專利名稱：：溶瘤彈狀病毒的制作方法溶瘤彈狀病毒本申請要求2009年12月10日提出的美國臨時申請案第61/285，461號的優先權，通過引用將前述申請的全部內容合并至本申請中。發明的背景I.發明領域本發明大體涉及病毒學和藥物學。在某些方面，本發明涉及溶瘤病毒，特別是溶瘤彈狀loncolyticrhabdovirusノ。II.背景已有大量報道顯示，在體外實驗中，很多病毒會在多種腫瘤細胞中復制并殺死腫瘤細胞(辛德畢斯病毒(Sindbisvirus)(Unno等，2005);仙臺病毒(Kinoh等，2004);柯薩奇病毒(Coxackievirus)(Shafren等，2004);單純性皰疫病毒(Mineta等，1995);細小病韋(Abschuetz等,2006);腺病韋(Heise等,2000);脊髓灰質炎病韋(Gromeier等,2000)；新城疫病毒；水泡性口炎病毒(Stojdl等，2000);麻疹病毒(Grote等，2001);呼腸病毒(Coffey等，1998);逆轉錄病毒(Logg等，2001);痘苗病毒(Timiryasova等，1999);以及流感病毒(Bergmann等，2001))。此外，已證明，這些病毒對治療癌癥動物模型有效。但是，仍有必要提供其他治療方法來治療癌癥。發明概述本發明所描述的是ー種用以遺傳操作Maraba病毒的新的溶瘤平臺和重組系統。Maraba雙重突變株(“DM”)已被制造出來，并且在多種腫瘤模型(具有免疫功能的腫瘤模型和人異種移植腫瘤模型)中證實通過系統遞送是安全和有效的。幾種新發現的彈狀病毒在殺死特定癌癥或癌細胞系方面比VSV有效得多。而且，VSV和VSV的減毒突變株是具有神經毒性的，會引起嚙齒類動物和靈長類動物的CNS病變。有些彈狀病韋不會感染CNS(如MuirSprings病韋和BahiaGrande病韋Kerschner等，1986)，表現出更可接受的安全性。另外，基于新型彈狀病毒的治療方案可被用來治療原發性和繼發性CNS癌癥。本發明的彈狀病毒(和/或其它溶瘤試劑)可被連續使用以不引發宿主對特定治療性病毒的免疫應答。這樣可以延長治療時間并改善療效。本發明的實施方式包括有關彈狀病毒的組合物和方法以及它們作為抗癌治療的用途。這些彈狀病毒在體內和體外都具備殺死腫瘤細胞的性質。本發明中，彈狀病毒可以是Maraba病毒或Maraba病毒的基因工程變異體。本申請所述的病毒可以與其它彈狀病毒結合使用。其它彈狀病毒包括ー種或多種以下病毒或其變異體Carajas病韋、金迪普拉病韋(Chandipuravirus)、Cocal病韋、Isfahan病毒、皮里病毒(Piryvirus)、水泡性口炎阿拉戈斯病韋(VesicularstomatitisAlagoasvirus)、BeAn157575病韋、博特克病韋(Botekevirus)、Calchaqui病韋、美國獲麵病韋(EelvirusAmerican)、格雷洛奇病毒(GrayLodgevirus)、朱羅納病毒(Juronavirus)、克拉馬斯病韋(Klamathvirus)、Kwatta病韋、LaJoya病韋、MalpaisSpring病韋、芒特埃爾崗編幅病韋(MountElgonbatvirus)、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington病毒、BahiaGrande病韋、MuirSpring病韋、ReedRanch病韋、HartPark病韋、弗蘭德斯病韋(Flandersvirus)、凱米斯病韋(Kamese)、Mosqueiro病韋、莫蘇Jl病韋(Mossurilvirus)、Barur病毒、Fukuoka；)內毒、KernCanyon病毒、NkoIbisson)丙毒、LeDantec病毒、Keuraliba病韋、Connecticut病韋、新明托病韋(NewMintovirus)、Sawgrass病韋、Chaco病韋、SenaMadureiraラ胃_、Timbo__、Almpiwarラ胃_、AruacM^(Bangoranvirus)、Bimbo病韋、BivensArm病毒、藍蟹病毒(Bluecrabvirus)、Charleville病韋、濱海平原病韋(CoastalPlainsvirus)、DakArK7292病韋、Entamoeba病韋、Garba病韋、Gossas病韋、HumptyDoo病讀、Joinjakaka柄春、Kannamangalam柄春、Kolongo>KooIpinyah柄春、Kotonkon炳韋、Landjia病春、Manitoba病毒、Marco病春、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病韋、Oak-Vale病韋、Obodhiang病韋、Oita病韋、奧安戈病韋(Ouangovirus)、ParryCreek病毒、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba柄毒、Sigma病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch夕丙毒、Tibrogargan夕丙毒、Xiburema病毒、Yataヲ丙毒，RhodeIsland夕丙毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒或牛流行熱病毒。在某些情況下，彈狀病毒可以指雙感染彈狀病毒(Dimarhabdovirus,其被定義為能夠感染昆蟲細胞和哺乳動物細胞的彈狀病毒)的超群。在具體的實施例中，彈狀病毒不是VSV。在特定情況下，彈狀病韋是Carajas病韋、Maraba病韋、Farmington病韋、MuirSprings病韋和/或Bahiagrande病毒(包括它們的變異體)。這些病毒中的任何I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個或更多(包括這之間的所有整數值或范圍值)個病毒可被具體排除在本申請權利要求的保護范圍之外。本發明的一個實施方式包括包含溶瘤Maraba病毒的方法和組合物，該病毒編碼與Maraba病毒的M蛋白或G蛋白具有至少或至多20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%、100%(包括這些數值之間所有范圍和百分數)的氨基酸同一性的變異M蛋白和/或變異G蛋白。在某些情況下，MarabaG蛋白的第242個氨基酸被突變。在另外的情況下，M蛋白的第123個氨基酸被突變。在另外的情況下，G蛋白(SEQIDNO:5)的第242個氨基酸和M蛋白(SEQIDNO:4)的第123個氨基酸被突變。第242個氨基酸可以被精氨酸取代(Q242R)，或被其他可以減弱病毒毒性的氨基酸取代。第123個氨基酸可以被色氨酸取代(L123W)，或被其他可減少病毒毒性的氨基酸取代。在某些情況下，兩種單獨的突變各自減少了病毒對正常健康細胞的毒性作用。一旦將上述突變相結合，病毒在腫瘤細胞中會變得比野生型病毒更加有毒性。因此，MarabaDM的治療指數出人意料地増加。本發明的方法和組合物可包括第二種治療病毒，例如溶瘤病毒或復制缺陷型病毒。溶瘤通常指能夠殺死、溶解或阻止癌細胞生長的試劑。溶瘤病毒是指可在癌細胞中一定程度上復制，導致癌細胞死亡、溶解(溶瘤)或癌細胞生長停止，并且通常對非癌細胞具有微小的毒性作用。第二種病毒包括但不限于腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、阿爾法病毒、細小病毒、皰疹病毒、彈狀病毒等。另ー方面，所述組合物是藥學上可接受的組合物。所述組合物還可包括第二抗癌劑，例如化療劑、放療劑或免疫治療劑。本發明的另外的實施方式涉及殺死增生性(hyperproliferative)細胞的方法，該方法包括將該細胞與本文所述的分離的溶瘤彈狀病毒組合物接觸。另外的方法涉及癌癥患者的治療，包括施用有效量的本文所述的溶瘤彈狀病毒組合物。在本發明的某些方面，可將細胞包括在患者體內，該細胞可為增生性的、瘤性的、前癌性的、轉移性(metastatic)的或轉移性(metastasized)的細胞。彈狀病毒(例如Maraba病毒)可被施用至患者，該患者具有易被至少ー種彈狀病毒或包含彈狀病毒的治療方案或組合物殺死的細胞。治療組合物的施用可利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種彈狀病毒或重組彈狀病毒(單獨或以各種方式組合)進行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。所施用的組合物可具有10、100、103、104、105、106、107、108、109、10lcl、10n、1012、1013、1014個或更多個病毒顆粒或噬菌斑形成單位(Pfu)。施用可為腹膜內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或鼻腔施用。在某些方面，組合物被系統性施用，特別是通過血管內施用，包括注射、灌注等。本發明的方法可進ー步包括施用第二種抗癌療法，例如第二種治療病毒。在某些方面，治療病毒可為溶瘤病毒，更特別為Maraba病毒。在其他方面，第二種抗癌療法為化療劑、放療劑、免疫治療劑、手術等。本發明的實施方式包括與包含異源性G蛋白(假型病毒)的彈狀病毒有關的組合物和方法以及它們作為抗癌療法的用途。這種彈狀病毒具有體內和體外腫瘤細胞殺傷性質。因此，如本文所述的Maraba病毒可通過聯合異源性G蛋白而被進ー步修飾。如本文所使用的，異源性G蛋白包括彈狀病毒G蛋白。