav vsaqssldam eagysvgtrt ivdvldattt lynakqelan arynylinql 421 niksalgtln eqdllalnna lskpvstnpe nvapqtpeqn aiadgyapds papvvqqtsa 481 rtttsnghnp frn。. TolC基因的克隆
根據NCBI公布的大腸桿菌K12的基因序列，設計一對引物。引物序列如下正義引物 (SEQ ID N0:5) 5，-CGA GM TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3，，反義引物(SEQ ID N0:6) 5'-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G-3，。為便于克隆和表達載體的構建，在引物上分別引入限制性內酶位點^I和歷‘/^111。引物由大連寶生物工程公司合成。以熱變性法獲得的大腸桿菌K12全基因組為模板，通過PCR反應獲得目的條帶(圖1A，泳道1為DNA分子量標準，泳道2為目的條帶)。用限制性內酶I和Λ /^ΙΙΙ分別酶切回收的DNA片斷和pET-His (Novagen)表達載體，參照Takara公司的使用說明書進行連接反應，連接產物轉化五coli DH5 α感受態，通過雙酶切(圖1Β，泳道1為DNA分子量標準，泳道2為目的條帶)和序列測定重組子的正確性，結果證明與數據庫公布序列完全一致。. TolC基因的表達
將正確的重組質粒以熱激法轉化大腸桿菌BL21表達菌，37°C培養12-16小時。接種單菌落于含氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養基中，同時接種含有pET-HIS質粒的BL21作為對照，于301培養至00(600歷)值0.6，加入1 16 100 μ g/ mL 35°C誘導2個小時，離心收集菌體，用SDS - PAGE檢測插入片段是否表達蛋白，以及表達蛋白的分子量大小。接著， 進行蛋白表達產物為可溶組分抑或是不溶組分(包涵體)的鑒定。具體過程如下將離心后沉淀重懸于1/10體積的PBS或50mmol/L Tris緩沖液(pH8. 0)中；加入溶菌酶至100 μ g/ mL，保溫30分鐘；反復凍融數次以破壞細胞壁，用超聲波處理剪切DNA (超聲波的強度以不能產生氣泡為適宜；裂解的時間根據實際情況掌握，一般將云霧狀的細菌懸浮物裂解至比較清朗即可);離心(12，000rpm)15分鐘后將培養物分為可溶部分和不溶部分；將15 μ L上清與4 μ L 4X SDS樣品緩沖液混合，將沉淀物重懸于1 X SDS樣品緩沖液；將表達樣品(上清及沉淀)和非表達對照物進行SDS - PAGE電泳并以考馬斯亮藍染色以便在預計分子量范圍內觀察表達蛋白帶。經鑒定表達產物為可溶蛋白。表達后的圖譜如圖IC (泳道1為蛋白質分子量標準，泳道2和3分別為pET_28a 和目的基因誘導表達)所示。由圖可見，萬.cWi K-12 iWC基因確實已經連接到pET-28a 載體上，并能在五coli BL21中成功表達，其重組蛋白大小約為53. 9kDa，與其實際分子量相符。. TolC基因產物的純化
大量培育菌體，離心后超聲處理，離心收集上清用Ni-NTA His親和柱純化。采用 pH5. 9 (buffer F)和pH4. 5 (buffer G)兩個不同pH值的緩沖液純化蛋白。用沖洗緩沖液 buffer E(8mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2PO4, IOmmo 1/LTris-He 1，pH 6.3)洗滌 5 次，每次 ImL;用洗脫緩沖液 buffer F (8 mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2PO4, 10mmol/LTris-HCl, pH 5.9)洗脫目的蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液；用洗脫緩沖液buffer G(8M尿素，0. lmol/ L NaH2PO4,10mmol/LTris-HCl,pH 4. 5)洗脫蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液。取收集液 進行SDS-PAGE分析。純化蛋白進行紫外檢測，測定蛋白含量。.兔抗血清的制備
