專利名稱：用于鑒別接種對抗布魯氏菌的疫苗的動物的方法
技術領域：
本發明屬于預防醫學和公共衛生領域，并且涉及開發和使用基因修飾的布魯氏菌(Brucella spp.)活疫苗，以及開發和使用允許鑒別已經接種的動物以及被布魯氏菌強毒株感染的動物的直接和間接診斷技術。
背景技術：
布魯氏菌病(Brucellosis)是從動物傳染給人的疾病。在動物體內，布魯氏菌感染引起流產、不育、生產降低以及動物和動物產品貿易的限制，這是具有經濟影響的動物衛生問題。此外，該細菌是從感染動物傳染給人的，由此導致虛弱以及通常致殘的疾病，沒有對抗該細菌的疫苗，并且針對頻繁復發的延長期它的治療需要高劑量抗生素。因此，布魯氏菌是一個重要的公共衛生問題。已經顯示的是人布魯氏菌病的患病 率與動物布魯氏菌病的患病率直接地相關聯。因此，在缺少用于人類的疫苗下，預防該疾病必然需要控制動物體內的感染。在大多數社會經濟的背景中，用于控制布魯氏菌病的唯一可行的辦法是通過基于接種農場動物的計劃(程序)，通過大規模接種計劃(程序)或通過用于接種、診斷和屠宰感染動物的計劃(程序)(Blasco 1997. Preventive VeterinaryMedicine 31:275-283)。針對動物布魯氏菌病的參照疫苗是用于牛的流產布魯氏菌(B. abortus) S19 (光滑菌株)以及用于綿羊和山羊的馬爾他布魯氏菌(B.meliteniiORevl (光滑菌株)(0ΙΕTerrestrial Manual, 2009-chapters 2. 4. 3. and2. 7. 2.-)。兩者都是活的減毒株，無佐劑，具有生產和獲得的低成本，以及對抗反芻動物體內野生株(用于人類感染的主要來源)感染的高效性。然而，該技術的缺點是在接種疫苗之后它們產生免疫應答，不能與在被野生株強烈感染之后誘導的情況區別開。為了解決這個問題，已經做出了許多科學努力。一個策略在于發展布魯氏菌的粗糙菌株(rough strain) (R),由于缺少脂多糖(LPS)的O鏈(一種已知的布魯氏菌致病因子以及用于測試感染的血清學診斷的主抗原)，這些菌株導致可用作活疫苗的減毒株，這些菌株未顯著地干擾血清學診斷測試。在此背景下，在90年代，開發了(通過傳代培養)具有R顯型的自發性突變體(稱為流產布魯氏菌RB51) (Schurig etal. , 1991. Veterinary Microbiology, 28:171-188)。菌株 RB51 目前正用于一些國家中對抗牛布魯氏菌病，存在有爭議的結果。由于缺少“O”抗原，RB51和從在不同脂多糖合成途徑方面在基因上良好表征的(Gonzalez et al. , 2008. PLoS One, 3 (7) :e2760)布魯氏菌病馬爾他種衍生的R變異體的集合都降低了在病毒干擾的血清學診斷方面的干擾問題。然而，已經顯示的是R疫苗沒有解決這個問題，因為它們給予的對抗野生型感染的保護比參照疫苗流產布魯氏菌S19和布魯氏菌馬耳他種Revl低得多(Moriy0n et al. , 2005. VeterinaryResearch, 35:1-38, Barrio et al.，2009. Vaccine, 27:1741-1749)。因此，重要的是具有(獲得)基因修飾的衍生疫苗流產布魯氏菌S19和布魯氏菌馬耳他種Revl以及通過直接和間接診斷法(血清學)使已經免疫接種的動物與患有病毒感染的動物區別開的相關診斷測試。
存在廣泛多樣的熒光蛋白GFP (綠色熒光蛋白)，這些蛋白是依賴于所使用的表達系統以可變的熒光數量和強度產生的。GFP蛋白已經廣泛地用于分子和細胞生物學中用于基因標記和檢測微生物(包括布魯氏菌，Celli et al. , 2003. Journal of ExperimentalMedicine, 198(4) :545_556)、細胞、質體、重組蛋白以及用于嚴格的科學目的的其他部分。還開發了免疫印跡型免疫測試(Rajasekaran et al. , 2008. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 74(22) :7051-7055)以及夾心ELISA用于檢測和定量在微生物、細胞以及組織中表達的多種 GFP 蛋白(Cell Biolabs, Inc. ;Cell Signaling Technology, Inc.)。還存在用于在細菌(例如大腸桿菌(Clontech Laboratories))或表皮葡萄球菌(Franke etal. , 2007. Journal of Microbiological Methods 71:123-132)中鑒別對 GFP 蛋白進行編碼基因的特異性變異體的PCR型分子診斷測定法。Walsh和同事(Walsh et al. , 2000. Journal of General Virology, 81, 709-718)提出了 GFP作為獸醫疫苗標志物的可能用途。然而，他們未能將它適當地表達于牛瘟病毒中。
發明內容
