專利名稱：與糖尿病中的mirna相關的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病中的微小RNA分子和微小RNA表達譜，包括糖尿病慢性病。
背景技術：
在本發明全文中，在方括號內引用了多篇參考文獻以便更加完整的描述與本發明相關的背景技術。糖尿病視網膜病變幾乎所有的I型糖尿病患者和60%的II型糖尿病患者都會發展成視網膜病變。到2030年，預計全球糖尿病患者將會達到3. 66億。在加拿大，糖尿病患者數超過200萬人，其中，約10%為I型糖尿病，約90%為II型糖尿病。在北美洲，糖尿病視網膜病變(DR)是導致失明的最重要的系統性原因。已有研究證實糖尿病視網膜病變中有幾種蛋白質分子發生改變。針對治療糖尿病視網膜病變的個別蛋白質的實驗研究已開展了很長時間，但迄今為止所有的努力都沒有在臨床上取得成功。在所有的糖尿病慢性并發癥中，包括糖尿病視網膜病變，血管內皮損傷是一個重要特征。內皮細胞排列在血管壁上，它對葡萄糖的攝取不依賴于胰島素。當糖尿病患者體內血糖水平升高時,葡萄糖流入到內皮細胞中，導致內皮細胞損傷。視網膜病變分為兩種類型，或者說兩個階段非增生性視網膜病變和增生性視網膜病變。在非增生性糖尿病視網膜病變階段，眼睛中有些地方(微血管瘤)血管擴張。也可能出現血管堵塞。可能有少量出血(視網膜出血)，和液體滲漏到視網膜內。增生性視網膜病變階段是更晚期和更嚴重的疾病狀態。眼睛內開始生長出新的血管(血管生成)。這些新的血管非常脆弱并可能流血(出血)。隨后視網膜和眼睛的其他部分(玻璃體)出現小塊疤痕。最終的結果是視力喪失，以及其他問題。微小RNA微小RNA( “miRNA”)是近年來發現的自然界中存在的分子。miRNA是小的RNA分 子(約由20-25個核苷酸組成)，其在調節基因表達中起到重要作用I。miRNA通過RNA聚合酶II轉錄，形成帶有5’帽子結構和多聚腺苷酸尾巴結構的初級miRNA。初級miRNA在細胞核中加工成前體miRNA(由70-100個核苷酸組成的發夾結構)，是通過三種酶RNA酶II，Drosha和DGCR8調節的。前體miRNA形成后就通過核輸出蛋白-5輸出到細胞質中。在細胞質中，RNA酶III核糖核酸酶家族成員Dicer將前體miRNA進一步加工成成熟miRNA，即功能活性形式1，2。成熟的miRNA與RNA誘導的沉默復合物(RISC) —起結合到特定的mRNA靶上，引起特定的mRNA降解或者轉錄遏制1，2。一些研究者采用超表達實驗證明了miRNA在多種細胞過程中的重要性。也有研究認為miRNAs在控制組蛋白修飾方面也起到重要作用3。大量的miRNA編碼區位于蛋白編碼基因的內含子區，并被認為與它們的宿主基因被共同調控。不過，它們也有可能是被自己的啟動子調控的。已從惡性腫瘤中識別出幾種miRNAs。研究表明它們可以調控多種因子，包括致癌基因(c-MYC)，轉錄因子(NFkB)和甲基化因子1，2。有關miRNA在多種疾病中的潛在治療應用在科學界引起了相當大的興趣。從機理的角度看，一種miRNA可以調控多種基因，因此，靶向于一種或少數幾種miRNAs提供了阻止多種基因表達的潛在的獨特機會。由于靶miRNAs作用的特異性，這種以RNA為基礎的療法是非常有吸引力的。miRNA表達的脫調節可能引起疾病，因此，檢查miRNA的表達可能成為一種有用的診斷手段。糖尿病中的miRNA
沒有研究文獻表明糖尿病個體視網膜中的特定miRNAs發生了顯著改變。然而，對其他糖尿病并發癥的研究表明miRNA已發生改變。比如，已有研究發現，在糖尿病中miR375的改變參與葡萄糖誘導的胰島素基因表達過程4。研究發現，在2型糖尿病大鼠心臟微血管內皮細胞內miR320表達上調5。研究表明，MiR377通過調節P21-活化激酶和超氧化物歧化酶使得糖尿病腎病中纖維連接蛋白生成增加6。研究已發現，在糖尿病腎病中mil92通過影響TGFii誘導的膠原蛋白表達而發生改變7。在糖尿病兔子心臟中發現miR133減少，從而調節HERG鉀離子通道引起QT波延長8。此外，miRl參與葡萄糖誘導的心肌細胞凋亡過程。申請人最近的研究發現，在糖尿病大鼠的心臟和暴露于葡萄糖的心肌細胞中都出現了 miR133a的下調，這直接關系到心肌細胞肥大9。在非糖尿病性心肌肥厚的其他研究中，也發現了 miRl和miR133的下調10，11。國際申請WO 2009/045356 (W0 ‘356)中公開了通過施用miRNAs來改變血管內皮生長因子(VEGF)誘導細胞和組織響應或改變的能力來治療疾病的方法。W0‘356還公開了治療傷口痊愈和癌癥、炎癥和黃斑變性等疾病的方法。但是，WO ‘356中并沒有公開暴露于葡萄糖的細胞中或者糖尿病受試者視網膜中哪些miRNAs發生了改變。本領域需要一種有效的治療方法來治療葡萄糖介導的細胞損傷相關的疾病，包括糖尿病慢性并發癥，比如糖尿病視網膜病變。本領域也需要一種健全的早期檢測糖尿病的方法。發明概述在一方面，本發明提供一種治療受試者的葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種能夠調節所需受試者的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分或成分的混合物。