專利名稱：干擾素類似物的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域。尤其涉及表現出較少不期望的副作用的干擾素(IFN)的生物活性類似物(analog)及其治療應用。
背景技術：
已經在哺乳動物中識別出大約十種不同的IFN ;這些中的七種為人干擾素。它們通常分為三類IFN :1型IFN、II型IFN以及III型IFN。所有的I型IFN都結合到稱為IFN- α受體(IFNAR)的特異細胞表面受體復合物，該IFN-α受體由IFNARl和IFNAR2鏈組成。人體中存在的I型干擾素為IFN-a ,IFN-β以及IFN-ω。II型干擾素結合到IFNGR。在人體中，這是IFN-Y。通過與它們的特異細胞表面受體相互作用，IFN激活信號傳導物和轉錄活化因子(STAT)的復合物；STAT是調節某些免疫系統基因的表達的轉錄因子的家族。一些STAT由I型和II型IFN兩者激活。然而，每種IFN類型也能夠激活獨特的STAT (Platanias， L. C. 2005Nature reviews. Immunology 5(5) :375-386)。屬于所有IFN類別的IFN對于對抗病毒感染非常重要。雖然它們是以它們在宿主細胞內“干預”病毒復制的能力而命名的，但是IFN具有其他的功能它們激活免疫細胞，例如天然殺傷細胞和巨噬細胞；它們通過上調抗原呈遞至T-淋巴細胞的抗原來增進感染或腫瘤細胞的識別；并且它們增強未受侵染的宿主細胞抵抗由病毒引起的新感染的能力。某些宿主癥狀，例如肌肉疼痛或發燒，與感染期間IFN的產生有關。IFNy是由激活的免疫細胞產生的多效細胞因子。它通過幾乎在所有細胞類型上表達的IFN Y受體發揮作用，然而，它表現出嚴格的種屬特異性。IFNy已經應用于免疫、病毒以及腫瘤疾病的治療(Younes and Amsden, J Pharm Sci2002),具有明顯的效果。另外,幾項研究已經表明在腎和肝纖維化方面IFNy的潛在作用(Kidney Int. 1999 ；56 =2116-27,Hepatology 1996 ；23 :1189-99)。遺憾的是，目前可提供的干擾素的短的循環半衰期和不希望的全身性副作用已限制了它的臨床應用，并且甚至使臨床試驗停止了。為克服這些問題已經做了許多嘗試，例如將IFNy并入脂質體、微球體以及彈性體內(Pharm Res. 200017 42-8,Pharm Res. 199613 1464-75，J Control Release. 2005102 :607-17)。迄今為止，還沒有使用特定的細胞傳送途徑。因為這樣的途徑對于需要傳送到它們自己的受體以引起生物學效應的細胞因子通常認為是不可能的，從而它們總是在表達這些受體的靶細胞中結束的事實，這并不令人吃驚。因此傳送到其他靶受體在多數情況下將是無用的并且至多引起在其他細胞類型中導致活性喪失或不利影響的進一步多樣化的攝取。然而，本發明人意識到INF的結構提供獨特的靶向機會，因為其分子包括種屬特異性的受體結合部分和非種屬特異性并在細胞內發揮作用的信號傳導部分。驚奇地發現，INFy獨特的結構允許將IFNy的信號傳導部分傳送到另一靶受體，前提是該新的靶受體能實現該信號傳導部分的細胞內釋放以及細胞內/細胞核的INFy信號傳導路徑的隨后激活。例如，當與全長的IFNy或非靶向的IFNy模擬物相比較時，靶向血小板衍生生長因子(PDGF,Platelet Derived Growth Factor)受體的截短的IFNy模擬物在急性肝損傷小鼠模型中顯示出明顯少的全身性副作用。
發明內容
因此，本發明涉及干擾素類似物(IFN)，其中，介導結合到它的天然受體的部分至少被功能性破壞，并且其中該類似物包括能夠介導細胞內IFN活性的信號傳導部分，可選地通過接頭，所述信號傳導部分提供在它的N-端，具有能夠結合到不同于IFN受體的細胞表面受體的至少一個靶向域。優選地，該類似物為IFNy (IFNy)類似物。提供有異源性靶向部分的干擾素類似物是本技術領域內已知的。W02008/068621公開了 IFNy和靶向部分的偶聯產物，例如腫瘤靶向部分或腫瘤脈管系統靶向部分。現有技術僅公開了偶聯到全長的IFNy的偶聯物，其仍然結合到它的天然受體，導致不利影響。EP0844252旨在提供環肽及其制備方法，其允許隨后在所述環肽上化學接枝或偶合，也就是說它們附著在固體支撐體上、高分子量化合物上、標記物上和/或其他環肽上， 以提供特別是在親和色譜法、免疫、診斷檢測開發、疫苗和藥物組合物領域內新的或改進的生物科技應用。它教導了將環肽配體偶合到生物分子，特別是偶合到干擾素。在EP0844252中沒有提及結合到它的天然受體的缺乏功能結合域的截短的IFN分子的用途。相對于(改性的)全長干擾素的應用，不僅在它的治療應用(由于較低的分子量具有更少的副作用、提高的功效、降低的抗原性)方面而且在它的制備方法(重組合成)方面，本發明的干擾素類似物具有明顯的出人預料的優點。介導結合到它的天然受體的部分的功能性破壞能夠通過缺失、插入、取代受體結合域的一個或多個相關的氨基酸殘基實現。干擾素受體結合域已經被識別并且在本領域內是已知的。例如，小鼠IFNy向INFy受體的結合能夠通過至少部分地缺失第一 40、30或20N-端殘基而被破壞。在一個實施方式中，該類似物為截短的只包括參與細胞內信號傳導的殘基的IFNy多肽。如文中所用，細胞內信號傳導可以包括核易位和/或抗病毒活性。優選地，介導細胞內活性的信號傳導部分包括在人和小鼠IFN的C-端發現的多兀核定位信號(NLS, nuclear localization signal)基序(Subramaniam 等，2000, J. CellScience, 113，2771-2781)。該NLS基序被認為形成具有信號傳導物和轉錄活化因子(STAT)的復合物；STAT是調節某些免疫系統基因的表達的轉錄因子的家族。一些STAT由I型和II型兩種類型的IFN激活。然而，每種IFN類型也能夠激活獨特的STAT (Platanias，L. C. 2005Nature reviews. Immunology 5(5) :375-386)。STAT 活化引發對所有 IFN 定義最明確的細胞信號傳導路徑，經典的Janus激酶-STAT (JAK-STAT)信號傳導路徑。在該路徑中，在受體與IFN結合之后，JAK與IFN受體聯合，磷酸化STATl和STAT2。結果，IFN刺激基因因子 3 (ISGF3，IFN-Stimulated Gene Factor 3)復合物形成-其包括 STAT1、STAT2 以及稱為IRF9的第三轉錄因子-并且移動到細胞核內。在細胞核內部，ISGF3復合物結合到某些基因的促進劑中稱為IFN刺激響應單兀(ISRE, IFN-Stimulated Response Element)的特定的核苷酸序列；這誘導這些基因的轉錄。本申請提供的類似物可以包括多元NLS基序，該多元NLS基序包括氨基酸序列(R)KRXRS (R)，其中X為任何氨基酸殘基，優選地，其中X為R、K、S或T。