本發明的諸位發明人說明了流產布魯氏菌S19的衍生菌株(原型疫苗S19-GFPp)如何能夠以穩定方式表達GFP，而不改變參照菌株S19的微生物學或生物學特征(減毒作用以及對抗實驗動物體內感染的療效)，以及還有如何能夠誘導通過可以區別已經免疫接種的宿主以及用布魯氏菌強毒株感染的那些宿主的特異性血清學試驗可檢出的抗-GFP抗體應答。他們還說明了能夠特異性鑒別已經用表達GFP蛋白的新疫苗免疫的動物的血清學診斷的間接ELISA法。因此，本發明的第一方面涉及穩定地表達綠色熒光蛋白(GFP)、能夠在宿主體內引發可與通過參考疫苗菌株誘導的免疫應答相比較的免疫應答，還產生可通過特異性血清學方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株在開發藥物中的用途；或可替代地，穩定地表達綠色熒光蛋白(GFP)并且能夠在宿主體內誘發可與通過參考疫苗菌株誘導的免疫應答相比較的免疫應答，還產生可通過特異性血清學方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株，用于作為藥物的用途。在本發明這個方面的一個優選實施方式中，該藥物是疫苗。本發明的另一個方面涉及穩定地表達綠色熒光蛋白(GFP)、能夠在宿主體內誘發可與通過參考疫苗菌株誘導的情況相比較的免疫應答，并且還產生可通過特異性血清學方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株在開發用于在哺乳動物體內預防或治療布魯氏菌病藥物中的用途；或可替代地，穩定地表達綠色熒光蛋白(GFP)、能夠在宿主體內誘發可與通過參考疫苗菌株誘導的情況相比較的免疫應答，并且還產生可通過特異性血清學方法檢出的抗-GFP抗體的布魯氏菌菌株，用于預防或治療哺乳動物體內布魯氏菌病。在此，布魯氏菌是指可以定義為在分類學上屬于細菌域(domain)的變形菌門α變形菌綱根瘤菌目布魯氏菌科布魯氏菌屬的任何細胞生物體。術語“哺乳動物”是指真核生物域(domain)的后生動物界索動物門有頭動物亞門顎口動物超綱哺乳動物綱的任何生物。反芻動物是指屬于勞亞獸超目反芻亞目的任何哺乳動物。并且牛、綿羊以及山羊是指可以歸類為屬于牛科的任何哺乳動物。由多管水母(維多利亞多管水母、多管水母、A. forskalea)產生的綠色突光蛋白GFP是在可見光譜的綠色區域中發射生物發光的蛋白。在本發明的上下文中，還通過核苷酸或多核苷酸序列來定義GFP，該序列是編碼GFP蛋白的序列，并且該序列可以包括源自以下的數個變異體a)編碼包括SEQ ID NO: I的氨基酸序列的多肽的核酸分子，b)其互補鏈與a)多核苷酸序列雜交的核酸分子，c)由于遺傳密碼的簡并其序列與a)和/或b)不同的核酸分子，d)編碼多肽的核酸分子，該多肽包括與SEQ ID NO: I至少80%、90%、95%、98%或99%一致的氨基酸序列，其中由所述核酸編碼的多肽具有GFP蛋白的活性以及結構特征。在本發明的另一個優選實施方式中，該布魯氏菌菌株屬于流產布魯氏菌。在本發明的這個方面的一個甚至更優選的實施方式中，該布魯氏菌菌株是從參考菌株流產布魯氏菌 S19 衍生的菌株(0ΙΕ Terrestrial Manual, 2009-Chapter 2.4.3·-)。在另一個優 選實施方式中，該布魯氏菌菌株屬于馬爾他布魯氏菌。在本發明這個方面的一個甚至更優選的實施方式中，該布魯氏菌菌株是從參考菌株馬爾他布魯氏菌Revl衍生的菌株(0ΙΕTerrestrial Manual, 2009-Chapter 2. 7. 2.-)。“流產布魯氏菌S19”或“流產布魯氏菌bv. lstr. S19”是由John Buck博士于1923年發現的自發減毒株，自從二十世紀三十年代早期以來它被世界范圍地用作有效疫苗用來預防動物體內的布魯氏菌病并且是舉世公認的用于控制牛布魯氏菌病的參考疫苗(0ΙΕ Terrestrial Manual, 2009-chapter 2. 4. 3.-)。原種批次可在美國農業部(USDA,國立獸醫服務實驗室(National Veterinary Services Laboratories) , NVSL-, 1800DaytonRoad, Ames, Iowa 50010,美國)以及在獸醫實驗室機構的OIE的布魯氏菌病參考實驗室(VLA, ffeybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, United Kingdom)得到。該菌株還稱為 NCTC 8038 (http://www. broadinstitute. org/annotation /genome /brucella_group /GenomeDescriptions.html)。“馬爾他布魯氏菌Revl”，“馬爾他布魯氏菌bv. lstr. Rev. I”是稱為NCCBV4a (http ://www.broadinstitute.org/annotation/genome/brucella_group/GenomeDescriptions. html)的菌株，它是自發減毒的并且通過與鏈霉素依賴性相關聯的連續自發突變以及隨后反轉該依賴性從強毒株馬爾他布魯氏菌6056獲得(Herzberg and Elberg 1953.Journal of Bacteriology 66:585-599;Herzberg andElberg 1953. Journal of Bacteriology 66:600-605·)。