彈狀病毒將包括一種或多種以下病毒或其變異體Carajas病韋、金迪普拉病韋(Chandipuravirus)、Cocal病韋、Isfahan病韋、Maraba病韋、皮呈病韋(Piryvirus)、水泡性口炎阿拉戈斯病韋(VesicularstomatitisAlagoasvirus)、BeAn157575病韋、博特克病韋(Botekevirus)、Calchaqui病韋、美國獲麵病韋(EelvirusAmerican)、格雷洛奇病毒(GrayLodgevirus)、朱羅納病毒(Juronavirus)、克拉馬斯病韋(Klamathvirus)、Kwatta病韋、LaJoya病韋、MalpaisSpring病韋、芒特埃爾崗編幅病韋(MountElgonbatvirus)、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington病毒、BahiaGrande病韋、MuirSpring病韋、ReedRanch病韋、HartPark病韋、弗蘭德斯病韋(Flandersvirus)、凱米斯病韋(Kamese)、Mosqueiro病韋、莫蘇呈病韋(Mossurilvirus)、Barur病毒、Fukuokaラ丙毒、KernCanyon病毒、Nkolbisson)丙毒、LeDantec病毒、Keuraliba病韋、Connecticut病韋、新明托病韋(NewMintovirus)、Sawgrass病韋、Chaco病韋、SenaMadureira抦韋、Timbo病毒、Almpiwar抦毒、Aruac病毒、班戈蘭抦韋(Bangoranvirus)、Bimbo病韋、BivensArm病韋、藍蟹病韋(Bluecrabvirus)、Charleville病韋、濱海平原病韋(CoastalPlainsvirus)、DakArK7292病韋、Entamoeba病韋、Garba病韋、Gossas病母、HumptyDoo病母、Joinjakaka炳-母、Kannamangalam炳-母、Kolongo病母、Koolpinyah柄春、Kotonkon抦毒、Landjia病毒、Manitoba病毒、Marco病毒、Nasoule病毒、Navarro病毒、Ngaingan病韋、Oak-Vale病韋、Obodhiang病韋、Oita病韋、奧安戈病韋(Ouangovirus)、ParryCreek病毒、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba柄毒、Sigma病毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch)丙毒、Tibrogargan)丙毒、Xiburema病_、Yataヲ丙毒，RhodeIsland)丙毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒或牛流行熱病毒。在某些情況下，彈狀病毒可以指雙感染彈狀病毒(Dimarhabdovirus，其被定義為能夠感染昆蟲細胞和哺乳動物細胞的彈狀病毒)的超群。在特定情況下，彈狀病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、MuirSprings病毒和/或Bahiagrande病毒(包括它們的變異體)。本發明的另外的實施方式包括殺死超增生性(hyperproliferative)細胞的方法，該方法包括將該細胞接觸或施以溶瘤Maraba病毒組合物。另外的方法涉及癌癥患者的治療，包括施用有銷量的這種病毒組合物。在本發明的某些方面，可將細胞包括在患者體內，該細胞可為增生性的、瘤性的、前癌性的、癌性的、轉移性(metastatic)的或轉移性(metastasized)的細胞。本發明的病毒可被施用至患者，該患者具有易被至少ー種病毒或包含病毒的治療方案或組合物殺死的細胞。治療組合物的施用可利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種病毒(單獨或以各種方式組合)進行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。所施用的組合物可具有10、100、103、IO4、105、106、107、108、IO9、1010、IOllUO12,1013、IO14個或更多個病毒顆粒或噬菌斑形成單位(pfu)。施用可為腹膜內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或鼻腔施用。在某些方面，組合物被系統性施用，特別是通過血管內施用，包括注射、灌注等。本發明的方法可進ー步包括施用第二種抗癌療法，例如第二種治療病毒。在某些方面，治療病毒可為溶瘤病毒，例如本文所述的Maraba病毒。在其他方面，第二種抗癌療法為化療劑、放療劑、免疫治療劑、手術等。本發明的其他實施方式在整個申請中有描述。關于本發明的ー個方面的任何實施方式也適用本發明的其他方面，反之亦然。詳細描述和實施例部分的實施方式應理解為可適用于本發明各個方面的非限制性實施方式。當用于權利要求和/或說明書中吋，術語“抑制”、“降低”或“防止”或這些術語的任何變形，包括為實現期望結果(例如癌癥治療)的任何可測量的減少或完全抑制。期望結果包括但不限于癌癥或增生性病癥或癌癥相關癥狀的緩解、降低、減慢或根除，以及改善的生活質量或生命延長。當在權利要求和/或說明書中與術語“包含”聯用時，詞語“ー(a)”或“一(an)”可以指“ー個”，但也可以指“ー個或多個”、“至少ー個”以及“ー個或多于ー個”。在整個申請文件中，術語“約”表示ー個值包括測定該值所使用的裝置或方法的誤差的標準偏差。雖然所公開的內容支持術語“或”的定義僅為替代物以及“和/或”，但除非明確表示僅為替代物或替代物之間相互排斥外，權利要求中的術語“或”是指“和/或”。如在權利要求和說明書中所使用的，詞語“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在內的或開放式的，并不排除額外的、未引述的元件或方法步驟。本發明的其他目的、特征和優點將從以下詳細描述中變得明顯。但是，應當理解的是，但詳細描述和具體實施例(雖然表示本發明的具體實施方式)僅為解釋性目的而給出，因為在閱讀該詳細說明后，在本發明的精神和范圍內所作出的各種改變和修飾，對于本領域技術人員來說將變得顯而易見。以下附圖構成了本發明的一部分并且用于進ー步闡釋本發明的某些方面。本發明可通過ー個或多個附圖并結合具體實施方式的詳細說明而被更好地理解。圖1A-1B.新彈狀病毒Maraba顯示出在癌細胞中的高病毒產率。一步生長曲線被用來定量Maraba、Carajas、Farmington和BahiaGrande病毒在圖IANCIH226細胞中的病毒產率和在圖IBSNB19細胞中的病毒產率。與其他病毒相比，Maraba在兩個細胞系統均始終復制至較高的效價。圖2A-2F.Maraba突變體保留它們在癌細胞中的殺傷潛能但對正常細胞減弱了毒性。(圖2B)Maraba基因組工程化Maraba病毒作為溶瘤劑的圖示勾勒出我們單突變體(L123W、V221Y、Q242R)和雙突變體(Q242RL123W)的各突變位點。(圖2C)G蛋白和M蛋白的突變減弱了Maraba殺死GM38細胞的能力。在用Maraba和所示的Maraba突變體感染后72小時，對GM38細胞進行了存活率試驗。(圖2D)將L123W突變體改造成Q242R突變體噬菌斑尺寸恢復至野生型表型。在用野生型Maraba、單突變體和雙突變體感染的SNB19細胞中進行噬菌斑試驗。測量出噬菌斑直徑并利用等式A=TTr2計算出噬菌斑面積。(圖2E)Maraba和Maraba變異體在多種腫瘤細胞系中是高度裂解性的。利用野生型Maraba和Maraba變異體感染后48小時的PC3細胞、ES2細胞、A549細胞和SW620細胞的圖片。(圖2F)利用刃天青(resazurin)來檢驗用野生型Maraba和Maraba突變體感染的細胞的存活率。在用Maraba及其變異體感染后48小時，所有被處理細胞系的存活率急劇降低。圖3A-3C.Maraba突變體之間阻斷干擾素產生的能力有差別。使用Maraba變異體感染PC-3細胞，上清液用來保護Vero細胞不受野生型Maraba病毒的后續感染。(圖3A)Q242R突變體以類似野生型Maraba的方式阻斷干擾素。(圖3B)L123W突變體、V221Y突變體、MarabaAM51和雙突變體L123W-M/Q242R-G允許干擾素在PC3細胞感染后產生。(圖3C)rMaraba阻斷IFN-P的細胞核/細胞質運輸。通過qRTPCR未檢測到rMaraba或MarabaQ242R感染的細胞質碎片中的IFN-PmRNA誘導。用AM51、L123W和MarabaDM感染的細胞顯示出在感染后的細胞質中的IFN-PmRNA誘導。圖4A-4D.MarabaDM的系統性給藥在同基因和異種移植小鼠腫瘤模型中是有效的。(圖4A)MarabaDM在治療CT-26雙側腫瘤模型是有效的(i)DMGFT和DM-FLUC在IV注射(5X108pfu)24小時在腫瘤位點選擇性復制。(ii)用MarabaDM治療后Balb/C小鼠對雙側CT26腫瘤的耐受存活率(durablesurvival)0(iii)姆兩周計算一次腫瘤體積。誤差棒代表SEM。(iv)對用MarabaDM處理前后以及對照組測定小鼠體重。誤差棒代表SEM。(圖4B)彌散性CT-26腫瘤的系統性治療。(i)在腫瘤移植后第10天用PBS、Carajas病毒或MarabaDM靜脈內方式治療CT-26肺腫瘤。在第17天，殺死動物并獲得肺部圖像。(ii)用6份靜脈內劑量的MarabaDM(5XIO8pfu/劑)治療腫瘤有效。(圖4C)MarabaDM在人卵巢(ES-2)異種移植模型(IP注射，IXIO4pfu/劑)中有效。(i)IVIS成像證實病毒處理后快速的腫瘤退化。(ii)生物發光量曲線定量顯示病毒處理后腹部腫瘤負擔的顯著降低。(iii)KaplanMeier曲線證實了病毒處理后增強的存活率。(圖4D)MarabaDM在治療ES-2異種移植腫瘤(IV注射，IXIO5-IXIO7pfu/劑)方面比VSVA51更好。(Hi)KaplanMeier曲線證實了與VSVA51相比用MarabaDM處理的動物的存活率提高。圖5.NCI60細胞板上彈狀病毒介導的細胞殺傷。將來自NCI60細胞板的細胞接種至96孔板中以達到90%的匯合率(confIuency)。利用各種彈狀病毒(如圖所示)以對數稀釋來感染這些細胞。使用工程化的Maraba病毒作為溶瘤劑感染48小時或96小吋，將單層細胞洗滌、固定并以1%結晶紫溶液染色。隨后將染色的單層細胞溶解在1%SDS水溶液中，得到均勻的溶解物。測量595nm處的吸收值并為活細胞計分。如圖所示，MOIEC50的計分以范圍值顯示。發明詳述本發明的各個方面以彈狀病毒(例如Maraba病毒)或假型彈狀病毒對幾種或幾類癌細胞的殺傷為基礎。這些溶瘤彈狀病毒和重組彈狀病毒的一些優點包括(I)本發明的彈狀病毒的抗體在世界大多數人口中都很少直至不存在。(2)彈狀病毒比其他溶瘤病毒(例如腺病毒、呼腸病毒、麻疹病毒、細小病毒、逆轉錄酶病毒和HSV)復制得更快。(3)彈狀病毒生長至高效價，可通過0.2微米過濾器來過濾。(4)溶瘤彈狀病毒及其重組體具有廣泛的宿主范圍，能夠感染許多不同類型的癌細胞，并且不受特定細胞上的受體的限制(例如柯薩奇病毒、麻疹病毒、腺病毒)。(5)本發明的彈狀病毒可經受遺傳操作。(6)彈狀病毒還具有細胞質聲明周期并且不會整合到宿主細胞的遺傳物質中，這將賦予更加有利的安全性。如本文所述的，本發明發現了ー種新型溶瘤病毒，其用作建立有效的基于病毒的癌癥療法的平臺。篩選彈狀病毒以獲得具有有助于實現強溶瘤效果的性質的病毒。系統性給藥是已知的給藥方法并且在臨床上是治療彌散性癌癥的ー個有利的方面。在某些方面，病毒被靜脈內遞送，并且可引起在不同腫瘤位點的感染。假設有效治療的其中ー個體內局限性在于病毒遞送至腫瘤床可能是有限的。實際上，已觀察到存在這樣的劑量閾值，低于該閾值病毒不能被有效地遞送至小鼠模型的腫瘤中，并且這些劑量是沒有效果的(Stojdl等，2003)。因此，本發明的發明人致力于尋找能夠以低感染復數(“M0I”)殺死腫瘤細胞的病毒，該病毒能快速復制，以產生大量后代，從而使腫瘤床感染的幾率和程度最大化。