在另一方面，本發明提供一種治療葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的組合物，包括一種能夠調節所需一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分或成分的混合物，和藥學上可接受的載體。在本發明中，所述成分或成分的混合物能夠上調所需受試者的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達。在一方面,所述一種或多種miRNAs中的至少一種 miRNA 選自 miR-1，miR-146a, miR200b 或者 miR-320。在本發明中，所述成分或成分的混合物包括一種寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。在本發明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或類似物、miRNA前體、成熟miRNA或者編碼所述至少一種miRNA的DNA分子的形式提供。在本發明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一種包括藥學上可接受的載體的組合物的形式提供。在本發明中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物選自SEQ ID NOs. 1_4。在本發明中，所述成分或成分的混合物以不超過一種給藥載體的方式提供。在本發明中，所述給藥載體選自病毒載體，微球，脂質體，膠體金顆粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化病毒載體。在本發明中，所述成分或成分的混合物能夠下調所需的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達。在一方面,所述一種或多種miRNAs中的至少一種 miRNA 選自 miR-144 或者 miR-450。 在本發明中，所述成分或成分的混合物包括所述的至少一種miRNA的抑制劑或抑制劑的混合物。在本發明中,所述抑制劑或抑制劑的混合物選自antagomir、反義RNA或者短干擾RNA。在本發明中，所述抑制劑或抑制劑的混合物以一種包括藥學上可接受的載體的組合物的形式提供。在本發明中，所述疾病是糖尿病慢性并發癥，包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病大血管病變。在本發明中，所述成分或成分的混合物通過胃腸外給藥途徑或者局部給藥途徑施用。在本發明中，所述疾病是糖尿病視網膜病變，所述成分或成分的混合物通過眼內給藥或者局部滴注到眼內的方式施用。在本發明中，所述疾病是糖尿病視網膜病變，所述成分或成分的混合物通過眼部植入的方式施用。在另一方面，本發明提供一種治療受試者的糖尿病視網膜病變的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種組合物，包括至少一種(a)祀向于miR-1, miR-146a,miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR_144或者miR-450的抑制劑。在另一方面，本發明提供一種診斷受試者所患疾病的方法，所述疾病與葡萄糖介導的細胞損傷相關，其特征在于，所述方法包括檢測受試者樣本中的一種或多種miRNAs的表達譜，其中受試者樣本的miRNA表達譜與正常樣本或參考樣本的miRNA表達譜的差異就是葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的指征。在本發明的診斷疾病的方法的一方面，所述疾病是糖尿病慢性并發癥，包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病大血管病變。在本發明的診斷疾病的方法的一方面，所述方法是診斷受試者糖尿病視網膜病變的方法。在本發明的診斷疾病的方法的一方面，所述一種或多種miRNAs選自miRl，miR146a, miR200b, miR320, miR144 或者 miR450。在本發明的診斷疾病的方法的一方面，與正常樣本或者參考樣本相比miRl，miR146a, miR200b和miR320的下調和miR144或者miR450的上調就是該疾病的指征。本發明具有如下優勢(a)miRNAs是天然成分，當作為藥物使用時是非常特異性的，
(b) miRNAs的合成非常容易，(C)HiiRNAs可以通過眼內注射到玻璃體內。玻璃體內給藥是公認的治療視網膜疾病的方法，和(d) miRNAs可用于診斷糖尿病和糖尿病并發癥，包括糖尿病視網膜病變。提供了一種早期診斷這類疾病的新方法。附圖簡述參考下列的詳細描述本發明將會被更好的理解，發明目的將變得清晰。描述參考附圖，其中圖I是miRNA陣列-散點圖，顯示出對照組與鏈脲佐菌素(STZ)誘導的(一種I型糖尿病模型)糖尿病組(處理組)大鼠視網膜中miRNA的改變情況。