自從五十年代以來，Revl菌株已經在世界范圍內用作唯一有效疫苗用來預防小型反芻動物體內的布魯氏菌病，并且舉世公認為該參考疫苗能夠控制牛和山羊的布魯氏菌病(0ΙΕ TerrestrialManual, 2009-chapter 2. 7. 2. -)。Revl的原種批號可在AFSSA的OIE的布魯氏菌病參考實驗室(94706Maisons_Alfort，France)以及在歐洲藥典(European Pharmacopoeia) (BP907, 67029Strasbourg Cedex I,法國(France))得到。在本發明的一個優選實施方式中，該哺乳動物是反芻動物。在本發明的另一個優選實施方式中，該哺乳動物是牛，并且甚至更優選地屬于牛或山羊亞科。本發明的另一個方面涉及包括表達GFP蛋白的布魯氏菌菌株，以及優選地藥學上可接受載體的組合物，以下稱為“本發明組合物”。在一個優選實施方式中，該布魯氏菌菌株屬于流產布魯氏菌(物種)。在本發明這個方面的一個甚至更優選的實施方式中，該布魯氏菌菌株是從流產布魯氏菌S19衍生的菌株。在另一個優選實施方式中,布魯氏菌菌株屬于馬爾他布魯氏菌。在本發明這個方面的一個更優選的實施方式中，布魯氏菌菌株是從馬爾他布魯氏菌Revl衍生的菌株。在另一個優選實施方式中，該組合物是疫苗。在另一個更優選的實施方式中，本發明的組合物進一步包括佐劑。在另一個更優選的實施方式中，包括表達GFP蛋白的布魯氏菌菌株的本發明的組合物進一步包括另一種活性成分。可以配制本發明的組合物用于以現有技術中已知的多種方式施用到動物，并且更優選地哺乳動物體(包括反芻動物)內，用作免疫原。這些免疫原還可以在動物體內，并且更具體地在哺乳動物體內用作疫苗，或用于在其中在抗體生產中產生應答。為了配制這類組合物，使免疫學有效量的布魯氏菌菌株與適合施用于哺乳動物(包括人類)體內的生理學可接受的載體相混合。因此，本發明的組合物可以在無菌水溶液中或在生物流體例如血清中存在，但不限于此。這些水溶液可以是緩沖的或非緩沖的并且具有另外的活性或非活性組分。另外的組分包括用于調節離子強度的鹽類，防腐劑類包括但不限于抗微生物劑類、抗氧化劑類、螯合劑類等，以及營養物類包括但不限于葡萄糖、右旋糖、維生素以及礦物質。可替代地，可以制備以固體形式施用的活性成分。該活性成分可以與多種惰性載體或賦形劑結合，包括但不限于粘合劑類例如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑類例如淀粉或乳糖； 分散劑類例如海藻酸或玉米淀粉；潤滑劑類例如硬脂酸鎂、助流劑類例如膠體二氧化硅；甜味劑類例如鹿糖或糖精；或調味劑類例如胡椒薄荷或水楊酸甲酯。本發明的組合物能夠以多種形式(包括但不限于腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、結膜、鞘內、心室內、口腔、腸內、腸胃外、鼻內或皮膚給藥)施用到動物體內，包括哺乳動物，優選反芻動物，并且甚至更優選屬于牛或山羊亞科。得到治療有效量的劑量取決于動物，優選哺乳動物的多種因素(例如年齡、體重、性別、生理狀態-例如懷孕或哺乳狀態-免疫系統的耐受情況)。如在此使用的，術語“治療有效量”是指穩定表達GFP蛋白，產生希望效果的(產生免疫性以及抗GFP抗體)布魯氏菌的數量。可以用于這類組合物中的“佐劑”和“藥學上可接受的載體”是本領域普通技術人員已知的。在此，術語“藥物”是指用于在人類和動物體內預防、診斷、緩解、治療或治愈疾病的任何物質。在本發明的上下文中，它涉及包括穩定表達GFP蛋白的布魯氏菌菌株的組合物，并且該菌株能夠產生對抗布魯氏菌病的免疫性以及抗GFP的抗體，或涉及包括穩定表達GFP蛋白的布魯氏菌的組合物以及藥學上可接受的載體和/或另外地一種佐劑，該組合物能夠產生對抗布魯氏菌病的免疫性以及抗GFP的抗體。因此術語藥物包括疫苗。在本發明的上下文中，術語“疫苗”是指用于建立免疫系統對疾病應答的抗原性組合物或制劑。它是指一旦進入體內就通過產生抗體引起免疫系統應答的抗原制劑，并且生成免疫記憶,產生永久性或暫時性免疫性。在本說明書中，術語“佐劑”是指雖然本身不具有抗原性作用單抗原刺激免疫系統增加其對疫苗應答的試劑。雖然不限于下面各項，鋁鹽“磷酸鋁”和“氫氧化鋁”是在疫苗中兩種最常用的佐劑。還抗原使用其他物質(例如鯊烯)作為佐劑。如在此使用的，術語“活性要素”、“活性物質”、“藥學上活性物質”、“活性成分”或“藥學上活性成分”是指在診斷、治愈、緩解、治療、或預防疾病方面提供潛在藥理學活性或另一種不同作用的任何組分，或它影響了人體或其他動物的結構或功能。該術語包括在制備藥物中促進化學改變并且以預見改變的形式存在于其中的那些組分，該改變的形式提供特異性活性或效果。本發明的另一個方面涉及用于鑒別用本發明菌株或組合物接種的哺乳動物的方法，以下稱為“本發明方法”，包括a)從哺乳動物體內獲得分離的生物樣品，b)在分離的哺乳動物生物樣品中檢測編碼GFP蛋白的gfp基因，或它們的表達產物的存在。在本發明這個方面的一個優選實施方式中，該哺乳動物是反芻動物。在本發明的另一個優選實施方式中，該哺乳動物是牛、綿羊或山羊，并且甚至更優選地屬于牛和山羊亞科。“分離的生物樣品”包括但不限于通過本領域普通技術人員已知的任何方法獲得 的哺乳動物的細胞、組織和/或生物流體。