優選地，該NLS基序出現在該類似物的C-端。在一個實施方式中，它包括序列，優選C-端序列RKRKRSR，KSKRSR，KRTRS 或 KRTRSQ。在特定的方面，該信號傳導部分包括選自由以下氨基酸序列組成的組中的序列或由選自由以下氨基酸序列組成的組中的序列組成(a)氨基酸序列 KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR ；(b)氨基酸序列 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ 或 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ ；(c)氨基酸序列 AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC ；(d) (a)、(b)或(C)的所述序列的至少10個，優選至少15個鄰接氨基酸的延伸物(stretch)； (e)表現出與(a)或(b)或(C)至少70%，優選至少80%，更優選至少90%的同一性的氨基酸序列，前提是細胞內信號傳導活性得以保持；以及(f) (a)、(b)或(C)的氨基酸序列，其中至多10個、優選至多8個、更優選至多5個氨基酸殘基被缺失、添加或取代，前提是所述信號傳導活性，例如核易位得以保持。(g)共有序列 VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS,其中 x 為任何氨基酸殘基；(h)共有序列 VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS,其中 x 為任何氨基酸殘基；⑴共有序列Vxxxx[V/I]Q[R/H] [Q/K]A[F/V/I] [N/H]ELI [R/Q]Vx[H/A] [Q/E]L[L/S]P[E/A] [S/A] [S/A] [L/K]xxKRKRS，其中 x 為任何氨基酸殘基。(a)的氨基酸序列表示截短的小鼠IFNy序列；(b)的序列為人同源物；以及(C)的序列為大鼠同源物。優選地，本發明的類似物包括(a)、(b)或(C)序列的至少10個，優選至少15個,更優選至少20個鄰接氨基酸的延伸物。在一個實施方式中，所述延伸物包括(a)或(b)或(C)的序列的N-端序列。在另一個實施方式中，所述延伸物包括(a)、(b)或(c)的序列的C-端序列，優選至少最后15個氨基酸。在又一實施方式中，該延伸物包括(a)或(b)或(c)的序列的間插序列。示例性的序列為LLPESSLRKRKRSR，KFEVNNPQVQRQ,QAFNELIRVVHQLL, MAELSPAAKTGKRTRSQ, YSVTDLNVQRKAI,KAIHELIQVMAELS。技術人員將會理解具有對(a)或(b)或(C)的序列進行一個或多個氨基酸改變的變體也屬于本發明的范圍。(a)或(b)或(C)的氨基酸序列，其中至多10個，優選至多8個，更優選至多5個氨基酸殘基被缺失、添加或取代，前提是信號傳導活性，例如核易位得以保持。人和小鼠的IFNy序列的比對表明36個殘基中的15個(41% )是相同的，并且36個殘基中的24個(66%)是帶正電荷的。根據clustal W對比軟件進行同一性匹配。人干擾素Y 4YSVTDLN VQR K AIHELIQV MAELS PAAKTG KRTRSQ39+ V + VQR + A +ELI+V + +L P+ KR RS+小鼠干擾素Y3FEVNNPQ VQRQ AFNEL I RV VH QLL PESS LRKRK RS R38在序列之間的線表示保守殘基，產生上文(g)表示的共有序列。人、大鼠以及小鼠干擾素Y的比對能夠提供(h)和⑴的共有序列。在一個實施方式中，類似物包括根據上述共有序列(g)、(h)或⑴的信號傳導部分。
其他有用的序列包括表現出與(a)或(b)或(C)至少70%，優選至少80%，更優選至少95%的同一性的氨基酸序列，前提是細胞內信號傳導活性得以保持。在特定的方面，該類似物包括根據以下共有序列的信號傳導部分Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4V a I Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9G I n Xaa10Xaa11Ala Xaa12Xaa13Glu Leu He Xaa14Val Xaa15Xaa16Xaa17Leu Xaa18Pro Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24Xaa25,其中Xaa1、Xaa2、Xaa3Xaa4Xaa6Xaa11、Xaa13、Xaa14、Xaa16Xaa17、Xaa18Xaa19Xaa20
Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24 以及 Xaa25 為任何氨基酸殘基；Xaa5為極性的、不帶電荷的殘基，例如Asn或Thr ；
Xaa7為非極性的、疏水性的殘基，例如Pro或Leu ；Xaa8為極性的、不帶電荷的殘基，例如Gln或Asn ；Xaa9為非極性的疏水性殘基，例如Val，Ile或Leu ；Xaa1Q為極性的堿性殘基，例如Arg，His或Lys ；Xaa12為非極性的疏水性殘基，例如Phe，Val或Ile ;Xaa15為非極性的疏水性殘基，例如Val，He, Met。優選地，類似物包括對應于小鼠IFN Y中的殘基95 133或人IFN Y中的殘基95 134的序列作為信號傳導部分。該序列具有抗病毒活性(Mujtaba等，2006，Clinicaland Vaccine Immunology,第 13 卷，第 8 期，944-952 頁)。類似物的信號傳導活性可以容易地通過本領域內已知的方法測定。例如，如由Subramaniam等所描述的，類似物被小鼠巨噬細胞細胞系細胞內攝取時能夠測定類似物的誘導STATl α核易位的能力。信號傳導活性也能夠通過Statl α轉錄因子和Statl α細胞核輸入者的復合物的形成來評估(2001, J. Interferon Cytokine Res. 21 (11) :951-959)。其他合適的體外試驗包括小鼠巨噬細胞中例如，RAW細胞系中的NO-產生。在一個實施方式中，該類似物表現出它的全長干擾素的相似物的至少30%，優選至少50%，更優選至少75%的(體外)活性。細胞特異性靶向能夠明顯地提高表現出相對低的體外活性的類似物的體內功效。如上文所述，本發明的類似物的特征在于不存在功能性IFN受體結合域并且存在能夠結合到替代的受體的靶向域，該替代的受體能夠介導上述類似物的細胞內攝取，例如在配體結合時和/或作為恒定受體運轉(receptor turnover)的部分進入胞內路徑的受體。