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圖2a)是暴露于低濃度葡萄糖(LG)和高濃度葡萄糖(HG)的內皮細胞中的miR320表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖。圖b)_d)顯示內皮細胞中的下列因子表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖(b)纖維連接蛋白(FN)mRNA, (c)內皮素-l(ET-l)mRNA和(d)血管內皮生長因子(VEGF)mRNA，所述內皮細胞分別暴露于高濃度葡萄糖(HG)，低濃度葡萄糖(LG)，暴露于高濃度葡萄糖并經陰性mRNA轉染(HG+neg)，暴露于高濃度葡萄糖并經miR320模擬物轉染(HG+miR320)。圖e)顯示了內皮細胞中的有絲分裂原激活的蛋白激酶-細胞外信號調節激酶(MAPK(ERKl/2))的激活作用，所述內皮細胞分別暴露于低濃度葡萄糖(LG)，高濃度葡萄糖(HG)，經陰性轉染并暴露于低濃度葡萄糖或高濃度葡萄糖(LG+Neg，HG+Neg)，經miR320模擬物轉染并暴露于低濃度葡萄糖或高濃度葡萄糖(LG+miR320，HG+miR320)。*代表與低濃度葡萄糖組(LG)相比具有統計學意義上的顯著差異。圖3a)是分別暴露于25mmol/L葡萄糖和5mmol/L葡萄糖的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)中，和暴露于25mmol/L葡萄糖并經陰性miRNA轉染(25mM+Scram)或者經miR146a模擬物轉染(25mM+miR146a)的內皮細胞中的miRNA 146a表達水平的實時定量聚合酶鏈式反(qRT-PCR)應分析圖。圖b)_c)是人臍靜脈血管內皮細胞中的下列因子表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖和酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)分析圖，
b)纖維連接蛋白(FN)mRNA和c)纖維連接蛋白水平，所述人臍靜脈血管內皮細胞分別暴露于5mmol/L葡萄糖和25mmol/L葡萄糖，以及暴露于25mmol/L葡萄糖并經陰性(序列打亂的)miRNA 轉染(25mM+Scram)或者經 miR146a 模擬物轉染(25mM+miR146a)。Scram 表不序列打亂的，*表示與5mM組或者5mM scram組相比具有統計學意義上的顯著差異；**表示與25mM組或25mM scram組相比具有顯著差異；miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表達，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG組)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并歸一化到LG組的水平。圖4a)顯示了鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠(D)視網膜組織中miR146a的水平與年齡和性別匹配的對照組(C)中miR146a的水平對比情況。圖b)顯示了玻璃體內給藥的效率，其中，向玻璃體內注射miR146a模擬物(D+146a)導致視網膜內miR146a水平升高，而注射序列打亂的模擬物(D+SC)組并沒有出現miR146a水平升高的現象。圖c)_d)顯示鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠視網膜組織中的纖維連接蛋白(FN) (c)mRNA水平和(d)蛋白質水平。該圖顯示向玻璃體內注射miR146a模擬物(D+miR146a)可以阻止糖尿病誘導的纖維連接蛋白(FN)mRNA水平和蛋白質水平的上調，而注射序列打亂的模擬物的對照組(D+Sc)并沒有發現這一現象。數據以I，c) RNU6 (U6), d) 18S的比值的形式表示，*表示與對相應的C組相比具有統計學意義上的顯著差異，η為5例/每組。圖5a)是基于生物信息學預測的(www. TargetScan. org, www. microrna. org, www.ebi.ac.ukl)纖維連接蛋白(FNl) 3’UTR序列與成熟miR146a序列的對比圖。圖b)_c)顯不miR146a與(b)人和(c)大鼠FNl啟動子結合的突光素酶報告分析圖。**表不與單獨的載體組或者載體+序列打亂物組相比具有統計學意義上的顯著差異。圖6a)是對照大鼠視網膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR146a的定位。圖(b)是(a)組的高倍顯微鏡照片，顯示了視網膜毛細血管的陽性染色(箭頭)。圖c)是鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠視網膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了miR146a在毛細血管內(箭頭)的最小表達量(如果有的話)。用堿性磷酸酶(ALK Pho)作為色原體，不加復染劑。