為此，設計出ー種多孔板分析來識別能夠以低MOI殺死大范圍腫瘤細胞的病毒。MOI分析之后，分析大多數潛質病毒的生長動力學和裂解量。Maraba病毒被鑒定為很有前景的候選物。Maraba病毒(SEQIDNO:I)和Carajas病毒(CRJ)(SEQIDNO:7)的全基因組序列已被獲得。一旦Maraba病毒被鑒定為候選物，本發明的發明人進行了基因工程研究以改善其腫瘤選擇性。在研究中最初發現了兩個令人感興趣的突變，用于監測變化的環境中的RNA病毒適應性。在之前的報道中，L123W和H242R(在Maraba中為Q242R)能夠單獨增加VSV在BHK21細胞中的復制。另外，已報道稱，這兩種突變的組合保留了這種適應性表型。L123W/Q242R突變提供了具有至少3級對數的治療指數的病毒(在某些腫瘤細胞上，EC5(i〈10_3MOI；在GM38成纖維細胞上，EC5(i=3M0I)。Q242R和L123W突變導致病毒毒性在正常成纖維細胞上減弱。L123W顯得與AM51和V221Y具有大致相同的功能，導致阻斷細胞核/細胞質傳輸的能力上的缺陷，從而抑制宿主IFN轉錄級聯反應。據發明人的知識所知，這是第一次證實該基質蛋白的這個區域在減輕宿主先天性免疫防御中起作用。之前有報道稱，此區域的突變影響病毒mRNA的翻譯(Connor等，2006)。Q242R突變嚴重降低Maraba病毒對正常細胞的細胞溶解，但這種降低與IFN無關。這些性質構成了潛在腫瘤選擇性的基礎，腫瘤選擇性導致這種新型的基于Maraba的溶瘤病毒平臺的治療指示的顯著增加。如從體外結果所預知的，當靜脈內遞送至Balb/C小鼠中時，MarabaDM變異體比野生型病毒具有顯著降低的毒性。最大耐受劑量(“MTD”)是野生型病毒的100倍。這就允許在MTD以下進行劑量設計以實現在兩種腫瘤模型中的顯著的腫瘤退化。例如在CT26模型中，6劑MarabaDM病毒即足夠提供在所有小鼠中的完全耐受治愈(durablecure)。對于臨床治療特別重要的是，通過系統性遞送，MarabaDM在治療人異種移植腫瘤和具有免疫能力的同基因腫瘤模型都是有效的。在靜脈內注射之后證實了在CT26腫瘤模型中腫瘤位點發生了病毒復制，這與病毒介導的溶瘤效應(療效的貢獻因素之一)一致。實際上，在ES2異種移植模型中，MarabaDM顯得比之前的候選物VSVAM51更加有效。這與證實MarabaDM比野生型病毒在殺死腫瘤細胞方面更加有效的體外數據一致。幾個研究已明確證實，宿主免疫反應在溶瘤病毒療效方面起著正面和負面作用(Dhar等，2008;Alt0m0nte等，2008；Endo等，2008；Chiocca等，2008)。本發明的實施方式包括涉及Maraba病毒或假型彈狀病毒的組合物和方法，以及它們作為抗癌療法的用途。I.彈狀病毒科(彈狀病毒)原型彈狀病毒是狂犬病病毒和皰疹性ロ炎病毒(VSV)，也是這個病毒科研究最多的兩種病毒。雖然這些病毒具有相似的形態，但它們在生命周期、宿主范圍和病理學方面非常不同。彈狀病毒是具有子彈形狀的病毒科，其具有非分段(-)義RNA基因組。已知有250多種感染哺乳動物、魚類、昆蟲和植物的彈狀病毒。彈狀病毒科包括但不限于Carajas病毒、金迪普拉病毒(AF128868/gi:4583436，AJ810083/gi:57833891,AY81800/gi:62861470,AY871799/gi:62861468，AY871798/gi:62861466，AY871797/gi:82862464，AY871796/gi:62861462，AY871795/gi:82861460,AY871794/gi:62861459，AY871893/gi:62861457,AY871792/gi:62861455,AY871791/gi:62861453)、Cocal病毒(AF045556/gi:2865658)、Isfahan病毒(AJ810084/gi:57834038)、Maraba病毒(SEQIDNO:1-6)、Carajas病毒(SEQIDNO:7-12，AY335185/gi:33578037)、皮里病毒(D26175/gi:442480，Z15093/gi:61405)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美國鰻鱺病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、Kwatta病毒、LaJoya病毒、MalpaisSpring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒(DQ457103/gi|91984805)、Perinet病毒(AY854652/gi:71842381)、Tupaia病韋(NC_007020/gi:66508427)、Farmington病韋、BahiaGrande病毒(SEQIDNO:13-18)、MuirSpring病韋、ReedRanch病韋、HartPark病韋、弗蘭德斯病毒(AF523199/gi:25140635,AF523197/gi:25140634,AF523196/gi:25140633,AF523195/gi:25140632,AF523194/gi:25140631,AH012197/gi:25140630)、凱米斯病毒、Mosqueiro病韋、莫蘇Jl病韋、Barur病韋、Fukuoka病韋(AY854651/gi:71842379)、KernCanyon病韋、NkoIbisson病韋、LeDantec病韋(AY854650/gi:71842377)、Keuraliba病韋、Connecticut病韋、新明托病韋、Sawgrass病韋、Chaco病韋、SenaMadureira病韋、Timbo病韋、Almpiwar病韋(AY854645/gi:71842367)、Aruac病韋、班戈蘭病韋、Bimbo病韋、BivensArm病毒、藍蟹病毒、CharleviIIe病韋、濱海平原病韋、DakArK7292病韋、Entamoeba病韋、Garba病毒、Gossas病毒、HumptyDoo病毒(AY854643/gi:71842363)>Joinjakaka病韋、Kannamangalam病韋、Kolongo病毒(DQ457100/gi|91984799核蛋白(N)mRNA,部分cds)、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒(DQ457099/gi:91984797,AY854683/gi:71842354)、Landjiaラ丙_、Manitoba病_、Marco病毒、Nasoule)丙_、Navarro病_、Ngaingan)丙毒(AY854649/gi:71842375)、Oak-Vale病毒(AY854670/gi:71842417)、Obodhiang病毒(DQ457098/gi|91984795)、0ita病毒(AB116386/gi:46020027)、奧安戈病毒、ParryCreek病毒(AY854647/gi:71842371)、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba病毒(DQ457102/gi|91984803)、Sigma病毒(AH004209/gi:1680545，AH004208/gi:1680544,AH004206/gi:1680542)、Sripur病韋、SweetwaterBranch病韋、Tibrogargan病韋(AY854646/gi:71842369)、Xiburema病韋、Yata病韋，RhodeIsland病韋、AdelaideRiver病毒(U10363/gi:600151，AF234998/gi:10443747，AF234534/gi:9971785，AY854635/gi:71842348)、Berrimah病毒(AY854636/gi:71842350)、Kimberley病毒(AY854637/gi:71842352)或牛流行熱病毒(NC_002526/gi:10086561)。A.彈狀病毒基因組通常,彈狀病毒基因組約為ll-15kb,具有(-)義病毒RNA(vRNA)的約50個核苷酸的3’先導序列和約60個核苷酸的5’非翻譯區。通常，彈狀病毒vRNA具有編碼5種蛋白質的5個基因。彈狀病毒在每個基因的末端具有保守的多腺苷信號并且在5個基因的每ー個之間具有短基因間隔區。所有彈狀病毒含有至少五個基因，分別編碼核衣殼蛋白(N)、磷蛋白質(P，也表示為NS)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)。通常，這些基因在反義vRNA上如下排列3’-N-P-M-G-(X)-L-5’(SEQIDN0:29)。基因的順序很重要，因為其決定合成的蛋白質的比例。彈狀病毒基因組的任何操作通常會包括至少五個轉錄域以維持高水平感染和復制的能力。彈狀病毒具有內源性RNA聚合酶用于轉錄正義信使RNA(mRNA)。不是所有的彈狀病毒都具有X基因。X基因編碼在魚感染性造血壞死病毒中發現的非結構蛋白(GenBankDQ164103/giI76262981;DQ164102/gi|76262979;DQ164101/gi|76262977;DQ164100/giI76262975;DQl64099/gi|76262973;AB250935/gi|112821165;AB250934/giI112821163;AB250933/gi112821161;AB250932/gi|112821159;AB25093I/giI112821157;AB250930/gi|112821155;AB250929/gi|112821153;AB250928/gi1112821151;AB250927/gi1112821149，描述編碼G蛋白核苷酸序列)、在牛流行熱病毒中發現的非結構蛋白和在狂犬病毒中發現的假基因。該額外的(X)基因已被發現在彈狀病毒基因組的不同位點上。M蛋白在感染細胞中的合成導致細胞病變，并最終導致細胞死亡。彈狀病毒的傳播根據病毒/宿主而變化，但大多數是通過直接接觸傳播，例如，狂犬病毒傳播通過動物咬傷或昆蟲載體進行。在體內，病毒具有很長的潛伏期，但這未反映在培養物中的病毒復制動力學上。G蛋白突起結合到宿主細胞表面的受體，病毒通過胞吞作用進入細胞，并通過G蛋白的介導而與小泡的膜融合。不愿受任何特定理論的約束，彈狀病毒的受體分子被認為是磷脂或碳水化合物，而不是特定的蛋白質。彈狀病毒復制發生在細胞質中，L蛋白和NS蛋白都需要轉錄，兩者都不能単獨發揮作用。轉錄產生五種單順反子mRNA，其5’端加帽，3’端具有多腺苷，并且每個mRNA在其5’端具有來自vRNA的3’端的先導序列。這些mRNA是通過病毒基因組中ORF的序列轉錄獲得的，并且已有資料顯示，每個基因之間的間隔序列負責轉錄的終止和重新啟動(通過聚合酶)，因此產生単獨的轉錄體。