將會被理解的是，被靶向的替代的或“第二”受體應該具有一定程度的細胞類型特異表達。廣泛表達的受體是不太合適的候選者。而且，受體必須表達在對細胞內信號傳導部分作出響應的細胞上，例如在IFNy類似物的情況下，它必須包括IFNy響應單元。優選地，靶向域能夠結合到對成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞特異的受體，例如成肌纖維細胞、肝門成纖維細胞(portal fibroblast)、系膜細胞、間質成纖維細胞、肺泡成纖維細胞或基質細胞。還可以想象的是表達在腫瘤細胞上的受體。IFN Y類似物能夠在腫瘤細胞中誘導細胞凋亡，該腫瘤細胞能夠通過表達在腫瘤細胞上的第二受體被特異性靶向。在一個實施方式中，上述受體選自由TOGF受體、膠原蛋白VI型受體以及細胞因子受體組成的組，該細胞因子受體包括TGFP受體、TNFa受體和ILlP受體、胰島素生長因子受體、VEGF受體以及趨化因子受體(例如CXCR4)。當該類似物靶向I3DGF受體，優選TOGF-β受體時，獲得非常好的結果。其他合適的靶向域包括細胞粘附肽，例如三肽Arg-Gly-Asp(RGD)，其起初被識別為介導細胞附著的纖維連接蛋白中的序列。RGD基序現已經在很多種其他蛋白質中發現并且在這些蛋白質中的許多但不是全部中支持細胞粘附。整合素，一個細胞表面蛋白質家族，擔當細胞粘附分子的受體。一亞類的整合素識別在它們的配體內的RGD基序，RGD的結合介導細胞-基質和細胞-細胞之間的相互作用。包含RGD的類似物能夠用作治療諸如血栓癥和癌癥等疾病的治療劑。在特定的方面，靶向域靶體能夠結合到低聚糖和糖蛋白的受體，優選結合到脫唾液酸糖蛋白(ASGP)受體或甘露糖受體(CD206)。例如，該靶向域為偶聯到載劑分子的低聚糖，優選為甘露糖或乳糖。在另一個實施方式中，甘露糖-6-磷酸鹽(M6P)或其衍生物能夠用作M6P/IGF II受體的靶向域。例如參見EP1117443。上述靶向域優選為蛋白質物質(肽)，使得類似物作為一個整體為能夠被容易地制備，例如重組制備的融合多肽。然而，非蛋白質的其他類型的靶向域也是可以想象的，例 如糖類、脂類、核酸類、合成的分子及其類似物。在一個方面，靶向域包括至少一個環肽部分。肽能夠通過不同的方式環化，包括形成半胱氨酸-二硫醚(disulfide)或羊毛硫氨酸橋。用于將本發明的類似物靶向期望的細胞類型的環肽在本技術領域內描述。例如，EP1117443公開了包括編碼細胞受體識別肽(RPR,Receptor Recognising Peptide)的至少一個序列的環肽。在一個實施方式中，本發明的類似物在它的(環化的或線性的)靶向域中包括選自由RGD、KPT、SRN、NLI以及LID組成的組中的至少一個氨基酸序列。優選的實施方式涉及具有靶向域的類似物，該靶向域優選以(環)肽部分的至少一個串聯重復部分的形式包括多個受體結合序列。該串聯重復部分可以包括通過I 5個氨基酸的接頭連接的兩個環肽部分，該兩個環肽部分優選為相同的環肽部分。這特別有利于靶向以二聚體為活性的受體，例如H)GF、TGF0或IL-10受體。在一個實施方式中，靶向域包括一段，優選兩段氨基酸序列X1SRNLIdX2，其中X1和X2表示能夠一起形成(肽)鍵，從而形成環結構的部分，其中序列SRNLID是環的一部分。該兩段氨基酸序列優選由I 7個氨基酸的接頭序列間隔開。優選地，X1和X2為Cys殘基。本發明人發現包括氨基酸序列CSRNLIDC-接頭-CSRNLIDCS的靶向域在結合到二聚I3DGFii受體上非常有效，其中，該接頭為I 7個氨基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6或7個氨基酸殘基的氨基酸序列。例如，他們進行了比較實驗，其中能夠結合至TOGF受體的兩種環肽通過由6個氨基酸組成的間隔區(spacer)彼此連結，而在另一種結構中，這兩種環肽由11個氨基酸的間隔區偶合。在這兩種結構中，間隔區包括賴氨酸殘基以允許藥物或示蹤劑的偶合。兩種雙環用FITC標記并且加入到3T3細胞培養液中，表達TOGF受體并且培養2hr以檢測上述結合。在培養及用抗FITC的抗體染色之后，免疫細胞化學數據表明包括6個氨基酸的間隔區的結構顯著結合，而包含11個氨基酸的較長間隔區的結構僅被觀察到低程度的結合。在一個實施方式中，接頭可以由4個或5個氨基酸殘基組成，優選選自Gly、Ala、Ser以及Thr殘基的組，更優選它們中的至少三個為甘氨酸殘基。優選的接頭由序列K(GS)niGG組成，其中m為I或2。作為一個具體實例，靶向域包括氨基酸序列 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGSGSGG CSRNLIDCS 或由氨基酸序列CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS 組成。在另一實施方式中，上述接頭由5或6個氨基酸殘基組成,優選選自Asp、Lys、Gly、Ala、Ser以及Thr殘基的組。具有4 7個殘基，至少4個殘基，優選地至少5個殘基為甘氨酸殘基的接頭得到了好的結果。其他合適的接頭包括4 7個殘基的序列,殘基選自Gly以及Asp殘基,例如[GnDm],其中n+m為4至7，其中η彡4并且M為O和3之間的整數。在具體實施方式
中，靶向域包括氨基酸序列 CSRNLIDC [GnDm] CSRNLIDC 或由氨基酸序列 CSRNLIDC [GnDm] CSRNLIDC 組成，其中 n+m 為 4 至7，其中η彡4，并且M為O和3之間的整數。例如靶向域由序列CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC，CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDC ⑶DGGCSRNLIDC 或 CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC 組成或包括這些序列。靶向域可以以任何方式附著到信號傳導域上，例如通過接頭或間隔區序列。合適的接頭序列在長度上典型為至多15個氨基酸殘基，優選至多10個氨基酸殘基。可使用聚丙胺酸接頭。例如，本發明提供一種干擾素Y類似物，由序列CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLP ESSLRKRKRSR, CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQ AFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR或 CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDCSAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR 組成。