圖7顯示了人臍靜脈內皮細胞中的核因子-KB(NF-KB)的活力。X軸顯示了下列條件人臍靜脈內皮細胞暴露于5mmol/L葡萄糖,25mmol/L葡萄糖,和暴露于25mmol/L葡萄糖并經陰性miRNA轉染(25mM+Scram)或者經miR146a模擬物轉染(25mM+miR146a)。*表示與其他組相比具有統計學意義上的顯著差異。數據歸一化到5mM葡萄糖組的水平。圖8顯示了 db/db糖尿病小鼠(db/db)( 一種2型糖尿病的模型)視網膜組織中的miR146a水平與年齡和性別匹配的對照組(C)的miR146a水平的對比圖。數據以RNU6(U6)比值的形式表達，*表示與其他組相比具有統計學意義上的顯著差異。圖9顯示了糖尿病大鼠視網膜內的微小RNA和血管內皮生長因子的變化情況。非糖尿病對照組和糖尿病組(鏈脲佐菌素誘導，患病I個月后)大鼠視網膜組織樣本的圖a)實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖和圖b)酶聯免疫法分析圖都顯示糖尿病大鼠視網膜中血管內皮生長因子mRNA和蛋白質水平都升高。圖c)是糖尿病大鼠與非糖尿病對照組大鼠視網膜中miR200b水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖。miRNA的數據以RNU6B(U6)的比值的形式表示，并歸一化到對照組的水平；(mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并歸一化到對照組的水平。*表示與其他組相比具有統計學意義上的顯著差異。)
圖10顯示了葡萄糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞中miR200b水平下調的影響。圖a)顯分別暴露于25mmol/L葡萄糖(HG), 5mmol/L葡萄糖(LG),和25mM L-葡萄糖(滲透對照，0SM)的人臍靜脈血管內皮細胞中的miR200b的表達水平。圖b)顯示了人臍靜脈血管內皮細胞中血管內皮生長因子mRNA的表達水平，所述的人臍靜脈血管內皮細胞分別暴露于低濃度葡萄糖(LG)、高濃度葡萄糖(HG)、25mM L-葡萄糖(OSM)、經序列打亂的(scr)模擬物或者miR200b轉染并暴露于低濃度葡萄糖(LG+Scr ；LG+200b)或高濃度葡萄糖(HG+Scr ;HG+200b),和經 antagomirs 轉染[200b (A)]以及經 antagomirs 轉染并暴露于低濃度葡萄糖[LG+200b (A)]。圖c)中與經序列打亂的(scr)模擬物組相比，經miR200b模擬物轉染后暴露于高濃度葡萄糖的人臍靜脈血管內皮細胞中miR200b表達水平的增加顯示了 miR200b模擬物轉染的效率。圖d)顯示與人臍靜脈血管內皮細胞類似，牛視網膜血管內皮細胞(BREC)中也顯示出葡萄糖誘導的miR200b水平下調。圖e)顯示，用miR200b模擬物(采用在PcDNA3. I載體中克隆的miR200b(V200b)，而不是通過空白載體(V))轉染牛視網膜血管內皮細胞能夠使得高濃度葡萄糖誘導的VEGF mRNA表達的上調恢復正常。圖f)中與載體對照組相比，經miR-200b模擬物轉染的牛視網膜血管內皮細胞中miR-200b表達水平的提高程度顯示了 miR-200b模擬物在牛視網膜血管內皮細胞中的轉染效率。(低濃度葡萄糖(LG) = 5mM葡萄糖,Scr =序列打亂的miRNA, 200b = miR200b模擬物,200b (A)=200b antagomir, OSM = 25mML葡萄糖[滲透對照]。*表示與LG組或LG scram組相比具有顯著差異，+表示與HG組或者HG scram組相比有顯著差異。miRNA的水平以RNU6B (U6)的比值的形式表達，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平。mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表示，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平。圖11顯示由高濃度葡萄糖(HG)誘導的和血管內皮生長因子(VEGF)介導的跨內皮通透性增加可以通過miR200b模擬物轉染(200b)而被阻止，但不能通過序列打亂的(scr)模擬物轉染而被阻止，圖a)為時間依賴性數據，圖b)為終點數據。圖c)顯示，類似地，葡萄糖誘導的內皮細胞(EC)管腔形成可以通過miR200b模擬物轉染而被阻止，但不能通過序列打亂的(scr)模擬物轉染而被阻止。