在一個優選實施方式中，該分離的生物樣品是生物流體，例如但不限于奶、精液、精液流體、陰道排出物、結膜排出物、血液、血漿或血清。更優選地，該生物流體是血清。在另一個優選實施方式中，該分離的生物樣品是在哺乳動物的血液、乳汁、精液、陰道排出物或結膜分泌物中找到的細胞。在另一個優選實施方式中，它包括細胞或組織。用于在分離的生物樣品中檢測gfp基因或其表達產物存在的多種方法是現有技術中已知的。在此“gfp基因的表達產物”包括但不限于GFP蛋白例如對抗所述蛋白或抗原由哺乳動物的免疫系統產生的兩種抗-GFP抗體。因此，在本發明這個方面的另一個優選實施方式中，在分類的哺乳動物生物樣品中檢測gfp基因或其表達產物的存在是通過檢測抗GFP蛋白的抗體(抗GFP抗體)來實現的。檢測抗GFP抗體可以通過現有技術中已知的任何方法來實現例如但不限于通過免疫測定法或免疫組織化學。在一個更優選的實施方式中，該免疫測定法是酶聯免疫吸附測定法或ELISA。抗原或免疫原是能夠通過活化淋巴細胞產生適當免疫應答的物質。抗原通常地是蛋白或多糖。只有當與蛋白或多糖結合時，脂類和核酸才是抗原性的。如在此使用的術語“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含與GFP蛋白(抗原)特異性結合(免疫反應)的抗原結合位點的分子。存在免疫球蛋白的五個主要同型或類別IgM、IgD、IgG、IgA 以及 IgE。術語“抗-GFP抗體”是指能夠與GFP蛋白反應，與GFP蛋白變異體或其片段反應的抗體，其條件是所述變異體或片段是功能上等效的。優選地，術語抗GFP抗體是指免疫球蛋白 G (IgG)ο如在本說明書中使用的術語“免疫測定”是指基于抗體與抗原偶聯反應的任何分析技術。現有技術中已知的免疫測定法的實例是但不限于免疫印跡、酶聯免疫測定(ELISA)、線性免疫測定(LIA)、放射性免疫測定(RIA)、免疫熒光、x_譜圖或蛋白或脂多糖芯片(LPS)。如所述，在本發明這個方面的一個優選實施方式中，該免疫測定法是酶聯免疫吸附測定法或 ELISA (Enzyme-Linked TmmunoSorbent Assay)。ELISA 是基于這種假設即抗原將免疫試劑(抗原或抗體)固定在固體支持物上，然后使該系統與包含可以結合到標志物化合物上的互補試劑的流體相接觸。存在不同類型的ELISA :直接ELISA，間接ELISA以及夾心ELISA。
本發明的諸位發明人說明了能夠鑒別已經用新疫苗原型S19-GFPp接種的動物并且將它們與用布魯氏菌強毒株感染的那些動物區分開的血清學診斷的方法。在一個更優選的實施方式中，該ELISA是間接ELISA，并且甚至更優選地它包括下面步驟(a)用至少該GFP蛋白、所述蛋白的變異體、或其片段包被(涂覆,coating)固體支持物；(b)在允許至少抗該GFP抗原的抗體與其變異體或片段形成免疫復合物的條件下 用從哺乳動物體內得到的生物學樣品孵化來自前面步驟的浸潰的支持物；以及(c)與二抗一起孵化，該二抗識別偶聯或結合到標志物分子上的抗GFP抗原的抗體。如在此使用的術語“標志物化合物”是指能夠產生允許檢測抗GFP抗體的生色、生熒光、放射性和/或化學發光信號的化合物。該標志物化合物是選自下列，包括放射性同位素類、酶類、熒光團類或能夠與另一種分子結合或檢測和/或直接定量的任何分子。該標志物化合物可以通過另一種化合物直接地或間接地結合到抗體上。直接結合的標志物化合物的實例是，但不限于，酶類例如堿性磷酸酶或過氧化物酶，放射性同位素類例如32P或35s，熒光團類例如熒光素、若丹明或它們的衍生物類，或金屬顆粒類，用于對應地通過比色法、放射性自顯影、熒光測定法、或金相學直接檢測。在另一個優選實施方式中，在分離的哺乳動物生物樣品中檢測gfp基因或其表達產物的存在是通過紫外照射所述樣品來實現的。在另一個更優選的實施方式中，在分離的哺乳動物生物樣品中檢測gfp基因或其表達產物的存在是通過熒光顯微術來實現的。在另一個優選實施方式中，在分離的哺乳動物生物樣品中檢測gfp基因或其表達產物的存在是通過聚合酶鏈式反應(PCR)來實現的。本發明的另一個方面涉及用于鑒別用本發明菌株或組合物免疫的哺乳動物的“試劑盒”，包括用于實現本發明方法的適當裝置。所述試劑盒可以包含使用上文中所述方法中任何一種對于分析在分離的哺乳動物生物樣品中存在gfp基因或其表達產物所必要的所有那些試劑，例如但不限于GFP蛋白的特異性抗體，或二抗或陽性和/或陰性對照。該試劑盒還可以包括但不限于緩沖劑類、蛋白提取溶液類、用于防止污染的試劑類、蛋白降解抑制劑類等。在通過涉及聚合酶鏈式反應(PCR)技術進行檢測的情況中，它可以包含，但不限于，引物、探針以及對于確定gfp基因或其表達產物的存在所必要的所有試劑。該試劑盒還可以包括但不限于使用緩沖劑、聚合酶、用來獲得其最佳活性的輔因子、用于防止污染的試劑等。另一方面，該試劑盒可以包括所有支持物裝置以及用于將它投入實踐以及優化所需要的容器。優選地，該試劑盒進一步包括用于實現本發明方法的說明書。術語“多核苷酸”和“核酸”在此可互換地使用，是指任何長度核苷酸的聚合物形式，核糖核苷酸(RNA)和脫氧核糖核苷酸(DNA)兩者。術語“氨基酸序列”、“肽”、“寡肽”、“多肽”以及“蛋白”在此可互換地使用，并且是指化學或生物化學修飾的任何長度氨基酸的聚合物形式。貫穿本說明書以及權力要求書，詞語“包括”以及它的變化不旨在排除其他技術特征、添加劑、組分或步驟。對于本領域普通技術人員而言，部分地從本說明書以及部分地從本發明的實踐本發明的其他目標、優點以及特征將變得清楚。下面實例和附圖是作為舉例說明來提供的并且不旨在限制本發明的范圍。