靶向域也能夠通過載劑分子，例如白蛋白附著在信號傳導域上。如果靶向域為非蛋白質的物質，例如諸如甘露糖或乳糖等低聚糖，這特別有利。在一個實施方式中，載劑分子包括自由的反應性基團，例如羥基、胺和/或硫酸酯。載劑的大小優選為內源性血漿蛋白質，例如白蛋白、乳鐵傳遞蛋白或纖維連接蛋白。 本發明也涉及包括結合到雙環PDGF-祀向域的興趣化合物(compound ofinterest),例如生物活性分子的偶聯物(conjugate),所述祀向域包括兩段氨基酸序列X1SRNLIdX2，其中，X1和X2表示一起能形成鍵的部分，例如形成肽或二硫醚鍵，從而形成雙環結構，其中序列SRNLID為每個環的一部分。優選地，X1和X2為能通過形成二硫醚鍵實現環化的Cys殘基。根據本發明的偶聯物的特征在于兩段氨基酸序列通過2 7個氨基酸的接頭序列隔開。驚奇地發現這種特定的間隔區長度能實現TOGF受體的高效靶向，TOGF受體以二聚體具有活性。因此，也提供了一種偶聯物，其包括偶聯到靶向域的興趣化合物，所述靶向域包括氨基酸序列X1SRNLIdX2-接頭-X3SRNLIdX4,其中，X1和X2對以及X3和X4對能夠形成(肽)鍵，從而形成雙環結構，其中，序列SRNLID為環的一部分，并且其中接頭為由2 7個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。如上文所討論的，接頭可以由4或5個氨基酸殘基組成。它們能夠選自Gly、Ala、Ser、Asp、Lys以及Thr殘基的組,優選它們中的至少3個為甘氨酸殘基。優選的接頭由序列K(GS)mGG組成，其中，m為I或2。作為具體實例，靶向域包括氨基酸序列 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGSGSGGCSR NLIDCS 或由氨基酸序列CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGS GSGGCSRNLIDCS 組成。在另一個實施方式中，上述接頭由5或6個氨基酸殘基組成,優選選自Asp、Gly、Ala、Ser以及Thr殘基的組。具有4 7個殘基，至少4個殘基，優選至少5個殘基為甘氨酸殘基時獲得良好的結果。其他合適的接頭包括4 7個殘基的序列，這些殘基選自Gly和Asp殘基，例如[GnDm]，其中，n+m為4到7，其中η > 4并且M為O和3之間的整數。在具體實施方式
中，靶向域包括氨基酸序列CSRNLIDC[GnDJCSRNLIDC 或由氨基酸序列 CSRNLIDC[GnDjCSRNLIDC 組成，其中 n+m 為 4 至7，其中η彡4并且M為O和3之間的整數。例如靶向域由序列CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC，CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC 或 CSRNLID CGGGGGGCSRNLIDC 組成或包括這些序列。將序列SRNLID用作細胞靶向域在本技術領域內已為人所知。W000/23113公開了包括受體識別肽(RRP)的環肽向大于5000道爾頓的載劑分子，例如血清白蛋白的偶聯。示例性RRP為I3DGF受體結合序列XSRNLIDCX，其中，X表示環化的位置。它教導了在環肽結構中，可存在多個RRP序列。它也公開了多于一個(例如5 15個環肽)附著到載劑分子。Hagens等(2007), Pharmaceutical Res.，第24卷，566-574頁,表明偶聯到白蛋白的環肽CSRNLIDC向肝臟星狀細胞的傳輸。因此，現有技術的偶聯物都依賴于將RRP附著到載劑分子上。本發明的偶聯物的結構，其中環部分沒有附著到載劑分子上，取而代之的是置于具有2 7個氨基酸的特定間隔區長度的串聯基序中，沒有在本技術領域內教導或建議過。發現與根據W000/23113的結合物相比，該定義明確的雙環結構改善了結合到二聚TOGF受體的偶聯物，其中根據W000/23113的偶聯物中附著到載劑上的多個受體結合序列的數目和空間取向是任意的并且缺乏控制。固定本發明結合物中兩個環部分之間的距離的串聯構型被 設計用于與二聚TOGF-受體發生最佳的相互作用。而且，相對大的載劑分子的存在能夠通過位阻現象降低受體之間的相互作用。雙環肽可以化學制備或通過重組技術制備，這提供了非常有利于藥物產業的生產方法。另外，雙環結構能夠直接附著在化學本體上(藥物或示蹤劑)、聚合物(例如，聚乙二醇，PEG)，產生細胞特定低分子量化合物的小的肽或蛋白質，其中，細胞特定低分子量化合物能夠容易地滲透到血管外組織。特別是對于腫瘤靶向目的，該組織滲透可具有非常重要的作用。使用由3 5個氨基酸殘基組成的接頭獲得非常好的結果。在一個實施方式中，偶聯物包括氨基酸序列CSRNLIDC-接頭-CSRNLIDCS (BiPPB)，其中，接頭為2 7個，優選3 5個氨基酸殘基的氨基酸序列。該雙環肽適合用作對I3DGF受體(TOGF-R)具有高親和力的低分子量靶向配體。所述肽可以通過化學法或重組合成法制備。所述接頭可以包括一個或多個具有反應性側鏈的氨基酸殘基，其中該反應性側鏈可以用于興趣化合物的共價附著，例如可檢測的標記、藥物和/或診斷劑。合適的反應性氨基酸包括賴氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸。生物活性部分可以具有任何類型的有用的生物活性，包括細胞因子、趨化因子或前列腺素活性。它可具有蛋白質性質或非蛋白質性質。例如該部分選自藥物、細胞因子、趨化因子、激素、前列腺素及其類似物的組。具體實例包括PGE2、15d-PGJ2、IL-10、IFNy、截短的IFNy。蛋白質的部分通過基因融合可以方便地附著到I3DGF-R特異性靶向域，在N-端或C-端。在一個實施方式中，它偶聯到N-端。根據本發明的類似物或偶聯物通過本領域內已知的方法可以偶合到內核(core)和/或載劑或傳輸分子。合適的內核或載劑包括樹枝狀大分子、脂質體，以及天然的、合成的或半合成的聚合物(支鏈的或直鏈的)。樹枝狀大分子已經成功地證明它們自己在不同的藥物給藥途徑中為有用的添加劑，因為它們能夠賦予藥物更好的水溶性、生物藥效率以及生物適應性。參見 Chen 等，Journal of Pharmaceutical Sciences,第 97 卷,第 I 期,123-143頁。作為實例，本發明提供了偶聯到樹枝狀大分子或脂質體的IFN Y-類似物。該脂質體可以包括(抗癌)藥物。