將純化蛋白溶液與福氏完全佐劑1:1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，采用背部多點注射免疫家兔，注射量為500μβ/只；其后采用福氏不完全佐劑，每次間隔2周，第3次免疫后的第10天，心臟取血，將得到的血擺成最大斜面后在4°C冰箱中靜置過夜，使血清自然析出。 通過Dot-ELISA測定效價為1:8000。分裝，_80°C保存。實施例2
TolC 片段 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪突變基因 QtolCi)的克隆
1. TolC片段突變基因tolC2引物的設計以疏水氨基酸替換為其它疏水氨基酸、親水氨基酸替換為其它親水氨基酸為原則， 對TolC氨基酸序列中片段SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪進行氨基酸替換，替換結果為 KRHQLRCTDE SCffVCSRPKT DQF。在基因的核苷酸序列中，找到該氨基酸序列相應的核苷酸序列(SEQ ID N0:2) :5，-TCT GAC ACC TCT TAT AGC GGT TCG AAA ACC CGT GGT GCC GCT GGT ACC CAG TAT GAC GAT AGC AAT ATG _3，，根據氨基酸的密碼子，該核苷酸序列相應地被替換為(SEQ ID N0:7) :5，-AAG CGT CAT CAG CTT CGC TGC ACG CAT GAA AGC TGT TGG GTT TGT AGT CGT CCT AAG ACC CAT CAG TTT-3，。因此，根據 io/C基因的核苷酸序列進行此片段突變to/C基因(命名為tolCi) 5’端和3’端兩對引物的設計(表1)，同時分別在5’正向引物及3’端反向引物中引入和Z/i/^III酶切位點(橫線所示)，以進行融合PCR。tolCH端反向引物的3’端從815位核苷酸處開始，iWC2-3’端正向引物5’端從859位核苷酸處開始，因此iWC2_5’端和iWC2-3’端兩條引物共有25個核苷酸的重疊， 以利于融合PCR的進行。表引物序列
權利要求
1.大腸桿菌TolC抗原，其特征在于包括如SEQID NO: 1所示的序列。
2.一種抗原，其特征在于由權利要求1所述的抗原與血藍蛋白偶連。
3.編碼如權利要求1所述大腸桿菌TolC抗原的基因片段。
4.如權利要求3所述的基因片段，其特征在于具有SEQID N0:2所示的序列。
5.如權利要求1或2所述的抗原在制備抗體方面的應用，所述抗體用于抑制細菌耐藥性。
6.與權利要求1所述的大腸桿菌TolC抗原特異結合的抗體。
7.如權利要求6所述的抗體，其特征在于由以下方法獲得根據NCBI公布的五coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪片段，合成多肽產物與血藍蛋白偶連以提高免疫原性；將人工合成SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段和血藍蛋白的偶連物與福氏完全佐劑混合均勻形成油包水乳劑，注射免疫動物，注射量100微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐劑；每次間隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低溫下靜置，使血清自然析出。
8.如權利要求6所述的抗體在制備抑制細菌耐藥性藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的細菌為大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、克氏檸檬酸桿菌、戴阿利斯特桿菌屬、肺炎克雷伯菌或鏈霉菌。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種大腸桿菌TolC二十三肽抗原及抗體，該抗體具有特異性針對SEQIDNO:1所示的序列。發明同時提供了編碼該大腸桿菌TolC二十三抗原的基因序列；以及該抗體在制備抑制細菌耐藥性藥物中的應用。本發明所提供的抗TolC片段SDTSYSGSKTRGAAGTQYDDSNM的抗體，提高了細菌對抗生素的敏感度，可以特異而有效地抑制大腸桿菌的耐藥外膜蛋白TolC的功能，從而克服細菌耐藥性問題。本發明所提供的抗體，比現有的抗體在作為抗細菌耐藥性藥物的應用上，具有更高的安全性和操作性。
文檔編號A61K39/40GK102153632SQ20111000226
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者吳麗娜, 張丹鳳, 張炳文, 彭宣憲, 李惠 申請人:中山大學