圖d)顯示了管形成實驗的量化分析。 (低濃度葡萄糖(LG)= 5mM葡萄糖,Scr =序列打亂的miRNA, 200b = miR200b模擬物，200b (A) = 200b antagomir, OSM = 25mM L葡萄糖(滲透對照).*表示與LG組或者LGscram組相比具有顯著差異，+表示與HG組或者HG scram組相比具有顯著差異。miRNA的水平以RNU6B(U6)的比值的形式表達，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平；mRNA的水平以18S RNA的比值的形式表達，并歸一化到低濃度葡萄糖組(LG)的水平)。圖12a)顯不基于生物信息學預測的(www.TargetScan.org, www.microma.org，www.ebi.ac.ukl)血管內皮生長因子3’ UTR序列(和突變的[mut]血管內皮生長因子3，-_與成熟miR200b序列的對比圖。圖b)(人)和圖c)(大鼠)是miR200b與血管內皮生長因子啟動子結合的熒光素酶報告分析圖，顯示了 miR200b與血管內皮生長因子3’ UTR的劑量依賴性的結合。相關啟動子的活性以發光單位歸一化為β_半乳糖苷酶表達水平的方式表達，*表示與單獨載體組或者載體+序列打亂物組相比具有統計學意義上的顯著差
巳圖13顯示了 miR200b調節的視網膜血管內皮生長因子的改變及其被miR200b阻止。圖a)和圖b)分別是經過或者未經過玻璃體內注射miR200b模擬物(200b)和序列打亂的模擬物(Scr)的對照組(Cont)和糖尿病組(Diab)大鼠(鏈脲佐菌素誘導)視網膜中的a)血管內皮生長因子mRNA和b)蛋白水平的情況。圖c)中與注射序列打亂的模擬物組相比，玻璃體內注射miR200b模擬物后視網膜中miR200b表達量的增加顯示了玻璃體內給藥的效率。*表示與對照組或者Diabetic+scr組(右圖)相比具有統計學意義上的顯著差異，+表示與糖尿病組(diabetic)比較有顯著差異。圖14的顯微照片顯示了 miR200b介導的糖尿病視網膜血管內皮生長因子改變的功能性結果。a)是對照大鼠視網膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR200b在視網膜毛細管內皮(箭頭)，神經節細胞(楔形箭頭)，內核層細胞(雙楔形箭頭，在神經膠質和神經元內)中的定位；插圖為帶有細胞質和細胞核miR200b定位的毛細管放大圖(箭頭)。圖b)是鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠視網膜內的視網膜組織(與(a)組中的定位相似)的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR200b的最小表達量(如果有的話)。圖c)是用抗白蛋白抗體對對照組大鼠視網膜進行免疫細胞化學染色的顯微照片，顯示有血管內白蛋白出現(箭頭)。圖d)是對糖尿病大鼠(鏈脲佐菌素誘導)的視網膜進行與(C)組類似的免疫細胞化學染色的顯微照片，顯示出現血管內反應(箭頭)和視網膜的彌漫著色，說明血管通透性增加。圖e)的顯微照片顯示鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠視網膜經玻璃體內注射miR200b之后，白蛋白染色僅出現在血管內的間隔中(箭頭)。在LNAtm-ISH實驗中，用堿性磷酸酶(ALK Pho)作為色原體，不加復染劑。在白蛋白染色中使用DAB色原體和蘇木精復染劑。圖15顯示mir200b調節糖尿病誘導的p300的變化。圖a)顯示在以下情況下人臍靜脈內皮細胞中的p300mRNA水平上調人臍靜脈內皮細胞分別暴露于5mmol/L葡萄糖(LG), 25mmol/L葡萄糖(HG),暴露于25mmol/L葡萄糖并經陰性miRNA轉染(HG+Scram)或者經miR200b模擬物轉染(HG+200b)。圖b)顯示了 miR200b在人臍靜脈內皮細胞內的表達情況。未觀察到p300siRNA轉染對miR200b表達量的影響。圖c)顯示糖尿病大鼠視網膜中P300mRNA的表達情況(與對照組比較)。*表示與對照組或者低濃度葡萄糖組(LG)相比具有統計學意義上的顯著差異。+表示與糖尿病組(diabetic)或高濃度葡萄糖組(HG)相比具有顯著差異，scram =序列打亂的對照組。·圖16a)是來自非糖尿病的人視網膜的視網膜組織的LNAtm-ISH研究的顯微照片，顯示了 miR200b在視網膜毛細管(箭頭)和內核層細胞(雙楔形箭頭)中的定位。插圖是帶有內皮染色的毛細管(箭頭)的高清圖片。圖b)是糖尿病人視網膜(與(a)組中的定位相似)的顯微照片，顯示了 miR200b的最小表達量(如果有的話)。圖c)是用抗白蛋白抗體對非糖尿病人的視網膜進行免疫細胞化學染色的顯微照片，顯示有血管內白蛋白出現(箭頭)。圖d)是糖尿病人視網膜的顯微照片，顯示血管內白蛋白染色(箭頭)和視網膜的彌漫著色，說明血管通透性增加。在LNAtm-ISH實驗中，用堿性磷酸酶(ALK Pho)作為色原體，不加復染劑。