在一個實施方式中，根據本發明的干擾素類似物或靶向I3DGFR的偶聯物通過傳統方法修飾以提高它的藥物性能，例如提高功效和/或穩定性。在一個實施方式中，為了通過附著至少一個無抗原性的聚合物，例如選自由聚乙二醇(PEG)及其衍生物組成的組的聚合物來提高半衰期，修飾上述干擾素類似物或靶向I3DGFR的結合物。PEG修飾常規地通過培養具有靶大分子的PEG的反應性衍生物實現。PEG共價附著到藥物或治療蛋白質能夠“屏蔽”來自宿主免疫系統(降低的免疫原性和抗原性)的試劑，增大試劑的流體動力學尺寸(在溶液中的尺寸)，該試劑通過降低腎清除率延長它的循環時間。本發明的又一方面涉及編碼根據本發明的蛋白質的干擾素類似物或編碼上文所述的蛋白質的靶向TOGFR的偶聯物的分離的核酸序列。技術人員將能夠設計和結構合適的核酸序列，例如融合結構，該融合結構利用標準的重組DNA技術編碼靶向部分和生物活性部分。上述分離的核酸序列可以是表達載體的一部分，例如設計為在細菌或哺乳動物的宿主細胞中產生重組蛋白質的載體。也提供了一種宿主細胞，包括根據本發明的核酸序列或載體，優選地，其中所述宿主細胞為細菌的或哺乳動物的宿主細胞。關于它在體內的分布，文中公開的類似物或靶向I3DGF的偶聯物具有改善的性能 。更具體地，它能實現將生物活性的興趣化合物導向興趣細胞，同時保持該特定化合物的生物活性。為了實現細胞特異性，這些介質(mediator)配備有地址標記，該地址標記將增大它們在患病組織內相關靶受體周圍的濃度。因此，又一實施方式涉及藥物組合物，包括IFN類似物或靶向TOGF的偶聯物以及藥學上可接受的載劑。具體方面涉及藥物組合物，包括靶向的IFNy類似物，優選包括靶向I3DGF的IFNy類似物，其中，靶向I3DGF的IFNy類似物與非靶向的IFNy相比表現出減少的副作用。示例性的藥物組合物包含肽，該肽包括序列CSRNLIDCK (GS) mGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVH QLLPESSLRKRKRSR 或由這些序列組成，其中 m 為 I 或 2，例如 CSRNLIDCK GSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKR KRSR0另一種示例性的藥物組合物包括偶聯物，該偶聯物包括偶聯到靶向域的生物活性分子，所述靶向域包括氨基酸序列CSRNLIDC-接頭-CSRNLIDCS，其中所述接頭為2 7個氨基酸殘基，優選3 5個氨基酸殘基的氨基酸序列。也提供了根據本發明的IFN(Y)類似物用于生產藥劑的應用，該藥劑用于治療性或預防性治療選自癌癥、病毒性疾病、纖維化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎癥性疾病的疾病。代表性的疾病包括腎小球硬化、間質纖維化、肺纖維化(特發性肺纖維化)、動脈粥樣硬化、風濕性關節炎、克羅恩斯病、潰瘍性結腸炎、腎小球腎炎以及敗血癥。已知IFN Y也具有抗病毒活性。因為截短形式的IFN Y表現為生物活性的，并且發現顯示出天然IFNy的所有的活性，假如使導歸器附著到分子，則本發明的類似物也被賦予抗病毒的活性。示例性的疾病包括由流感病毒或人呼吸道合胞病毒(RSV)導致的感染。RSV為導致呼吸道感染的病毒。它是在嬰兒和兒童時期較低的呼吸道感染和就診的主要原因。有時候，即使在單個RSV季內，嬰兒也可以多于一次地出現感染癥狀。在美國，60%的嬰兒在他們的第一個RSV季被感染，并且幾乎所有的兒童在2 3歲年齡時已感染該病毒。在這些感染RSV的兒童中，2% 3%的將會發展為細支氣管炎，迫使住院治療。嚴重的RSV感染已經越來越多地在稍老的患者中發現。沒有疫苗。治療限于支持治療，包括氧氣。在溫帶氣候，在冬天的幾個月當中存在年度流行病。在熱帶氣候，感染在雨季期間是最常見的。因此本發明也涉及一種方法，用于治療性或預防性治療選自癌癥、病毒性疾病、纖維化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎癥性疾病的疾病，例如腎小球硬化、間質纖維化、肺纖維化(特發性肺纖維化)、動脈粥樣硬化、風濕性關節炎、克羅恩斯病、潰瘍性結腸炎、腎小球腎炎以及敗血癥，該方法包括向需要的受試者給藥治療有效劑量的根據本發明的IFN類似物。該疾病可以是肝疾病，優選慢性肝疾病，例如肝硬化。本領域內技術人員將會根據給藥發生的受試者的施用方式、身高、體重、健康狀態等調整施用的劑量。給藥能夠以任何本身已為人所知的藥劑給藥方式發生。根據本發明的IFNy類似物有利地用于肺內傳輸形式的醫藥組合物(治療性或預防性)，例如鼻內給藥或吸入。也提供了包括一種吸入裝置，包括IFN Y類似物作為活性組分。
圖I :來自小鼠的模擬IFN Y的克隆。用PHA刺激脾細胞并且分離RNA。利用特異性引物進行RT和PCR生成期望大小的PCR產物。在BL21細胞中的結構的表達和Western印跡證實了模擬物的產生。圖2 :重組的模擬IFN Y在小鼠3T3成纖維細胞中表現出抗纖維化效應。細胞被 染色以顯示纖維化標記α-平滑肌肌動蛋白。圖3 :編碼雙環PDGF-受體靶向域的pET39b_BiPPB的構建。圖4 :編碼靶向PDGFR的IFN Y偶聯物的pET39b_BiPPB_IFN Y的構建。圖5 :pET39b-BiPPB_ 模擬 IFN Y 的構建。圖6 :示出pPB-肽與IFN Y偶合的IFN y -BiPPB以及模擬IFN y -BiPPB的斑點雜交分析。圖7 :人肝臟星狀細胞系LX2細胞的結合研究。細胞被染色以顯示TOGFR-結合肽。染色表明包含PPB的結構與靶細胞的結合。圖8 :血細胞計數分析以研究急性肝損傷小鼠模型中治療的副作用。WBC =白血細胞計數。LYM=淋巴細胞。PLT=血小板計數。RBC=紅血細胞計數。具體參見實施例4。圖9 :肝纖維化標記MMP13和 ΜΡ1的實時定量PCR分析。具體參見實施例4。圖10 :模擬IFN-PEG-BiPPB在急性CCl4誘導的肝損傷小鼠模型中的效果。a -SMA(A)、膠原蛋白-I⑶以及肌間線蛋白(C)的定量-從只接受IFN Y、模擬IFN Y、模擬IFNy-PEG、模擬IFN Y-PEG-BiPPB (5 μ g/小鼠)或PBS的橄欖油處理過的正常小鼠中以及CCl4處理過的小鼠中獲得的肝切片的染色。利用計算機化的細胞-D成像軟件完成定量。數據代表每組5只小鼠的平均值土SEM。相對于PBS治療的橄欖油組，#P < O. 05 ;相對于PBS治療的CCl4組，*P < O. 05，料P < O. 01。具體參見實施例6。圖11 :服用CCl4或橄欖油3天后，小鼠肝纖維化的標記的實時定量PCR分析。小鼠用所指出的不同的化合物治療，并且測量了膠原蛋白Ial (A)、a-SMA(B)、肌間線蛋白(C)以及TIMPl⑶的mRNA的水平。具體參見實施例6。圖12 :服用CCl4或橄欖油3天后，小鼠全血中的血細胞計數分析。小鼠用所指出的不同的化合物治療，并且使用庫特爾計數器測量了血小板計數(PLT :圖A)、白血細胞計數(WBC，圖B)、淋巴細胞計數(C)。具體參見實施例6。
具體實施方式