圖I.在胰蛋白酶解酪蛋白大豆瓊脂平板中新疫苗-GFPp S19以及親本疫苗S19的生長，在Bio-Rad生產的“Gel Doc”設備中在用紫外光照射，并且用適當的濾光片(520DF30nm, Bio Rad) (A)或在熒光顯微鏡中(B)進行顯影。圖2.與強毒株流產布魯氏菌2308相比較在新疫苗S19_GFPp中ery區域(低分子量)的PCR擴增。圖3.在感染之后I小時，在用新疫苗S19-GFPp或用親本菌株S19感染的HeLa細胞中的細胞內和細胞外細菌比率。這些HeLa以200CFU/細胞來感染并且I小時之 后，按照前面說明的實驗方案(Chaves-Olarte et al. , 2002. Cellular Microbiology4(10) :663-675)用若丹明和FITC通過雙重免疫熒光進行固定和標記。圖4.在感染后48小時在HeLa細胞以及RAW 264. 7巨噬細胞中新疫苗S19-GFPp以及親本菌株S19的復制。以200CFU/細胞來感染細胞并且按照前面說明的實驗方案來確定CFU/mL的數量(Chaves-Olarte et al. , 2002. CellularMicrobiology 4 (10):663-675;CelIi et al.,2003.Journal of ExperimentalMedicine, 198(4):545-556)。圖5.在鼠類模型中新疫苗S19-GFPp以及親本菌株S19的脾動力學。用IxlO5CFU的新疫苗S19-GFPp或親本菌株S19來腹膜內地接種30只小鼠的組。在感染后第7、14、25、40以及60天，按照前面說明的實驗方案(Sangari et al.，1998.Vaccine, 16 (17) : 1640-1645)將來自每組的6只小鼠處死用來確定每個疫苗菌株CFU/脾的數量并且構建脾繁殖的相應曲線。圖6.在用新疫苗S19-GFPp免疫的BALB/c小鼠體內的保護測定。用IxIO5CFU新疫苗S19-GFPp或親本菌株S19皮下地免疫6只小鼠的組。作為對照，用無菌PBS來接種一組小鼠。在60天之后，用5x104CFU參考強毒株流產布魯氏菌對2308所有小鼠進行實驗地腹膜內感染并且2周后，處死用來對每個脾2308的CFU數量進行計數。用S19-GFPp接種的動物顯示與通過參考疫苗S 19所顯示相類似水平的保護。圖7.在用新疫苗S19-GFPp以及親本菌株S19免疫的小鼠體內對抗布魯氏菌LPS的抗體應答。在未免疫的小鼠(對照)體內以及在免疫之后第7、14、25以及60天在用IxIO5CFU新疫苗S 19_GFPp或親本菌株S19腹膜內免疫的小鼠體內得到血清樣品。將這些血清1/200稀釋于PBS中并且在405nm下以通常地用于診斷動物布魯氏菌病的抗LPS的間接ELISA來測量它們的光密度(0D)。圖上每個點表示基于來自不同小鼠5個血清的平均值。所有動物都產生抗布魯氏菌LPS的抗體。圖8在獲得重組蛋白GST-GFP的鼠體內確定純度和免疫原性。A)通過親和性純化的重組蛋白GST-GST在SDS-PAGE中顯示單一條帶。B)在小鼠體內用作免疫原的GST-GFP蛋白誘導了抗GFP抗體。用對抗10yg/30yLGFP(孔G)的單特異性血清的連續稀釋液(孔2至32)進行免疫擴散反應，并且作為對照，僅使用PBS (孔_)。沉淀條帶顯示在小鼠體內得到的抗-GFP免疫血清顯示1/16的滴度。圖9.使用來自先前用重組蛋白GST-GFP免疫的小鼠(a)或綿羊(b)的血清發展的ELISA-GFP中標準曲線。圖10.在來自用新S19-GFPp疫苗或參考疫苗S19接種的小鼠的血清中抗GFP的抗體應答強度。根據相對于對照樣品陽性率百分比(陽性血清的OD/血清樣品的ODX 100)計算出每個個別血清的反應強度。每個點表示基于來自不同小鼠10個血清的平均值。
具體實施例方式實施例下面將通過由諸位發明人所完成的測定對本發明進行說明。I-流產布魯氏菌S19的熒光疫苗衍生物原型(S19-GFPp)的開發
通過用編碼GFP的質粒進行電穿孔對參照疫苗流產布魯氏菌S19 (從法國AFSSA的OIE布魯氏菌病參考實驗室得到)進行基因修飾。所使用的質粒是從質粒pBBRMCS-2衍生的pBBR-2-gfp,它包含卡那霉素耐受性插入片段(Kovach et al. , 1995. Gene. Vol166:175-176)以及具有處于Iac啟動子控制下的編碼GFP基因的插入片段。已知的是這種質粒構成型地(constitutively)生產GFP,而不整合到布魯氏菌染色體中(Celli etal. , 2003. Journal of Experimental Medicine, 198(4):545-556)。2. _S19_GFPp的遺傳以及微生物學表征2. I.已經發現的是細菌S19-GFPp發出可通過用紫外光直接照射培養物并且隨后用適當的濾光片對其進行顯影(圖1A)或通過在熒光顯微鏡下觀察感染的組織或滲出物(圖1B)而檢測的熒光。