在白蛋白染色中使用DAB色原體和蘇木精復染劑。圖17是對照組和糖尿病組(一種2型糖尿病的模型)(db/db)小鼠的視網膜中的miR200b表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖。*表示與對照組相比具有統計學意義上的顯著差異。圖18是對照組和糖尿病動物組大鼠視網膜中的miRl表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖。與正常(對照)組大鼠視網膜相比較，糖尿病大鼠視網膜中的miRl表達水平具有統計學意義上的顯著減少。*表示與對照組相比較P < O. 05。圖19a)是對照組和糖尿病組大鼠(鏈脲佐菌素誘導，I型糖尿病模型)視網膜組織樣本中miR144表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖。圖b)是對照組和糖尿病組大鼠視網膜組織樣本中miR450表達水平的實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析圖。*表示與對照組相比較P < O. 05。圖20是來自兩名患有增生性糖尿病視網膜病變患者的玻璃纖維組織的擴增曲線(實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析)，顯示了 miR146a和miR320的存在。在附圖中，本發明的實施方案是通過舉例的方式說明的。應當明確理解的是，說明書和附圖只用于說明和幫助理解的目的，并不意味著對本發明的范圍進行限制。發明的詳細描述除非另有規定，本發明中使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬技術領域的普通技術人員通常已知的含義。此外，除非另有說明，除了在權利要求書中，使用“或”時也包括“和”的意思，反之亦然。除非有明確規定或者在上下文清楚的另外指明，開放式的術語不應解釋成限制性的術語(例如“包括”，“含有”和“包含”通常表明“包括但不限于”)。除非另有明確規定，包括在權利要求書中使用的單數形式如“一”和該”也包括多個指代物。本發明將通過引用附圖對發明內容進行詳細的解釋。本發明涉及發現暴露于相對高濃度葡萄糖的細胞中和糖尿病受試者的視網膜中的微小RNA(miRNA)表達水平的改變。申請人:發現暴露于相對高濃度葡萄糖的細胞中和糖尿病受試者的細胞中，包括糖尿病受試者視網膜中的某些miRNAs的表達譜發生改變。申請人進一步發現，miRNAs表達的改變可能與一些已知的在糖尿病中起到重要作用的蛋白質水平的上調或下調相關。此外，申請人發現miRNA分子可用于使翻譯這些蛋白質的mRNAs的水平基本恢復正常。本發明涉及治療受試者的葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的方法和組合物。所述方法包括給受試者施用能夠調節所需受試者的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分或成分的混合物。所述組合物包括能夠調節所需的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分或成分的混合物。因此，本發明涉及基于miRNA的組合物和基于miRNA的方法，所述組合物和方法能夠使得暴露于相對高濃度葡萄糖的細胞中和患有暴露于血糖水平相關疾病的受試者細胞中，如糖尿病患者，包括糖尿病受試者的視網膜中被上調或下調的mRNA的表達水平和蛋白質的生成量基本恢復正常。本發明還涉及診斷方法，所述方法基于糖尿病相關疾病中miRNAs表達譜的差異。微小RNAmiRNAs與mRNAs的一部分或者一個或多個基因片段互補。而且，miRNAs與mRNA結合并不需要絕對的序列互補，使得它們能夠調節范圍廣泛的靶轉錄物。通常miRNAs結合 到靶序列時，在相匹配的核苷酸之間有縫隙。此處使用的術語“絕對的序列互補”的意思是用來描述兩段序列長度上的每個核苷酸對都能無縫隙的結合，比如一種miRNA和一種靶基因或轉錄物的結合。術語“互補”的意思是描述兩段序列，其中至少有50%的核苷酸從一段序列反式結合到另一段序列上。miRNAs通常與mRNA轉錄物的:V UTR互補，然而，本發明中的miRNAs可以結合到靶mRNA的任何區域。或者說，此外，miRNAs靶向于響應編碼靶mRNAs的基因的甲基化基因組位點。基因組DNA的甲基化狀態部分決定了該DNA與轉錄因子結合的容易程度。因此，DNA的甲基化和去甲基化分別調節基因的沉默和表達。本發明的miRNAs包括表I中的序列(SEQ ID NOs. 1-6)及其同源體和類似物，miRNA的前體分子和編碼所述miRNAs的DNA分子。表I
miRlSEQ ID NO. I
miR146a SEQ ID NO. 權利要求
1.一種治療受試者的葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種能夠調節所需受試者的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分或成分的混合物。