子代vRNA由(+)義中間體形成。基因組通過L+P聚合酶復合物(轉錄時)復制，但還需要額外的宿主細胞因素。彈狀病毒的特點是這些時間都發生在細胞質的一部分，其如同病毒“エ廠”并且顯得是特有的細胞質包含體。B.病毒蛋白變異體在某些實施方式中，Maraba病毒或彈狀病毒將包含N、P、M、G和/或L蛋白中的ー個或多個的變異體。在本發明的某些方面，這些病毒蛋白變異體可被包括在治療病毒或以下進一步定義的蛋白質組合物中。蛋白質組合物包括病毒顆粒和其他具有ー種或多種病毒蛋白成分的組合物。這些多肽變異體可被工程化或其ー種或多種生理學或生物學特性可被選擇用來修飾，例如宿主細胞范圍、宿主細胞特異性、對非目標細胞或器官的毒性、復制、對目標細胞的細胞毒性、癌細胞的殺傷性、癌細胞的停滯(stasis)、感染性、制造參數、病毒顆粒的尺寸、病毒顆粒的穩定性、體內清除、免疫反應性等。這些多肽變異體可利用本領域已知的多種方法而被工程化，包括各種誘變技術。在某些方面，N、P、M、G和/或L蛋白對于ー個病毒可以是異源性的(例如VSV可包含IsfahanG蛋白或其變異體)。C.重組彈狀病毒重組彈狀病毒可通過以下方法產生(I)完全利用cDNA，或(2)將cDNA的組合體轉染至輔助細胞，或(3)將cDNA轉染至細胞，隨后用微小病毒(minivirus)感染細胞，以反式(intrans)提供生產感染性或非感染性重組彈狀病毒所需的剩余成分或行為。使用任何ー種方法(例如，微小病毒、輔助細胞系或僅cDNA轉染)，所需要的最少成分是含有順式作用信號的RNA分子，用于(I)通過彈狀病毒N蛋白將基因組(反義基因組)RNA衣殼化，和(2)復制基因組或反義基因組(復制性中間體)RNA等價物。發明人所述的復制元件或復制子是指一段RNA鏈，其最少在5’端和3’端含有彈狀病毒的先導序列和尾隨序列。在基因組意義上，先導序列位于3’端，尾隨序列位于5’端。因此，任何位于這兩個復制信號之間的RNA都將被復制。先導區和尾隨區必須進一歩含有最少的順式作用元件，用于通過N蛋白進行衣殼化并用于結合啟動轉錄和復制所需的聚合酶。為制備工程化的彈狀病毒，含有G基因的微小病毒還含有先導區、尾隨區和具有合適起始和終止信號以生產G蛋白mRNA的G基因。如果微小病毒進ー步包含M基因，也必須存在用于生產M蛋白mRNA的合適的起始和終止信號。對于任何包含在工程化的彈狀病毒基因組中的基因，該基因將在兩側具有合適的轉錄起始和終止信號，以允許這些基因的表達以及蛋白產物的生產，特別是異源性基因。異源性基因是指通常不被從自然界分離的彈狀病毒編碼的基因，或含有的彈狀病毒編碼區的位置、形式和環境(context)通常未被發現,例如嵌合G蛋白。為生產“非感染性”工程化彈狀病毒，工程化的蛋白病毒必須具有最少的復制子元件以及N、P和L蛋白，并且它必須含有M基因(ー個例子是AG或G-缺乏結構體，其缺少G蛋白編碼區)。這生產出從細胞中芽生但的病毒顆粒，但是非感染性的顆粒。為生產“感染性”顆粒，病毒顆粒必須額外包含可介導病毒顆粒結合和融合(例如通過使用附著蛋白或受體配體)的蛋白。彈狀病毒的天然受體配體為G蛋白。“合適的細胞”或“宿主細胞”是指允許重組彈狀病毒組裝的任何細胞。在制備感染性病毒顆粒的ー種方法中，首先用牛痘病毒Vtf7-3(Fuerst等，1986)或等價物感染合適的細胞系(例如BHK細胞)，其中牛痘病毒或等價物編碼T7RNA聚合酶或其他合適的噬菌體聚合酶(例如T3或SP6聚合酶)(見Usdin等，1993或Rodriguez等，1990)。這些細胞隨后用含有編碼G、N、P、L和M彈狀病毒蛋白質的基因的單獨cDNA來轉染。這些cDNA將提供用于建立重組彈狀病毒顆粒的蛋白質。可利用本領域已知的任何方法來轉染細胞(例如，脂質體、電穿孔等)。還被轉染進細胞系中的是含有彈狀病毒基因組RNA等價物的“多順反子cDNA”。如果感染性的重組彈狀病毒顆粒要用來裂解感染細胞，那么編碼N、P、M和L蛋白的基因以及任何異源性核酸片段必須存在。如果感染性重組彈狀病毒顆粒不用來裂解細胞，那么編碼M蛋白的基因不被包括在多順反子DNA中。“多順反子cDNA”是指包含至少ー個具有編碼N、P和L蛋白的基因的轉錄單元的cDNA。重組彈狀病毒多順反子DNA也可含有編碼蛋白變異體或其多肽片段的基因，或治療性核酸。作為選擇，任何最初聯合制首先生成的病毒顆粒的蛋白或其片段可被反式提供。另ー個實施方式提供一種多順反子DNA，其包含編碼報道蛋白或熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白及其衍生物、3-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、熒光素酶、氯霉素こ酰轉移酶等)的基因、N-P-L或N-P-L-M基因、和/或融合蛋白或治療性核酸。另ー種多順反子DNA可含有編碼蛋白質變異體的基因、編碼報道蛋白的基因、治療性核酸、和/或N-P-L基因或N-P-L-M基因。生產重組彈狀病毒的第一步是RNA的表達，該RNA是cDNA的基因組或反義基因組等價物。隨后，該RNA被N蛋白包裹，再借助P/L蛋白被復制。這樣生產的病毒可被回收。如果重組RNA基因組中不存在G蛋白，那么通常以反式提供G蛋白。如果G蛋白和M蛋白都不存在，那么兩者都可以反式提供。為制備“非感染性彈狀病毒”顆粒，程序可與以上相同，只是轉染到細胞中的多順反子cDNA將只含有彈狀病毒的N、P和L基因。非感染性彈狀病毒顆粒的多順反子cDNA可額外含有編碼報道蛋白的基因或治療性核酸。關于生產缺少編碼G蛋白的基因的重組彈狀病毒的方法的其他描述，參見Takada等(1997)。I.培養細胞以生產病毒轉染的細胞通常在期望的溫度(通常為約37°C)培養至少24個小吋。對于非感染性病毒顆粒，收集上清液并分離病毒顆粒。對于感染性病毒顆粒，收集含有病毒的上清液并轉移至新鮮細胞。將新鮮細胞培養約48個小吋，并收集上清液。2.重組彈狀病毒的純化術語“分離”彈狀病毒是指培養和純化病毒顆粒從而留下非常小的細胞碎片的過程。一個例子是收集含毒粒的上清液并將其通過0.1-0.2微米孔徑的過濾器(例如Millex-GS、Millipore)以出去病毒和細胞碎片。重組彈狀病毒顆粒隨后可被重懸于任何期望的賦形劑或載體中。可通過利用對特定蛋白特異的抗體通過間接免疫熒光法來測定效價。3.利用cDNA和微小病毒或輔助細胞系制備重組彈狀病毒的方法“微小病毒”和“輔助細胞”(也稱“輔助細胞系”)提供同樣的東西提供用于彈狀病毒毒粒組裝的彈狀病毒蛋白質來源。彈狀病毒微小病毒的ー個例子是VSV微小病毒，如Stillman等(1995)所報道的，其僅表達G蛋白和M蛋白。輔助病毒和微小病毒被用做提供彈狀病毒蛋白質的方法，而編碼彈狀病毒蛋白質的基因的轉染DNA不生產這些彈狀病毒蛋白質。當使用微小病毒時，如上所述，使用牛痘病毒感染細胞以提供17RNA聚合酶。期望的多順反子RNA以及含有N、P和L基因的質粒被轉染進細胞中。約在3個小時后，除去轉染混合液，使用微小病毒以約I的感染復數(m.o.i)感染細胞。微小病毒提供缺失的G蛋白和/或M蛋白。轉染進細胞的多順反子RNA將取決于想要感染性還是非感染性重組彈狀病毒。作為選擇，微小病毒可被用來提供N、P和L基因。除N、P和L蛋白之外，微小病毒也可被用來生產M蛋白。微小病毒也可生產G蛋白。當使用輔助細胞系時，編碼缺失的彈狀病毒蛋白質的基因由輔助細胞系生產。輔助細胞系具有用于生產重組彈狀病毒顆粒的N、P、L和G蛋白，輔助細胞系部編碼野生型G蛋白。蛋白質是由不構成重組病毒基因組的一部分的基因或DNA來表達。這些質粒或其他載體系統被穩定地整合到細胞系的基因組中。蛋白質隨后從細胞的基因組中生產出來，而不從細胞質中的復制子生產。輔助細胞系隨后可用含有其他不被輔助病毒表達的彈狀病毒基因的多順反子DNA和質粒cDNA來轉染。所使用的多順反子RNA將取決于想要感染性還是非感染性重組彈狀病毒。否則，缺失的基因產物(例如G蛋白和/或M蛋白)的供應可通過上述方式完成。II.病毒組合物本發明涉及彈狀病毒，其在研究和治療患者的超增生性或瘤性細胞(例如癌細胞)或超增生性或瘤性病癥(例如癌癥)是有利的。這可涉及(但不限干)具有降低的神經毒性的彈狀病毒，例如Maraba病毒。在某些方面，彈狀病毒編碼或含有ー種或多種蛋白成分(N、P、M、G和/或L蛋白)或不同于VSV基因組的核酸基因組(即，在氨基酸或核苷酸水平有至少或至多10%、20%、40%、50%、60%、70%、80%相同)，和/或彈狀病毒被構建成與野生型病毒或病毒蛋白相比具有ー個或多個突變或變化，從而使病毒具有期望的性質以用于對抗癌細胞，但相比于原始分離的病毒或VSV來說對非癌細胞具有較低的毒性或無毒性。以下描述的內容提供本發明的實施方法和組合物的各種例子。它們提供了通過利用生物選擇或重組DNA或核酸技術生成突變的或變異的病毒的
背景技術：
。A.蛋白質組合物本發明的蛋白質組合物包括病毒顆粒和包含病毒顆粒的組合物以及分離的多肽。在某些實施方式中，本發明涉及生成或分離彈狀病毒(例如Maraba病毒)、假型或溶瘤彈狀病毒(溶解、殺死或阻斷癌細胞生長的彈狀病毒)。在某些實施方式中，彈狀病毒將被工程化以包括彈狀病毒蛋白質(N、P、M、G和/或L)的多肽變異體和/或編碼治療性多肽的治療性核酸。本發明的其他方面包括缺少ー種或多種功能性多肽或蛋白質的彈狀病毒的分離。在其他實施方式中，本發明涉及彈狀病毒及其作為藥學上可接受的制劑與蛋白質組合物結合使用或被包括在蛋白質組合物中。如本文所使用的，“蛋白質”或“多肽”是指包含氨基酸殘基的聚合物的分子。在某些實施方式中，使用蛋白質或多肽的野生型版本，但在本發明的許多實施方式中，缺失或改變了所有或一部分病毒蛋白質，以使病毒更加有用于治療患者。上述術語可以在本文中互換使用。“修飾的蛋白質”、“修飾的多肽”、“變異蛋白質”或“變異多肽”是指相對于野生型或參考蛋白質或多肽，化學結構或氨基酸序列被改變的蛋白質或多肽。在一些實施方式中，修飾的蛋白質或多肽具有至少ー種被修飾的活性或功能(要承認這些蛋白質或多肽可具有多種活性或功能)。所修飾的活性或功能相對于野生型蛋白質或多肽的活性或功能或含有這種多肽的病毒的特性來說，可被降低、削弱、消除、增強、改善或以其他方式(例如感染特異性)改變。要預期到的是，修飾的蛋白質或多肽可相對于ー種活性或功能被干部而在其他方面保留野生型或未改變的活性或功能。作為選擇，修飾的蛋白質可完全無功能，或者其同源核酸序列可被改變從而根本不再表達多肽，或多肽被截短，或由于閱讀框移位或其他修飾導致表達出不同的氨基酸序列。在某些實施方式中，重組蛋白質或多肽的大小可包括，但不限于，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500個或更多個氨基分子殘基(包括其間的任何范圍值個殘基)。要預期到，多肽可通過截短而被修飾，使得它們比相應的未改變形式要短，或者通過融合或結構域混編而被修飾，使得改變后的蛋白質更長。如本文所使用的，“氨基分子”是指本領域技術人員所知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物。