因此，質粒pBBR-2-gfp允許以適當比例在布魯氏菌中表達GFP使得在分離之后可能視覺地鑒別新疫苗S19-GFPp。2.2.已經發現的是GFP蛋白在布魯氏菌中的表達未改變細菌培養物中S19的克隆大小以及階段、或它的典型細菌學特征。為此，通過在氟化3天之后在瓊脂平板上獲得的克隆測量直徑來確定克隆大小。平行地，通過在斜光照明的透鏡中并且用結晶紫-草酸鹽溶液使用泛濫技術染色來觀察細菌生長從而確定克隆階段(Alton et al. 1988. Techniquesfor the brucellosis laboratories. In. INRA(Ed.)，Paris, France, 1988，190pp)。另外，使用用于鑒別以及分型布魯氏菌的標準技術對得到的新菌株進行微生物學分析。簡言之，通過測試過氧化氫酶、氧化酶、脲酶以及吖啶黃素凝集來進行屬水平的鑒定。對于種水平的鑒定，使用對細菌噬菌體Tb、Wb、Iz以及R/C靈敏度的測試。最后，對于生物變種水平的分型使用凝集測試，其中在瓊脂平板上進行單特異性血清抗-A和抗-M以及生長測試并且瓊脂補充有10%無菌牛血清(瓊脂-s; Seromed, Biochrom)包含標準濃度的染料(20 μ g/mL硫堇、20 μ g/mL品紅以及100 μ g/mL番紅；Panreac)、抗生素(5UI/mL青霉素；Sigma)以及赤蘚醇(lmg/mL ；Merck)。在37° C下在需氧氣氛中，并且平行地在具有10%C02的氣氛中將包含具有或不具有不同濃度的所有這些產品的瓊脂以及瓊脂-S (對照平板)的平板孵育 2-4 天(Alton et al. 1988. Techniques for the brucellosis laboratories. In. INRA (Ed.), Paris, France, 1988, 190pp)。2. 3.已經發現的是在菌株S19-GFPp中攜帶gfp基因質粒的結合以及活性兩者在它體外以及體內活化之后是穩定的。在這個方面，實現在瓊脂平板上將菌株S19-GFPp連續傳代，并且在數個連續傳代之后，在瓊脂平板以及補充有卡那霉素的瓊脂(用作質粒標志物的抗生素)中進行細菌計數。其結果是，觀察到在兩種培養基中CFU的數量是類似的并且觀察到所有S19-GFPp CFU保持熒光，表明在體外十二次傳代之后在流產布魯氏菌S19中GFP質粒的結合以及活性是穩定的。在從細胞培養物中四個連續傳代以及在前面用S19-GFPp接種的小鼠組織中三個連續傳代(參見下面顯示的生物學表征研究)中分離細菌之后進行同樣試驗，表明甚至在體內、在細胞培養物以及實驗動物體(小鼠)內細菌活化之后在流產布魯氏菌S19中GFP質粒的結合和活性是穩定的。在-80° C或-20° C下在50%甘油中冷凍之后在流廣布魯氏囷S19中編碼GFP蛋白的質粒保持穩定，表明所有恢復的克隆在融化之后放射熒光。2. 4.已經發現的是菌株S19-GFPp保持流產布魯氏菌S19的典型基因型，保留在基因ery中702個bp (堿基對)的特征性缺失(低分子量條帶，圖2)并且有可能從流產布魯氏菌的強毒株中區別疫苗菌株S19 (高分子量條帶，圖2)。
3.-在廣泛用于實驗性布魯氏菌病的細胞以及動物模型(小鼠)體內S19-GFPp的生物學表征。3. I.在細胞模型發現的是3.1.1.-新疫苗S19-GFPp具有附著以及內化到人上皮HeLa細胞中的能力，這些細胞實質上與參考疫苗相同(圖3)。3.1.2.-新疫苗S19-GFPp在HeLa細胞中以及在巨噬細胞中的復制能力實質上與親代菌株S19相同(圖4)。3.2.在動物模型中發現的是3.2.1.-新疫苗S19-GFPp在小鼠體內具有減毒作用，它實質上與典型疫苗S19相同(圖5)，表明所使用的gfp基因表達未改變典型親本疫苗的脾動力學(繁殖以及持久性能力)。3. 2. 2.-新疫苗S19-GFPp提供了保護作用，這實質上與在小鼠模型中典型親本疫苗所提供的相同(圖6)，表明GFP表達未消除典型親本疫苗S19的有效性。3.2.3.-通過對抗 LPS 的常規的間接 ELISA (Marin et al. , 1999.Clinical&Diagnostic Laboratory Immunology 6(2):269-272)測量的，由新疫苗S19-GFPp誘導的，對抗流產布魯氏菌LPS抗原的抗體應答，與通過典型疫苗S19產生的相類似(圖7)。這表明新疫苗S19-GFPp保持其免疫原性特性的完整性。3. 2. 4.-在布魯氏菌S19-GFPp疫苗菌株中表達的GFP在動物體內是高免疫原性的。在免疫接種之后用S19-GFPp免疫的所有小鼠都產生了對GFP的特異性抗體持續至少90天，其中在于此說明的ELISA-GFP原型中陽性率約40% (在統計上大于陽性對照所顯示的)。4.-用于檢測在免疫小鼠體內由S19-GFPp產生的抗體的間接ELISA的設計和標準化(ELISA-GFP)。4.1.首先，根據前面所述的實驗方案對重組GFP蛋白(GST-GFP)進行表達以及純化(Harlow and Lane 1988. Antibodies: a laboratory manual. 1st. Ed. Cold SpringHarbor Laboratory, NY p. 179-179)。