肝纖維化的特征在于導致肝臟瘢痕的細胞外基質組分的過度蓄積。到目前為止，對于肝纖維化的治療沒有可用的成功的治療方法。肝臟星狀細胞(HSC)和成纖維細胞是參與該疾病的進展的關鍵的效應細胞，其由重要的生長因子例如血小板衍生生長因子(TOGF)和轉化生長因子-β (TGFii)激活。干擾素Y (IFNy)在肝纖維化過程中已經表現出各種有益的體外以及體內效應。然而，IFNy顯示出嚴格的種屬特異性，并且具有短的循環半衰期，這限制了它潛在的臨床應用。而且，IFNy對免疫系統、內皮細胞以及中樞神經系統具有嚴重的不利作用(例如，導致抑郁)，這些都導致患者頻繁地從臨床試驗中退出，進而導致這些試驗的失敗。為了克服這些缺點，本發明人制備了一種穩定的IFNy的肽模擬物，其缺乏細胞外受體識別位點，并且包含直接與下游的IFNy信號傳導過程相互作用的信號傳導部分，因此保持了 IFNy的所希望的功能。為了提高IFN Y以及IFN Y模擬肽的特異性，IFNy以及IFN Y模擬肽稠合到 BiPPB(對抗 F1DGF-P-受體的雙環妝，Bicyclic Peptide against thePDGF-Beta-receptor)，因為TOGF受體表達在肝損傷特別是HSC過程中大幅上調。
實施例I :模擬IFNy的克隆將小鼠脾細胞從新鮮的脾中分離，并且在PHA (植物血球凝集素)存在下培養以刺激細胞因子的產生。刺激24小時后，分離出RNA，并且利用基因特異性反向引物合成cDNA，之后利用模擬IFNy特異性正向和反向引物由phusion DNA聚合酶進行PCR擴增。將得到的片段克隆在pET42a(原核表達載體)的PshAl/EcoRI位點處，并且通過限制性內切分析檢驗陽性克隆。參見圖I。截短的小鼠干擾素Y (NCBI 參照序列NM_008337. 2) (nt457_nt572)的 5' —3'核苷酸序列如下457gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctcatccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcgc tg 572a為了在序列的最后一個氨基酸半胱氨酸前插入終止密碼子，已加入最后一個核苷酸。從序列中除去半胱氨酸以提供合適的肽折疊，并且也為了避免由于融合肽(與BiPPB)中的二硫醚鍵導致的不適合的折疊。經編碼的氨基酸序列為AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRK RKRSR*。*表示終止密碼子IFN Y -BiPPB 以及模擬 IFN y -BiPPB 的克隆編碼雙環I3DGF靶向域BiPPB的核酸序列通過利用4個引物擴增兩個片段(每個片段兩個引物)生成，然后利用內嵌的Bam HI限制性位點連接，然后克隆在pET39b載體的Scal/Notl位點處。IFNy以及模擬IFNy利用肽融合引物(正向)以及IFNy或模擬IFN Y反向引物進行PCR擴增。擴增的片斷經消化、且連接在pET39b-BiPPB載體的NotI/XhoI位點處，并且通過限制性內切分析檢驗陽性克隆。參見圖4和圖5。所有結構的序列進一步通過自動化DNA測序證實。BiPPBBiPPB 的核苷酸序列tgt tct aga aac ctc ate gat tgt aag gga tcc gga ggttgt tea cgt aat cta ata gat tgt teaBiPPB 的氨基酸序列 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS (也參見圖 3)
干擾素Y (全長)核苷酸序列小鼠干擾素Y (NCBI參照序列NM_008337. 3)gcggccgca457gcca agtttgaggt caacaaccca48lcaggtccagc gccaagcattcaatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa54Itccagcctca ggaagcggaaaaggagtcg569ataa小鼠IFNy的氨基酸序列MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLF LDIffRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFS NSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC融合蛋白質(BiPPB-IFNy)的核苷酸序列 tgt tct aga aac ctc ate gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tea cgt aat ctaata gat tgt tea gcggccgca 干擾素 Y 序列(ΝΜ_008337· 3)。BiPPB-IFN Y的氨基酸序列CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAMNATHCILALQLFLMAVSGCYCH GTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLR LFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQ AFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC斜體表示BiPPB ;普通的文本表示IFNy模擬物；粗體表示接頭或間隔區。也參見圖4。融合到BiPPB的模擬干擾素Y融合蛋白質(BiPPB-IFNY模擬物)的核苷酸序列tgt tct aga aac ctc ate gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tea cgtaat cta ata gat tgt tea gcggccgca457gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagcgccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaaaaggagtcg569ataaBiPPB-IFN y模擬物的氨基酸序列CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVH QLLPESSLRKRKRSR斜體表示BiPPB ;普通的文本表示IFNy模擬物；粗體表示接頭或間隔區。也參見圖5。然后將該核酸轉化進BL21細胞(大腸桿菌)以利用IPTG誘導進行表達。表達的蛋白質利用抗-IFN Y抗體和/或抗-PPB抗體通過SDS-PAGE以及Western印跡分析或斑點雜交分析進行分析(參見圖6)。表達的蛋白質(具有His標簽)然后在天然條件下通過Ni-NTA柱色譜純化。標簽被蛋白質水解切割并且利用瓊脂糖柱色譜進一步純化。實施例2 :切割的活性模擬IFN Y的抗-纖維化效果我們評估了切割的IFN Y模擬肽在小鼠NIH3T3成纖維細胞中的抗纖維化效果，如通過免疫細胞化學(a-SMA染色)來評定。