在某些實施方式中，蛋白質分子的殘基是連續的，沒有任何非氨基分子打斷氨基分子殘基的序列。在其他實施方式中，序列可包含一個或多個非氨基分子部分。在特別的實施方式中，蛋白質分子的殘基序列可被一個或多個非氨基分子部分打斷。因此，術語“蛋白質組合物”包括含有自然合成蛋白質中的20種普通氨基酸中的至少ー種或至少一種經修飾的或非普通氨基酸的氨基分子序列。蛋白質組合物可通過本領域技術人員已知的任何技術制備，包括通過標準分子生物學技術表達蛋白質、多肽或肽，從天然資源中分離蛋白質成分，或化學合成蛋白質材料。各種彈狀病毒基因或基因組的核苷酸序列和多肽序列之前已公開，并可在本領域技術人員已知的計算機化的數據庫中找到。一種這樣的數據庫是美國國家生物技術信息中心的GenBank數據庫和GenPept數據庫,可通過互聯網在ncbi.nlm.nih.gov/獲得。編碼這些已知基因和病毒的區域可利用本文公開的技術或本領域技術人員已知的技術來擴增和/或表達。B.功能方面除非另有說明，當本申請涉及病毒蛋白質或多肽的功能或活性吋，是指該病毒蛋白或多肽在生理學條件下的活性或功能。例如，G蛋白涉及結合和感染特定細胞類型的特異性和效率。可利用本領域技術人員熟知的實驗方法來確定哪些分子具備這種性質，例如感染性實驗、蛋白結合實驗、噬菌斑實驗等。C.病毒多肽的變異體本發明的多肽的氨基酸序列變異體可以是取代變異體、插入變異體或缺失變異體。與野生型或未改變的多肽或其他參考多肽相比，編碼病毒多肽的基因中的突變可能會影響多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個或更多個非連續或連續氨基酸(即區段)。彈狀病毒編碼的各種多肽可通過GenBank登錄號以及本文所公開的每個病毒的相關公共數據庫記錄來識別，通過引用將涉及彈狀病毒科的所有GenBank記錄都合并至本文中。缺失變異體缺少了天然的、未改變的或野生型蛋白質的ー個或多個殘基。單個殘基可被缺失，或者整個或部分結構域(例如催化或結合結構域)可被缺失。終止密碼子可被引入(通過取代或插入)到編碼用核酸序列中以生成截短的蛋白質。插入突變體通常在多肽的非末端位點添加物質。插入的特定類型是嵌合型多肽，其在目標蛋白的相關部分包括了相關蛋白的同源性或形似部分。這可包括插入免疫反應性表位或僅是ー個或多個殘基。末端添加(通常稱為融合蛋白質)也可被產生。取代變異體通常在蛋白質的ー個或多個位點用一個氨基酸替換另一個氨基酸，并且可被設計用來調節多肽的ー種或多種性質，同時喪失或不喪失其他功能或性質。取代可以是保守的，即用具有相似性質和電荷的氨基酸取代一個氨基酸。保守取代在本領域是熟知的，包括例如以下變化丙氨酸到絲氨酸；精氨酸到賴氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到絲氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；組氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸到亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸到纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸到蘇氨酸；蘇氨酸到絲氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸到異亮氨酸或亮氨酸。作為選擇，取代可以是非保守的，從而影響多肽的功能和活性。非保守的變化通常包括用化學上不相似的殘基取代，例如用極性或帶電的氨基酸取代非極性或不帶電的氨基酸，反之亦然。術語“功能上等價的密碼子”在本文是指編碼相同氨基酸的密碼子，例如精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，并且也指編碼生物學上等價的氨基酸的密碼子(見下表I)。表I.密碼子表氣基酸I密碼子IlllH~丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸HeIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG_,天冬酰胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU谷氨酰胺GlnQCAA_CAG____精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG_.酪氨酸ijVrlZjlIAClUAU]]I[要理解的是，氨基酸序列和核酸序列可包括額外的殘基，例如額外的N-末端氨基酸或C-末端氨基酸或5’或3’序列，其仍然是本發明要闡述的，包括具有特定的生物學活性。末端序列的添加特別適用于下述核酸序列，例如該核酸序列可包括在編碼區的5’或3’部分的兩側的非編碼序列，或者該核酸序列可包括已知在基因內出現的各種內部序列，即內顯子。以下內容是關于改變N、P、L、M或G蛋白的氨基酸以產生等價的、甚至改善的分子的描述。例如，蛋白質結構中的某些氨基酸可被其他氨基酸取代，而察覺不到與結構(例如抗體的抗原結合區或底物分子的結合位點)的相互結合能力的喪失。因為蛋白質的相互結合能力和性質決定蛋白質的生物學功能活性，可在蛋白質序列和下級的DNA編碼序列中進行某些氨基酸取代，但產生具有相似性質的蛋白質。因此，本發明的發明人預期，如下文所述，可對彈狀病毒的DNA序列作出各種改變而不喪失感興趣的生物學用途或活性。在作出這些改變時，可考慮氨基酸的親水指數。氨基酸親疏水指數在賦予蛋白質的生物學功能方面的重要性在本領域是普遍知道的(Kyte和Doolittle，1982)。已接受的是，氨基酸的相對親疏水特性對所產生的蛋白質的ニ級結構有影響，ニ級結構又決定了蛋白質與其他分子的相互作用，其他分子例如是酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等。還要理解的是，相似氨基酸的取代可基于親水性而有效地進行。美國專利4554101號(通過引用合并至本文中)指出，蛋白質的最大局部平均親水性(由其鄰近氨基酸的親水性決定)與蛋白質的生物學性質相關。如美國專利4554101號詳細描述的，氨基酸殘基的親水值為精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。要理解的是，一個氨基酸可被具有相似親水值的另ー個氨基酸取代，但仍產生生物學上等價的或免疫學上等價的蛋白質。在這種改變中，優選取代親水值在±2以內的氨基酸，特別優選的是親水值±1以內的氨基酸，更特別優選的是親水值±0.5以內的氨基酸.如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性來進行，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮了各種前述特征的示例性取代對于本領域技術人員是熟知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。III.核酸分子本發明包括可從能夠表達所有或部分病毒蛋白或多肽的細胞中分離出的多核苷酸。在本發明的一些實施方式中，其涉及病毒基因組的全部或部分，該病毒基因組已被特定地突變或改變以生產具有特定性質和/或特性的病毒或病毒多肽，例如假型或彈狀病毒多肽或病毒。多核苷酸可編碼含有全部或部分病毒的或異源的氨基酸序列的肽或多肽，或者可被工程化以使得它們不編碼這樣的多肽或編碼的病毒多肽的至少ー個功能或活性被添加、增カロ、降低、削弱或缺失。重組蛋白質可從表達細胞中純化以產生活性蛋白。彈狀病毒成員的基因組可在NCBI數據庫或類似數據庫中以GenBank登錄號找到，通過引用將每個數據庫合并至本文中。A.編碼天然或修飾的蛋白質的多核苷酸如本文所使用的，術語“RNA、DNA或核酸片段”是指不含總基因組DNA或其他污染物的已分離的RNA、DNA或核酸分子。因此，編碼多肽的核酸片段是指含有野生型、多態性或突變的編碼多肽的序列的核酸片段，并且與基因組核酸分離或被純化而不含基因組核酸。術語“核酸片段”包括多核苷酸、小于多核苷酸的核酸片段和重組載體(包括例如質粒、粘粒、噬菌體、病毒等)。如本文所使用的，術語“彈狀病毒多核苷酸”可指編碼至少ー種彈狀病毒多肽的假型或彈狀病毒核酸分子。在某些實施方式中，多核苷酸已被分離得不含其它核酸。類似地，Maraba病韋、Carajas病韋、MuirSpring病韋和/或BahiaGrande病韋多核昔酸是指編碼Maraba病韋、Carajas病韋、MuirSpring病韋和/或BahiaGrande病韋多妝并已于其它核酸相分尚的核酸分子。“彈狀病毒基因組”或Maraba病毒、Carajas病毒、MuirSpring病毒和/或BahiaGrande病毒基因組是指可被提供至宿主以產生病毒顆粒的VSV或核酸分子，這種提供可在存在或不存在輔助病毒或反式供應其它因子的補充編碼區的情況下進行。與野生型或未改變的病毒相比，基因組可能或可能未以重組方式被突變。術語“cDNA”是指以RNA為模板制備的DNA。全基因組序列或部分基因組序列都有可能是優選的。也要預期到的是，來自給定物種的特定多肽可被具有稍微不同的核酸序列但編碼相同蛋白質的天然變異體(見表I)來代表。類似地，編碼分離的或純化的野生型或修飾的多肽的多核苷酸是指包括編碼野生型或突變多肽的序列(特定情況下還包括調控序列)的DNA片段，這些序列基本上與其他天然基因或蛋白編碼序列相分離。關于這點，為簡明起見，術語“基因”是指編碼蛋白質、多肽或肽的核酸単元(包括任何需要用于合適的轉錄、翻譯后修飾或定位的序列)。如本領域技術人員所理解的，該功能性術語包括基因組序列、cDNA序列和表達或可被改造以表達蛋白質、多肽、結構域、肽、融合蛋白質和突變體的較小的工程化核酸片段。編碼全部或部分天然或修飾的多肽的核酸可含有:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000個或更多的核苷酸、核苷或堿基對的連續核酸。在特定的實施方式中，本發明涉及分離的核酸片段和包含核酸序列的重組載體，所述核酸序列編碼野生型或突變的彈狀病毒多肽，所述彈狀病毒多肽在其氨基酸序列內包括與天然多肽一致或本質上相對應的連續氨基酸序列。術語“重組”可與多肽或具體多肽的名字相連用，它通常是指由已在體外被操作的核酸分子生成的多肽或由這樣的核酸分子的復制產物生成的多肽。在其他實施方式中，本發明涉及分離的核酸片段和包含編碼多肽或肽的核酸序列的重組載體，所述多肽或肽在其氨基酸序列中包括與一種或多種彈狀病毒多肽一致或本質上相對應的連續氨基酸序列。用在本發明中的核酸片段，無論編碼序列本身的長度如何，都可與其他核酸序列結合，例如啟動子、多腺苷信號、額外的限制酶切位點、多克隆位點、其他編碼片段等，使得它們的總體長度可有相當大的變化。