簡言之，在具有質粒pGEX-GFP的大腸桿菌XLl-藍色系統中表達融合蛋白GST-GFP，通過親和層析法對它進行純化并且通過丙烯酰胺凝膠電泳對它的純度進行確定(圖8A)。4.2.隨后，按照常規的免疫實驗方案在小鼠體內得到抗GFP的對照血清。為此，施用具有弗氏完全佐劑的100 μ g GST-GFP蛋白的注射劑，緊接著以一周的間隔用具有弗氏非完全佐劑的GST-GFP蛋白進行2次連續的免疫。進行免疫持續數周直至證實用GST-GFP免疫的動物血清在對抗純GFP蛋白的凝膠免疫擴散中顯示沉淀條帶(圖SB)。這些對照抗體顯示與任何布魯氏菌抗原無交聯反應(結果未顯示)。另外，按照常規免疫實驗方案在綿羊體內得到抗GFP的對照血清。為此，注射具有弗氏完全佐劑的IOOyg GST-GFP蛋白，緊接著以兩周間隔用具有弗氏非完全佐劑的GST-GFP蛋白進行5次連續免疫。進行免疫持續2個月直至證實用GST-GFP免疫的動物血清在對抗純GFP蛋白的凝膠免疫擴散中顯示沉淀條帶(結果未顯示)。這些對照抗體顯示與任何布魯氏菌抗體無交聯反應(結果未顯示)。4. 3.為了對能夠在綿羊血清中以及接種有新疫苗S19-GFPp的小鼠血清中特異性檢測對抗GFP蛋白的抗體的間接ELISA進行標準化(ELISA-GFP)，步驟如下
4. 3. I.用包含在一個體積100 μ L/孔處于PBS (PBST，Sigma)中的O. 01%吐溫20緩沖液中的I μ gGST-GFP/孔包被96孔板Immunolon II (Nunc Co.)的多個板。用粘性塑料(Sigma)覆蓋這些孔板并且在37° C下孵育2小時同時攪拌，緊接著在4° C下不攪拌另外孵育15小時。最后，將30%甘油添加到各孔中，用粘性塑料覆蓋這些孔板并且在-20° C下冷凍直至使用。4. 3. 2.為了用小鼠血清建立校準曲線，在部分4. 3. I中所述的孔板允許在室溫下融化并且用包含處于PBS(PBST-BSA)中O. 01%吐溫以及O. 1%脫脂牛白蛋白的溶液洗滌4次。然后，一式三份地添加處于1/300至1/60000間來自在部分4. 2.中所述小鼠的抗-GFP免疫血清的lOOyL/孔稀釋劑。作為陰性對照，使用來自無布魯氏菌小鼠的常規血清，并且使用PBS作為空白。在25° C下將這些孔板孵育I小時同時攪拌，用PBST-BSA洗滌4次，添加對抗小鼠IgG(H+L)偶聯到過氧化物酶(HRP)上的偶聯物(從兔體內得到的);如前面所述第二次將它們孵育(在25° C下I小時，同時攪拌)并且洗滌(4次)，并且最后添加ABTS過氧化物酶底物(Sigma)。在ELISA酶標儀中在405nm波長下完成在每孔中產生的OD讀數并且如圖9. a.中所示建立標準曲線。4. 3. 3.為了用綿羊血清建立校準曲線，在部分4. 3. I中所述的孔板允許在室溫下融化并且用包含處于PBS(PBST-BSA)中O. 01%吐溫以及O. 1%脫脂牛白蛋白的溶液洗滌4次。然后，一式三份地添加處于1/59至1/128000之間的在點4. X中所述來自綿羊的抗-GFP免疫血清的100 μ L/孔稀釋液。關于陰性對照，使用來自無布魯氏菌免疫的常規血清，并且將PBS用作空白。在37° C下將這些孔板孵育I小時同時攪拌，用PBST洗滌4次；將蛋白G-過氧化物酶(Sigma)添加到處于pH 7. 2PBS中1:2000的稀釋液中；如前所述第二次將它們孵育(在25。C，I小時，同時攪拌)并且洗滌(4次)，并且最后添加ABTS過氧化物酶底物(Sigma)。在ELISA酶標儀中在405nm波長下完成在每個孔中產生的CD的讀數并且如圖9. b.中所示建立標準曲線。4.3.4.為了確定在用新疫苗接種的小鼠體內誘導的抗GFP抗體應答的強度，使用來自用新疫苗S19-GFPp或來自未標記的親本菌株S19的疫苗接種(IxIO5CFU/小鼠，腹膜內地)的小鼠體內的“問題”血清，并且在免疫之后3至14周之間對動物周期性地取血(圖10)。關于陽性對照，使用如在部分4. 2.中說明的血清，并且關于陰性對照，使用在部分4. 3. 2中說明的那些。所有這些血清以1/200的比例稀釋于PBST中并且如下完成ELISA-GFP :如在部分4. 3. 2中所述對在部分4. 3. I中所述的孔板進行洗滌；然后添加100 μ I/孔的上述血清(1/200稀釋)或100μ I/孔的PBS (作為反應的空白)，并且最后，如4. 3. 2中所述對這些孔板進行處理。相對于陽性對照血清(100%陽性)和空白樣(0%陽性)的光密度(OD4tl5=O. 9)計算出每個單獨血清的陽性率百分比。用S19-GFPp接種的所有動物顯示抗GFP的強烈血清學反應(約40%陽性；圖10)而用菌株S19接種的動物行為類似于無布魯氏菌的那些(陰性對照)，無對抗GFP蛋白的反應(圖10)。總之，這項工作顯示可以在布魯氏菌疫苗菌株中表達GFP蛋白而不改變親本菌株的生物學特性，同時在動物體內誘導可與由其他布魯氏菌菌株誘導的清楚地區別開的血清學應答。可以通過對抗在該親本體內發展的GFP的間接ELISA來鑒別對抗GFP蛋白產生的抗體。此外，該gfp基因結合到布魯氏菌體內提供了視覺鑒定(通過紫外光或熒光顯微鏡) 以及分子鑒定(通過PCR擴增該gfp基因；PCR-GFP)兩者從細菌培養物以及組織樣品、滲出物或動物流體發展的布魯氏菌疫苗菌株。