簡單地說，以6Χ104個細胞/孔的密度將3Τ3成纖維細胞接種在24孔培養板中，24個小時后，細胞在包含O. 5%的FBS的培養基中饑餓培養過夜。此后，細胞在具有不同化合物(PDGF 50ng/ml、TGF β 10ng/ml、模擬IFN Y I μ g/ml、50ng/ml PDGF+1 μ g/ml 模擬 IFN y 以及 10ng/ml TGF β+1 μ g/ml 模擬 IFN y )的饑餓培養基中培養。培養48個小時之后，清洗細胞，用乙醇丙酮(I : I)固定并且對a-SMA (活化的成纖維細胞的標記)進行染色。實施例3 =BiPPB和模擬IFN Y-BiPPB在人LX2細胞中的結合研究我們測定了 BiPPB和模擬IFN Y-BiPPB在LX2細胞(人HSC)中的結合。簡單的說，以3 X IO4個細胞/孔的細胞密度將LX2細胞鋪在48孔培養板中。24小時后，細胞在培養基(-FBS)中饑餓培養過 夜。然后細胞用不同的化合物在室溫下培養兩小時以結合。結合之后，用PBS完全地清洗細胞，用乙醇丙酮(I I)固定，并且對PPB進行染色。結果顯不在圖7中。實施例4 :在小鼠的急性CCl4誘導的肝損傷中的體內效果研究檢測了重組IFNy、模擬IFNy、重組融合蛋白質IFNy-BiPPB以及重組融合蛋白質模擬IFN Y-BiPPB在急性CCl4S導的肝損傷小鼠模型中的抗-纖維化效果。在第一天，給動物們提供一腹腔內劑量(lml/kg)的橄欖油中的四氯化碳(CCl4)或橄欖油(對照η = 6)。注射CC1424個小時后，在第二天和第三天，動物們用PBS(n = 6)、50000U/小鼠的IFNy (η=6)、50000U/小鼠的模擬 IFNy (η = 5)、50000U/小鼠的 IFNy-BiPPB (η = 6)、50000U/小鼠的模擬IFN Y-BiPPB (η = 6)進行處理。此后，在第四天，動物們被處死，并且進行血細胞計數和利用定量PCR評估抗-纖維化效果(參見Hemmann S, Graf J, Roderfeld M, Roeb.J H印atol. 2007，五月，46 (5) :955-75)。結果顯示在圖8和圖9中。圖8中顯示的數據說明在減弱與CCl4S導的肝纖維化(P <0.01)相關的全血中的白血細胞計數(WBC)以及淋巴細胞計數(Iym)的上調方面，模擬-BiPPB比未改變的IFNy更有效。相反，當動物們接受模擬IFN Y-BiPPB而不是IFNy (P < 0.0025)時，與IFNy處理相關的血小板計數的減少較不嚴重(這是INF Y的公知的不利作用)。圖9中顯示的數據表明模擬-IFN Y -BiPPB被賦予抗纖維化活性它減弱CCl4誘導的基質金屬蛋白酶類(MMP13)的上調。MMP13與金屬蛋白酶組織抑制因子(TIPMl)的比值與用天然IFNy獲得的比值相近，但是比模擬IFNy (P < O. 03)更好，表明BiPPB向模擬IFN Y的偶合是有益的。總體上，圖8和圖9中的數據表明模擬IFN y -BiPPB與天然IFN Y相比較效果更強，并且具有較少的副作用。實施例5 :模擬干擾素Y偶聯物的化學合成樽擬IFN Y -PEG-BiPPB 偶聯物0. 111 μ mol 雙環 PDGFR 識別肽(BiPPB，2223. 2Da，Genosphere生物科技)與O. 337 μ mol的馬來酰亞胺-PEG-琥拍酰亞胺基羧基甲酯(Mal-PEG-SCM, 2KDa, Creative PEGworks)偶合 3 個小時。此后，將賴氨酸(0·337μπιο1)加到Mal-PEG-SCM的不含嵌段的基團(block free group)中。反應一個小時后,合成的產物BiPPB-PEG-MAL (0. 112 μ mol)與 0. 56 μ mol 的模擬 IFN y -ATA (4689Da, Genosphere 生物科技)在去乙酰基試劑存在下于室溫下反應過夜。最后，合成的模擬IFN Y-PEG-BiPPB偶聯物利用7KDa的slide-a-lyzer G2透析盒(賽默科技)用PBS進行完全透析。樽擬IFN Y -PEG 偶聯物0. 107 μ mol 的模擬 IFN y -ATA (4689Da)與 0. 321 μ mol 的聚(乙二醇)-琥拍酰亞胺基-α - 丁酸甲酯(mPEG-SMB, 2KDa, Nektar therapeutics)反應兩小時，并且接下來對產物進行完全透析。a)模擬 IFN Y -PEG-BiPPB
權利要求
1.一種干擾素Y (IFNy)的類似物，其中，介導結合到所述干擾素Y的天然受體的部分至少被功能性破壞，并且其中所述類似物包括能夠介導細胞內IFNy活性的信號傳導部分，所述信號傳導部分可選地通過接頭被設置在所述干擾素Y的N-端，具有能夠結合到不同于所述IFNy受體的細胞表面受體的至少一個靶向域。
2.根據權利要求I所述的類似物，其中，介導細胞內活性的所述信號傳導部分包括多元核定位信號(NLS)基序。
3.根據權利要求2所述的類似物，其中，所述多元NLS基序包括氨基酸序列(R)KRXRS (R)，其中，X為任何氨基酸殘基；優選(R) KRXRS (R)，其中X為R、K、S或T。
4.根據前述任一項權利要求所述的類似物，其中，所述信號傳導部分包括選自由以下氨基酸序列組成的組中的序列(a)氨基酸序列KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR ；(b)氨基酸序列YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ ；(c)氨基酸序列AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC ； (d)(a)、(b)或(c)的所述序列的至少10個、優選至少15個鄰接氨基酸的延伸物； (e)表現出與(a)或(b)或(C)至少70%、優選至少80%、更優選至少90%的同一'生的氨基酸序列，前提是細胞內信號傳導活性得以保持；以及 (f)(a)或(b)或(C)的氨基酸序列，其中至多10個、優選至多8個、更優選至多5個氨基酸殘基被缺失、添加或取代，前提是所述信號傳導活性例如核易位得以保持。
(g)共有序列VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS,其中x為任何氨基酸殘基； (h)共有序列VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS,其中x為任何氨基酸殘基；以及(i)共有序列Vxxx [Q/N] [F/V/I]Q[R/H] [Q/K]A[F/V/I] [N/H]ELI [R/Q]Vx[H/A] [Q/E]L[L/S]P[E/A] [S/A] [S/A] [L/K]xxKRKRS，其中 x 為任何氨基酸殘基。