因此，可以預期的是，可使用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優選由制備的簡易性和在預期重組核酸方案中的用途來限定。要預期到，本發明的核酸構建體可編碼任何來源的全長多肽或編碼這些多肽的截短版本或修飾版本，例如截短的彈狀病毒多肽，從而編碼區的轉錄體代表截短的版本。截短的轉錄體隨后可被翻譯成截短的蛋白質。作為選擇，核酸序列可編碼具有額外的異源性編碼序列的圈成多肽序列，例如以允許純化多肽、運輸、翻譯后修飾或有利于治療(例如靶定或效率)。如上所述，標簽或其他異源性多肽可被添加至修飾的多肽編碼序列中，其中“異源性”是指與修飾的多肽不相同的多肽或其片段，或被發現不與天然病毒結合或不被天然病毒編碼的多肽或其片段。在一個非限制性的例子中，可制備出包括連續延伸(contiguousstretch)的核苷酸的ー個或多個核酸構建體，該連續延伸的核苷酸與特定病毒片段(例如彈狀病毒N、P、M、G或L基因)相同或互補。核酸構建體的長度可為至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、50000、100000、250000、500000、750000個到至少1000000個核苷酸，以及更大尺寸的構建體，直至包括染色體大小(包括所有中間長度和中間范圍)。容易理解的是，“中間長度”和“中間范圍”在本文是指包含所列舉值或在所列舉值之間(即，包含這些值的所有整數以及這些值之間的所有整數)的任何長度或范圍。用在本發明中的核酸片段包括編碼修飾的多肽的修飾的核酸。這種序列可能由于密碼子冗余和功能等價(已知在核酸序列和所編碼的蛋白質中自然發生)而出現。作為選擇，功能上等價的蛋白質或肽可通過重組DNA技術的應用而產生，在該技術中，蛋白質結構的變化可基于被交換的氨基酸的性質的考慮而被工程化。人類設計的變化可通過應用定點突變技術來引入，例如用于改善或引入蛋白質抗原性，用于降低蛋白質在體內對給予該蛋白質的對象的毒性作用，或用于增加使用該蛋白或包含該蛋白的病毒進行的任何治療的療效。在某些其他實施方式中，本發明涉及分離的核酸片段和重組載體，所述重組載體在其序列中包括來自本文以序列形式顯示(和/或通過引用合井)的核酸序列的連續核酸序列。但是，這樣的序列可被突變以生成活性相對于野生型發生改變的蛋白質產物。還要理解的是，本發明并不限于特定的核酸和這些序列的氨基酸序列。重組載體和分離的核酸片段因此可廣泛地包括彈狀病毒編碼區本身、含有對基本編碼區的選擇的改變或修飾的編碼區，或者它們可編碼包括彈狀病毒編碼區的更大的多肽，或者可編碼具有變異的氨基酸序列的生物學上功能等價的蛋白質或多肽。本發明的核酸片段可編碼彈狀病毒蛋白質和多肽，所述蛋白質和多肽是增加病毒的治療益處的彈狀病毒的或其變異體或突變體的生物學功能等價物。這種序列可能由于密碼子冗余和功能等價(已知在核酸序列和所編碼的蛋白質中自然發生)而出現。作為選擇，功能上等價的蛋白質或肽可通過重組DNA技術的應用而產生，在該技術中，蛋白質結構的變化可基于被交換的氨基酸的性質的考慮而被工程化。人類設計的變化可通過應用定點突變技術來引入，例如用于改善病毒蛋白對癌細胞的結合能力。B.彈狀病毒多核苷酸的突變在各種實施方式中，彈狀病毒多核苷酸可被改變或突變。改變或突變可包括插入、缺失、點突變、倒位(inversion)等,并且可導致某些蛋白質或分子機制的調節、激活和/或失活，以及改變基因產物的功能、位置或表達，特別是使基因產物沒有功能。當使用時，編碼全部或部分彈狀病毒的多肽的突變可通過各種標準的突變程序(Sambix)Ok等，2001)來完成。突變是ー種致使生物體的數量或結構發生變化的過程。突變可包括單個基因、基因塊或整個基因組的核苷酸序列的改變。單個基因中的變化可由點突變造成，點突變包括DNA序列中的單個核苷酸堿基的移除、添加或取代，或者它們也可以由涉及大量核苷酸的插入或缺失的改變而導致。I.隨機突變a.插入突變插入突變基于通過插入已知核酸片段而使基因失活。因為它涉及插入某些類型的核酸片段，所以所產生的突變體通常失去功能，而不是獲得功能。但是，也有幾個插入突變的例子是產生獲得功能的突變體。插入突變可利用標準分子生物學技術來實現。b.化學突變化學突變提供了某些優點，例如能夠發現具有不同程度表型嚴重程度(phenotypicseverity)的各突變體，并且能夠輕易且便宜地進行。大多數化學致癌劑可對DNA產生突變。苯并[a]花、N-こ酰氧基-2-こ酰基氨基芴和黃曲霉毒素BI導致細菌細胞和哺乳動物細胞中GC轉化為TA。苯并[a]芘也可產生堿基替換，例如AT變為TA。N-亞硝基化合物可產生GC到AT的轉變。由于暴露于N-亞硝基脲而誘導的胸腺嘧啶的04位置的烷基化導致TA轉變為CG。c.輻射突變電離輻射可降解生物分子。吸收入射能導致形成離子和自由基并破壞某些共價鍵。分子之間以及相同分子的不同晶形之間對輻射損壞的敏感度顯得差異巨大。它取決于總累計劑量以及劑量率(一旦存在自由基，它們導致的分子損傷取決于它們自然擴散速率，因此會實時變化)。通過使樣品盡可能地冷，來降低和控制損傷。電離輻射導致DNA損傷，通常損傷與劑量率成比例。在本發明中，術語“電離輻射”是指包含粒子或光子的輻射，所述粒子或光子具有足夠的能量或可產生足夠的能量來產生電離(獲得或失去電子)。一個示例性和優選的電離輻射是X光輻射。對于給定細胞或特定分子來說，所需的電離輻射的量通常取決于該細胞或分子的性質以及突變目標的性質。測定輻射的有效量的手段在本領域是熟知的。d.體外掃描突變隨機突變也可通過利用易錯PCR來產生。突變的頻率可通過利用模板的不同稀釋物在多個管中進行PCR來提高。一個特別有用的突變技術是丙氨酸掃描突變，其中使用丙氨酸逐個替換許多殘基從而可確定失去側鏈相互作用的影響，同時使得蛋白質構型的大規模擾動的風險降到最低(Cunningham等，1989)。體外掃描飽和突變提供了一種獲得大量結構-功能信息的快速方法，包括(i)識別調節配體結合特異性的殘基，(ii)基于識別在給定位點保留活性的氨基酸和消除活性的氨基酸能更好地理解配體結合，(iii)評價活性位點或蛋白質亞結構域的整體可塑性，(iv)識別導致結合增加的氨基酸取代。2.定點突變結構引導性定點突變是ー種剖析和工程化蛋白質-配體相互作用的有利工具(Wells,1996;Braisted等，1996)。該技術通過向選定的DNA中引用一個或多個核苷酸序列變化而制備和測試序列變異體。C.載體為在彈狀病毒基因組中產生突變，天然的和修飾的多肽可被包含在載體內的核酸分子所編碼。術語“載體”用來指一種載體核酸分子，外源性核酸序列可被插入到其中，從而引入到其可被復制的細胞中。核酸分子可以是“外源性的”，是指對于載體所要被引入的細胞來說是外來的，或者該序列與細胞中的序列同源但位于宿主細胞核酸中通常不能發現該序列的位置。載體包括質粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)和人工染色體(例如YAC)。本領域技術人員將有足夠的能力通過標準重組技術來構建載體，這些技術在Sambrook等(2001)和Ausubel等(1994)中描述,通過引用將它們合并至本文。除了編碼修飾的多肽(例如修飾的N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白或L蛋白)之夕卜，載體可編碼非修飾的多肽序列，例如標簽或靶向分子。編碼這樣的融合蛋白的有用的載體包括PlN載體(Inouye等，1985)、編碼一鏈組氨酸的載體以及pGEX載體，用于生產谷胱甘肽S轉移酶(GST)可溶性融合蛋白，以用于后續純化、分離或裂解。靶向分子是ー種將修飾的多肽引導向對象身體的特定器官、組織、細胞或其他位置。作為選擇，靶向分子改變生物體(例如彈狀病毒)對特定細胞類型(例如癌細胞)的趨向性。術語“表達載體”是指包含核酸序列的載體，該序列編碼能夠被轉錄的基因產物的至少一部分。在某些情況下，RNA分子被翻譯成蛋白質、多肽或肽。在其他情況下，這些序列不被翻譯出來，例如在生成反義分子或核酶的過程中。表達載體可含有各種“控制序列”。控制序列是指可操作地連接的編碼序列在特定宿主生物體內的轉錄和翻譯(可能的情況下)所需的核酸序列。除了掌控轉錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達載體還含有用于其他功能的核酸序列(以下詳述)。I.啟動子和增強子“啟動子”是控制序列，它是ー個區域的核酸序列，在該區域內，轉錄的啟動和速率被控制。它可含有結合調節蛋白質和分子(例如RNA聚合酶和其他轉錄因子)的遺傳元件。短語“可操作地位干”、“可操作地結合”、“可操作地連接”、“受控制”和“受轉錄控制”是指啟動子相對于核酸序列處于正確的功能位置和/或方向以控制該序列的轉錄起始和/或表達。啟動子可與或不與“增強子”結合使用。增強子是指在核酸序列的轉錄活化中涉及到的順式作用調節序列。啟動子可以是與基因或序列天然結合的啟動子，例如可通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼區而獲得。這樣的啟動子可被稱為是“內源性”的。相似地，增強子可為與核酸序列天然結合的增強子，其位于該序列的上游或下游。作為選擇，通過將編碼核酸片段置于重組或異源性啟動子的控制之下可獲得某些優點。重組或異源啟動子是指在自然環境下通常不與核酸序列結合的啟動子。重組或異源增強子也指在其自然環境下通常不與核酸結合的增強子。這樣的啟動子或增強子可包括其他基因的啟動子或增強子，以及分離自任何其他原核細胞、病毒或真核細胞的啟動子或增強子，以及“非天然”的啟動子或增強子(即含有不同轉錄調控區的不同元件和/或改變表達的突變)。除了合成法產生啟動子和增強子的核酸序列之外，可以結合本文所公開的組合物利用重組克隆和/或核酸擴增技術(包括PCR)產生(見美國專利4683202、5928906號，通過引用將每個合并至本文)。而且，要預期到的是，引導序列在非細胞核的細胞器(例如線粒體、葉綠體等)中的轉錄和/或表達的控制序列也可被使用。使用有效導引核酸片段在被選擇用于表達的細胞類型、細胞器和生物體中的表達的啟動子和/或增強子自然是重要的。分子生物學領域技術人員通常知道使用啟動子、增強子和細胞類型組合來實現蛋白質表達，例如參見Sambixx)k等(2001)，通過引用合并至本文。所使用的啟動子可以是組成型的、組織特異性的、細胞選擇性的(即與另ー種細胞類型相比在ー種細胞類型中更有效)、誘導型的和/或在合適條件下可用于引導所引入的核酸片段的高水平表達(例如在重組蛋白質和/或肽的大規模生產中是有利的)。啟動子可以是異源性的或內源性的。在本發明中，可使用集中元件/啟動子來調節基因的表達。該列舉不是對涉及促進表達的所有可能的元件的窮舉，而僅是示例性的。此處還提供了誘導型元件的例子，它是指可響應特定刺激而被活化的核酸序列區域。