權利要求
1.表達綠色熒光蛋白(GFP)的布魯氏菌菌株在開發藥物中的用途。
2.根據權利要求I所述的布魯氏菌菌株在開發用于預防哺乳動物體內布魯氏菌病的藥物中的用途。
3.根據權利要求1-2中任一項所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株屬于流產布魯氏菌。
4.根據權利要求3所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株是從參照株流產布魯氏菌S19衍生的菌株。
5.根據權利要求1-2中任一項所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株屬于馬爾他布魯氏菌。
6.根據權利要求5所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述布魯氏菌菌株是從參照株馬爾他布魯氏菌Revl衍生的菌株。
7.根據權利要求2-6中任一項所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述哺乳動物是反芻動物。
8.根據權利要求7所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述反芻動物屬于牛亞科。
9.根據權利要求7所述的布魯氏菌菌株的用途，其中所述反芻動物屬于山羊亞科。
10.包括根據權利要求1-9中任一項所述的表達綠色熒光蛋白(GFP)的布魯氏菌菌株的組合物。
11.根據前一權利要求所述的組合物，進一步包括藥學上可接受的載體。
12.根據權利要求10-11中任一項所述的組合物，該組合物是疫苗。
13.根據權利要求10-12中任一項所述的組合物，進一步包括佐劑。
14.根據權利要求10-12中任一項所述的組合物，進一步包括另一種活性成分。
15.用于鑒別用根據權利要求10-14中任一項所述組合物治療的哺乳動物的方法，包括 a.獲得從所述哺乳動物體內分離的生物樣品， b.在從所述哺乳動物體內分離的生物樣品中檢測gfp基因或它的表達產物的存在。
16.根據前一權利要求所述的用于鑒別治療的哺乳動物的方法，其中從所述哺乳動物體內分離的生物樣品是生物流體。
17.根據權利要求15所述的用于鑒別治療的哺乳動物的方法，其中從所述哺乳動物體內分離的生物樣品是細胞或組織。
18.根據權利要求15-17中任一項所述的用于鑒別治療的哺乳動物的方法，其中在從所述哺乳動物體內分離的生物樣品中檢測gfp基因的表達產物是通過檢測抗-GFP抗體來實現的。
19.根據權利要求18所述的用于鑒別治療的哺乳動物的方法，其中檢測所述抗-GFP抗體是通過免疫測定法來實現的。
20.根據權利要求19所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動物的方法，其中所述免疫測定法是酶聯免疫吸附測定法(ELI SA)。
21.根據權利要求20所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動物的方法，其中所述ELISA測定法是間接ELISA。
22.根據權利要求15-17中任一項所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動物的方法，其中檢測所述gfp基因或它的表達產物是通過紫外光實現的。
23.根據權利要求15-17以及22中任一項所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動物的方法，其中檢測所述gfp基因或它的表達產物是通過熒光顯微術實現的。
24.根據權利要求15-17中任一項所述的用于鑒別用所述菌株或組合物治療的哺乳動物的方法，其中檢測所述gfp基因或它的表達產物是通過聚合酶鏈式反應實現的。
25.用于鑒別用根據權利要求1-14中任一項所述的菌株或組合物治療的哺乳動物的試劑盒，包括用于實現根據權利要求15-24中任一項所述的鑒別方法的適當裝置。
26.根據前一權利要求所述的鑒別試劑盒，包括用于檢測所述抗-GFP抗體的適當裝置。
27.根據權利要求25-26中任一項所述的鑒別試劑盒，包括具有序列SEQID N0:2以及SEQ ID NO:3 的引物。
全文摘要
本發明涉及表達綠色熒光蛋白(GFP)的布魯氏菌菌株在制備用于預防哺乳動物體內布魯氏菌病的藥物中的用途，涉及對抗布魯氏菌病的疫苗，以及涉及用于鑒別已經施用所述疫苗的哺乳動物的方法。優選地，本發明方法是免疫測定法，并且更優選地它是酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。
文檔編號A61K39/10GK102781468SQ201080063027
公開日2012年11月14日 申請日期2010年11月29日 優先權日2009年12月3日
發明者卡泰麗娜·古茲曼韋里, 卡洛斯·洽孔迪亞茲, 埃德加·莫雷諾羅布萊斯, 埃斯特班·查維斯奧拉特, 比阿特麗斯·阿莫雷納扎巴爾扎, 瑪麗亞·格里洛多爾賽特, 達米安·德安德烈斯卡拉 申請人:哥斯達黎加國立大學, 哥斯達黎加大學, 納瓦拉公立大學, 西班牙高等科研理事會