5.根據權利要求4所述的類似物，包括根據序列Xaa1 Xaa2Xaa3Xaa4VaI Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9GIn Xaa10Xaa11Ala Xaa12Xaa13Glu Leu He Xaa14Val Xaa15Xaa16Xaa17Leu Xaa18Pro Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24Xaa25 的信號傳導部分,其中Xaa1 > Xaa2 > Xaa3Xaa4Xaa6Xaa11、Xaa13、Xaa14 > Xaa16Xaa1' Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24以及Xaa25為任何氨基酸殘基； Xaa5為極性的、不帶電荷的殘基，例如Asn或Thr ； Xaa7為非極性的、疏水性的殘基，例如Pro或Leu ； Xaa8為極性的、不帶電荷的殘基，例如Gln或Asn ； Xaa9為非極性的、疏水性的殘基，例如Val、Ile或Leu ； Xaa10為極性的、堿性殘基,例如Arg、His或Lys ； Xaa12為非極性的、疏水性的殘基，例如Phe、Val或Ile ； Xaa15為非極性的、疏水性的殘基，例如Val、lie、Met。
6.根據前述任一項權利要求所述的類似物，其中，所述靶向域能夠結合到成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞，優選成肌纖維細胞、肝門成纖維細胞、系膜細胞、間質成纖維細胞、肺泡成纖維細胞和/或基質細胞特異的受體。
7.根據前述任一項權利要求所述的類似物，其中，所述靶向域能夠結合到低聚糖或糖蛋白的受體，優選甘露糖-6-磷酸鹽/胰島素樣生長因子-II受體(M6P/IGF2R)、脫唾液酸糖蛋白(ASGP)受體或甘露糖受體(CD 206)。
8.根據權利要求7所述的類似物，其中，所述靶向域為偶聯到載劑分子的低聚糖，優選甘露糖(-6-磷酸鹽)或乳糖。
9.根據權利要求I 6中任一項所述的類似物，其中，所述受體選自由I3DGF受體、膠原蛋白VI型受體以及細胞因子受體組成的組,所述細胞因子受體包括TGFP受體、TNFa受體、胰島素生長因子受體、VEGF受體、趨化因子受體以及ILlP受體。
10.根據權利要求9所述的類似物，其中，所述受體為所述TOGF受體，優選為TOGFii受體。
11.根據前述任一項權利要求所述的類似物，其中，所述靶向域包括至少一個環肽部分。
12.根據任何權利要求11所述的類似物，其中，所述靶向域包括環肽部分的至少一個串聯重復部分，優選相同的環肽部分。
13.根據權利要求11所述的類似物，其中，串聯重復部分中的兩個環肽部分通過2 7個氨基酸接頭連接。
14.根據權利要求13所述的類似物，其中，所述接頭選自由⑴序列K(GS)mGG以及( )通式[GnDJ的序列組成的組，其中，K (GS)mGG中m為I或2 ;通式[GnDj中n+m為4至7，其中η彡4，并且M為O和3之間的整數。
15.根據前述任一項權利要求所述的類似物，其中，所述靶向域包括至少一個氨基酸序列 RGD、KPT、SRN、NLI 和 / 或 LID。
16.根據權利要求15所述的類似物，其中，所述靶向域包括氨基酸序列CSRNLIDC-接頭-CSRNLIDCS，其中，所述接頭為3 7個、優選為4 5個氨基酸殘基的氨基酸序列。
17.—種包括偶聯到靶向域的興趣化合物的偶聯物，所述靶向域包括氨基酸序列X1SRNLIdX2-接頭-X3SRNLIdX4，其中，X1和X2對以及X3和X4對能夠形成鍵，優選形成肽鍵，從而形成雙環結構，其中所述序列SRNLID為環的每部分，并且其中所述接頭為2 7個、優選為3 5個氨基酸殘基的氨基酸序列。
18.根據前述任一項權利要求所述的類似物或偶聯物，設置有至少一個無抗原性的聚合物，優選選自由聚乙二醇及其衍生物組成的組。
19.一種分離的核酸序列，所述分離的核酸序列編碼根據前述任一項權利要求所述的蛋白質的類似物或偶聯物。
20.一種表達載體，包括根據權利要求19所述的分離的核酸序列。
21.一種宿主細胞，包括根據權利要求18所述的核酸序列或根據權利要求20所述的載體，優選地，其中所述宿主細胞為細菌或哺乳動物宿主細胞。
22.—種藥物組合物，包括根據權利要求I 18中任一項所述的類似物或偶聯物，以及藥學上可接受的載劑、佐劑和/或賦性劑。
23.根據權利要求I 18中任一項所述的類似物或偶聯物用于生產藥劑的應用，所述藥劑用于治療性或預防性治療選自癌癥、病毒性疾病、纖維化疾病、硬化疾病、以及慢性或急性炎癥性疾病的疾病。
24.根據權利要求I 18中任一項所述的類似物或偶聯物，用于治療性或預防性治療選自癌癥、病毒性疾病、纖維化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎癥性疾病的疾病。
25.根據權利要求24所述的類似物或偶聯物，用于治療肝疾病，優選慢性肝疾病，例如肝硬化。
26.根據權利要求24所述的類似物或偶聯物，用于治療病毒性疾病，優選由流感病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)導致的疾病。
27.一種用于治療性或預防性治療選自癌癥、病毒性疾病、纖維化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎癥性疾病的疾病的方法，所述方法包括向需要的受試者給藥有效劑量的根據權利要求I 18中任一項所述的類似物或偶聯物。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述疾病選自由腎小球硬化、間質纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、風濕性關節炎、克羅恩斯疾病、潰瘍性結腸炎、腎小球腎炎以及敗血癥組成的組，優選地，其中所述疾病為肝疾病，更優選為慢性肝疾病，例如肝硬化。
29.根據權利要求27或28所述的方法，其中，所述給藥包括粘膜給藥，優選肺內給藥。
全文摘要
本發明涉及醫藥領域。本發明尤其涉及干擾素(IFN)的生物活性類似物及其醫療用途，所述類似物表現出較少的不期望的副作用。提供了一種IFN類似物，其中，介導結合到它的天然受體的部分至少被功能性破壞，并且其中所述類似物包括能夠介導細胞內IFN活性的信號傳導部分，所述信號傳導部分可選地通過接頭被提供在所述類似物的N-端，具有能結合到不同于IFN受體的細胞表面受體的至少一個靶向域。
文檔編號A61P31/12GK102917726SQ201080062942
公開日2013年2月6日 申請日期2010年12月30日 優先權日2009年12月31日
發明者克拉斯·普爾斯特拉, J·普拉卡什, E·貝爾雅斯, R·班賽爾 申請人:畢歐麗安技術有限公司