啟動子/增強子(參考)包括免疫球蛋白重鏈(Banerji等，1983；Gilles等，1983;Grosschedl等，1985；Atchinson等，1986，1987；Imler等，1987;Weinberger等，1984;KiIedjian等，1988；Porton等，1990);免疫球蛋白輕鏈(Queen等，1983；Picard等，1984);T細胞受體(Luria等，1987；Winoto等，1989；Redondo等，1990)；HLADQa和/或DQ&(Sullivan等，1987)；&干擾素(Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn等，1988);白細胞介素_2受體(Greene等，1989;Lin等，1990);MHCII類5(Koch等，1989);MHCII類HLA-DRa(Sherman等，1989);3_肌云力蛋白(Kawamoto等，1988;Ng等;1989);肌酸激酶(MCK)(Jaynes等，1988;Horlick等，1989;Johnson等，1989);如白蛋白(轉甲狀腺素蛋白)(Costa等，1988);彈性蛋白酶I(Omitz等，1987);金屬硫蛋白(MTII)(Karin等，1987;Culotta等，1989);膠原酶(Pinkert等，1987;Angel等，1987);白蛋白(Pinkert等，1987;Tronche等，1989，1990);a-甲胎蛋白(Godbout等，1988;Campere等，1989);y-球蛋白(Bodine等，1987;Perez-Stable等，1990)球蛋白(Trudel等，1987);c_fos(Cohen等，1987)；c-HA-ras(Triesman,1986;Deschamps等，1985);胰島素(Edlund等，1985)；神經細胞粘附分子(NCAM)(Hirsh等，1990);al-抗胰酶(Latimer等，1990)；H2B(TH2B)組蛋白(Hwang等，1990);小鼠和/或I型膠原蛋白(Ripe等，1989);葡萄糖調節蛋白(GRP94和GRP78)(Chang等，1989);大鼠生長激素(Larsen等，1986);人血清淀粉樣蛋白A(SAA)(Edbrooke等，1989);肌I丐蛋白I(TNI)(Yutzey等，1989);血小板源性生長因子(PDGF)(Pech等，1989);杜興氏肌營養不良(Klamut等，1990);SV40(Banerji等，1981;Moreau等，1981;Sleigh等，1985;Firak等，1986;Herr等，1986;Imbra等，1986;Kadesch等，1986;Wang等，1986;Ondek等，1987;Kuhl等，1987;Schaffher等，1988);多瘤病毒(Swartzendruber等，1975;Vasseur等，1980;Katinka等，1980，1981;Tyndell等，1981;Dandolo等，1983;deVilliers等，1984;Hen等，1986;Satake等，1988;Campbell等，1988);逆轉錄病毒(Kriegler等，1982，1983;Levinson等，1982;Kriegler等，1983，1984a，b，1988;Bosze等，1986;Miksicek等，1986;Celander等，1987;Thiesen等，1988;Celander等，1988;Choi等，1988;Reisman等，1989);乳頭瘤病毒(Campo等，1983;Lusky等，1983;Spandidos和Wilkie，1983;Spalholz等，1985;Lusky等，1986;Cripe等，1987;Gloss等，1987;Hirochika等，1987;Stephens等，1987);こ型肝炎病毒(Bulla等，1986;Jameel等，1986;Shaul等，1987;Spandau等，1988;Vannice等，1988);人免疫缺陷病毒(Muesing等，1987;Hauber等，1988;Jakobovits等，1988;Feng等，1988;Takebe等，1988;Rosen等，1988;Berkhout等，1989;Laspia等，1989;Sharp等，1989;Braddock等，1989);巨細胞病毒(CMV)(Weber等，1984;Boshart等，1985;Foecking等，1986);以及長臂猿白血病病毒(Holbrook等，1987;Quinn等，1989)。誘導元件(元件/誘導物(參考))包括MT11/佛波酯(TNFA)、重金屬(Palmiter等，1982;Haslinger等，1985;Searle等，1985;Stuart等，1985;Magana等，1987，Karin等，1987;Angel等，1987b;McNeal等，1989);MMTV(鼠乳腺瘤病毒)/糖皮質激素類(Huang等，1981;Lee等，1981;Majors等，1983;Chandler等，1983;Lee等，1984;Ponta等，1985;Sakai等，1988);P-干擾素/poly(rl)x,poly(rc)(Tavernier等，1983);腺病毒5E2/E1A(Imperiale等，1984);膠原酶/佛波酷(TPA)(Angel等，1987a);基質裂解素/佛波酯(TPA)(Angel等，1987b)；SV40/佛波酷(TPA)(Angel等，1987b);鼠科MX基因/干擾素、新城疫病毒(Hug等，1988)；GRP78基因/A23187(Resendez等，1988);a-2-巨球蛋白/IL-6(Kunz等，1989);波形蛋白/血清(RUtling等，1989)；MHCI類基因H_2Kb/干擾素(Blanar等，1989)；HSP70/E1A,SV40大T抗原(Taylor等，1989，1990a,1990b);增殖蛋白/佛波酯-TPA(Mordacq等，1989);以及甲狀腺刺激激素a基因/甲狀腺激素(Chatterjee等，1989)。組織特異性或選擇選擇性的啟動子或元件(即，與另ー種細胞相比在一種細胞中具有更大活性的啟動子)的識別，以及確定它們活性的實驗，對于本領域技術人員來說是熟知的。這樣的區域的例子包括人UMK2基因(Nomoto等，1999)、生長抑素受體2基因(Kraus等，1998)、鼠科附睪視黃酸結合蛋白基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠a2(XI)膠原蛋白(Tsumaki等，1998)、DlA多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長因子II(Wu等，1997)、人血小板內皮細胞黏附分子-1(Almendro等，1996)和SM22啟動子。可用于本發明的額外的病毒啟動子、細胞啟動子/增強子以及誘導型啟動子/增強子已列舉在本文中。此外，任何啟動子/増強子結合(根據真核生物啟動子數據庫EPDB)也可被用來驅動結構基因的表達，這些結構基因編碼寡糖處理酶、蛋白質折疊附屬蛋白、可選擇標記蛋白或感興趣的異源蛋白。作為選擇，用于癌基因治療的組織特異性啟動子(表2)或腫瘤靶向的組織特異性啟動子(表3)可與本發明的核酸分子一起使用。表2癌基因治療的組織特異性候選啟動子組織特異性啟動子啟動子在其中有活性的癌癥j啟動子在其中有活性的正常細胞癌胚抗原(CEA)*大多數結直腸癌；50%的肺癌;40-50%的胃癌；大多數胰腺癌；大許多乳結腸黏膜；胃黏膜；肺上皮細胞；外分泌汗腺；睪丸中的細胞癌前列腺特異性抗原(PSA)大多數前列腺癌前列腺上皮組織血管活性腸肽(VIP)大多數非小細胞肺癌神經元細胞；淋巴細胞；肥大細胞；嗜酸性粒細胞表面活性蛋白A(SP-A)大多數肺腺癌細胞肺泡的II型肺細胞；Clara細胞人無剛毛鱗甲同系物(MSH)大多數小細胞肺癌肺神經內分泌細胞粘蛋白-l(MUCl)**大多數腺癌(起源于任何組織)乳腺中的以及呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道中的腺上皮細胞a-胎蛋白大多數肝細胞癌；可能多數睪丸癌肝細胞(特定情況下)；睪丸白蛋白大多數肝細胞癌肝細胞酪氨酸酶大多數黑色素瘤黑色素細胞；星細胞；SChwarm細胞；某些神經元細胞酪氨酸結合蛋白(TRP)大多數黑色素瘤黑色素細胞；星細胞；SChwarm細胞；某些神經元細胞角蛋白14推測許多鱗狀細胞癌(例如頭部癌和頸部癌)角質形成細胞EBVLD-2許多頭部和頸部的鱗狀細胞癌上消化道的角質形成細胞膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)Iト多星形細胞瘤]星細胞:權利要求1.一種減毒的彈狀病毒,其包含氨基酸序列與SEQIDN0:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDNO:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，或氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白，或氨基酸序列與SEQIDNO:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDNO:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，和氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白。2.如權利要求I所述的彈狀病毒，其中所述遺傳突變是精氨酸取代SEQIDNO:5的第242位置的谷氨酰胺，或者色氨酸取代SEQIDN0:4的第123位置的亮氨酸。3.—種殺死超增生性細胞的方法，包括將細胞與分離的溶瘤彈狀病毒接觸，所述溶瘤彈狀病毒編碼氨基酸序列與SEQIDNO:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDNO:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，或氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白，或氨基酸序列與SEQIDNO:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDNO:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，和氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白。4.如權利要求3所述的方法，其中所述細胞被包括在患者體內。5.如權利要求4所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。6.如權利要求5所述的方法，其中所述癌細胞是轉移性癌細胞。7.如權利要求4所述的方法，其中所述溶瘤彈狀病毒被施用至患者。8.如權利要求7所述的方法，其中所述溶瘤彈狀病毒通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮膚內、瘤內、皮下或鼻內給藥而被施用。9.如權利要求3所述的方法，所述方法進ー步包括施用第二種抗癌療法。10.如權利要求9所述的方法，其中所述第二種抗癌療法是第二種溶瘤病毒。11.如權利要求10所述的方法，其中所述第二種溶瘤病毒是牛痘病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒、甲病毒、細小病毒或彈狀病毒。12.如權利要求11所述的方法，其中所述第二種抗癌劑是第二種溶瘤彈狀病毒。13.如權利要求12所述的方法，其中所述第二種溶瘤彈狀病毒是水皰性口炎病毒(VSV)、Carajas病毒、金迪普拉病毒、Cocal病毒、Isfahan病毒、皮里病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美國鰻鱺病毒、格雷洛奇病韋、朱羅納病韋、克拉馬斯病韋、Kwatta病韋、LaJoya病韋、MalpaisSpring病韋、芒特埃爾崗編幅病韋、Perinet病韋、Tupaia病韋、Farmington病韋、BahiaGrande病韋、MuirSpring病韋、ReedRanch病韋、HartPark病韋、弗蘭德斯病韋、凱米斯病韋、Mosqueiro病韋、莫蘇Jl病韋、Barur病韋、Fukuoka病韋、KernCanyon病韋、Nkolbisson病韋、LeDantec病韋、Keuraliba病韋、Connecticut病韋、新明托柄春、Sawgrass柄韋、Chaco病韋、SenaMadureira病韋、Timbo病韋、Almpiwar病韋、Aruac病韋、班戈蘭病韋、Bimbo病韋、BivensArm病韋、藍蟹病韋、CharleviIIe病韋、濱海平原病韋、DakArK7292病韋、Entamoeba病韋、barbaラ丙母、Gossas)丙-母、HumptyDoo病母、joinjakakaラ丙母、Kannamangalam病母、KolongoΛKooIpinyahラ@_、Kotonkon^Landjiai)^%、Manitoba__、Marco__、Nasoule病韋、Navarro病韋、Ngaingan病韋、Oak-Vale病韋、Obodhiang病韋、Oita病韋、奧安戈病春、ParryCreek柄毒、RioGrandecichlid抦毒、Sandjimba病讀、Sigma病毒、Sripur柄春、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema)丙春、Yataラ丙毒，RhodeIsland病韋、AdelaideRiver病韋、Berrimah病韋、Kimberley病韋或牛流行熱病韋。14.如權利要求9所述的方法，其中所述第二種癌癥療法是化學療法、放射療法或免疫療法。15.—種治療癌癥患者的方法，其包括施用有效量的分離的溶瘤彈狀病毒，所述溶瘤彈狀病毒編碼氨基酸序列與SEQIDN0:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，或氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白，或氨基酸序列與SEQIDN0:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，和氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白。16.如權利要求15所述的方法，其中所述溶瘤彈狀病毒通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮膚內、瘤內、皮下或鼻內給藥而被施用。17.如權利要求15所述的方法，所述方法進ー步包括施用第二種癌癥療法。18.如權利要求17所述的方法，其中所述第二種抗癌療法包括第二種溶瘤病毒。19.如權利要求18所述的方法，其中所述第二種溶瘤病毒是牛痘病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒或彈狀病毒。20.如權利要求19所述的方法，其中所述第二種抗癌療法包括第二種溶瘤彈狀病毒。21.如權利要求20所述的方法，其中所述第二種彈狀病毒是水皰性口炎病毒(VSV)、Carajas病毒、金迪普拉病毒、Cocal病毒、Isfahan病毒、皮里病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美國鰻鱺病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病韋、克拉馬斯病韋、Kwatta病韋、LaJoya病韋、MalpaisSpring病韋、芒特埃爾崗編幅病_、Perinet病毒、Tupaia)丙毒、Farmington)丙毒、BahiaGrande病_、MuirSpring病韋、ReedRanch病韋、HartPark病韋、弗蘭德斯病韋、凱米斯病韋、Mosqueiro病韋、莫蘇呈病韋、Barur柄韋、Fukuoka柄韋、KernCanyon柄韋、Nkolbisson柄韋、LeDantec柄韋、Keuraliba柄韋、Connecticut病韋、新明托病韋、Sawgrass病韋、Chaco病韋、SenaMadureira病韋、Timbo病韋、Almpiwar病韋、Aruac病韋、班戈蘭病韋、Bimbo病韋、BivensArm病韋、藍蟹病韋、CharleviIIe病韋、濱海平原病韋、DakArK7292病韋、Entamoeba病韋、barbaラ丙母、Gossas)丙-母、HumptyDoo病母、joinjakakaラ丙母、Kannamangalam病母、KolongoΛKooIpinyahラ@_、Kotonkon^Landjiai)^%、Manitoba__、Marco__、Nasoule病韋、Navarro病韋、Ngaingan病韋、Oak-Vale病韋、Obodhiang病韋、Oita病韋、奧安戈病春、ParryCreek柄毒、RioGrandecichlid抦毒、Sandjimba病讀、Sigma病毒、Sripur柄韋、SweetwaterBranch病韋、Tibrogargan病韋、Xiburema病韋、Yata病韋，RhodeIsland病韋、AdelaideRiver病韋、Berrimah病韋、Kimberley病韋或牛流行熱病韋。22.如權利要求17所述的方法，其中所述第二種癌癥療法是化學療法、放射療法、免疫療法或手術。23.ー種包含分離的溶瘤彈狀病毒的組合物，所述溶瘤彈狀病毒具有核酸片段，所述核酸片段編碼氨基酸序列與SEQIDN0:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，或氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白，或氨基酸序列與SEQIDN0:5的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDN0:5的第242位置具有氨基酸取代的G蛋白，和氨基酸序列與SEQIDN0:4的氨基酸序列至少80%相同并且在SEQIDNO:4的第123位置具有氨基酸取代的M蛋白。24.如權利要求23所述的組合物，所述組合物進ー步包含第二種溶瘤病毒。25.如權利要求24所述的組合物，其中所述第二種溶瘤病毒是牛痘病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、腺病毒或彈狀病毒。26.如權利要求25所述的組合物，其中所述第二種溶瘤病毒是彈狀病毒。27.如權利要求26所述的組合物，其中所述第二種彈狀病毒是Carajas病毒、金迪普拉病韋、Cocal病韋、Isfahan病韋、皮Jl病韋、水泡性口炎阿拉戈斯病韋、BeAn157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美國鰻鱺病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病韋、Kwatta病韋、LaJoya病韋、MalpaisSpring病韋、芒特埃爾崗編幅病韋、Perinet病毒、Tupaia倆毒、Farmington柄毒、BahiaGrande柄毒、MuirSpring柄毒、ReedRanch柄毒、HartPark病毒、弗蘭德斯病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、Barur病春、Fukuoka病毒、KernCanyon病韋、Nkolbissonヲ丙韋、LeDantecヲ丙春、Keuraliba病毒、Connecticut病韋、新明托病韋、Sawgrass病韋、Chaco病韋、SenaMadureira病韋、Timbo病韋、Almpiwar病韋、Aruac病韋、班戈蘭病韋、Bimbo病韋、BivensArm病毒、藍蟹病毒、Charleville病韋、濱海平原病韋、DakArK7292病韋、Entamoeba病韋、Garba病韋、Gossasヲ丙毒、HumptyDoo)丙毒、Joinjakaka病毒、Kannamangalamラ丙毒、Kolongo)丙毒、KoolpinyahKotonkonLandjiaMManitobaMarco^jS|>NasouleNavarro'M韋、Ngaingan病韋、Oak-Vale病韋、Obodhiang病韋、Oita病韋、奧安戈病韋、ParryCreek倆毒、RioGrandecichlid病毒、Sandjimba病毒、Sigma柄毒、Sripur病毒、SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema柄毒、Yata柄毒，RhodeIsland病毒、AdelaideRiver病毒、Berrimah病毒、Kimberley病毒或牛流行熱病毒。28.如權利要求23所述的組合物，其中所述組合物是藥學上可接受的組合物。29.如權利要求28所述的組合物，所述組合物進ー步包括第二種抗癌劑。30.如權利要求29所述的組合物，其中所述第二種抗癌劑是化學治療劑、放射治療劑或免疫治療劑。全文摘要本發明的實施方式包括涉及Maraba病毒的組合物和方法以及它們作為抗癌療法的用途。這種彈狀病毒具有體外和體內的腫瘤細胞殺傷性質。文檔編號A61P35/00GK102858959SQ201080063490公開日2013年1月2日申請日期2010年12月10日優先權日2009年12月10日發明者約翰·C.·貝爾,戴維·F.·斯托吉爾申請人:渥太華醫院研究院,安大略省東區研究院公司兒童醫院