2.權利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠上調所需受試者的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達。
3.權利要求2的方法,其特征在于,所述一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA選自miR-1, miR-146a, miR200b 或者 miR-320。
4.權利要求2的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一種寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。
5.權利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或類似物、miRNA前體、成熟miRNA或者編碼所述至少一種miRNA的DNA分子的形式提供。
6.權利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以一種包括藥學上可接受的載體的組合物的形式提供。
7.權利要求4的方法，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物選自SEQIDNOs. 1-4。
8.權利要求4的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物以不超過一種給藥載體的方式提供。
9.權利要求8的方法，其特征在于，所述給藥載體選自病毒載體，微球，脂質體，膠體金顆粒，脂多糖，多肽，多糖，或聚乙二醇化的病毒載體。
10.權利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠下調所需的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達。
11.權利要求10的方法,其特征在于,所述一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA選自 miR-1444 或者 miR-450。
12.權利要求10的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括所述至少一種miRNA的抑制劑或抑制劑的混合物。
13.權利要求11的方法，其特征在于，所述抑制劑或抑制劑的混合物選自antagomir、反義RNA或者短干擾RNA。
14.權利要求12的方法，其特征在于，所述抑制劑或抑制劑的混合物以一種包括藥學上可接受的載體的組合物的形式提供。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并發癥，包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病糖尿病大血管病變。
16.權利要求I的方法，其特征在于，所述成分或成分的混合物通過胃腸外給藥途徑或者局部給藥途徑施用。
17.權利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病視網膜病變，其中成分或成分的混合物通過眼內給藥或者局部滴注到眼內的方式施用。
18.權利要求15的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病視網膜病變，其中成分或成分的混合物通過眼部植入的方式施用。
19.一種治療受試者的糖尿病視網膜病變的方法，其特征在于，所述方法包括給受試者施用一種組合物，包括至少一種(a)祀向于miR-l,miR-146a,miR-200b或者miR-320的寡核苷酸，和(b)miR-144或者miR-450的抑制劑。
20.一種診斷受試者所患疾病的方法，所述疾病與葡萄糖介導的細胞損傷相關，其特征在于，所述方法包括檢測受試者樣本中的一種或多種miRNAs的表達譜,其中受試者樣本的miRNA表達譜與正常樣本或參考樣本的miRNA表達譜的差異就是葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的指征。
21.權利要求20的診斷疾病的方法，其特征在于，所述一種或多種miRNAs選自miRl，miR146a, miR200b, miR320, miR144 或者 miR450。
22.權利要求21的診斷疾病的方法，其特征在于，與正常樣本或者參考樣本相比miRl，miR146a, miR200b和miR320的表達下調和miR144或者miR450的表達上調就是該疾病的指征。
23.根據權利要求20-22中任一項的診斷疾病的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病慢性并發癥，包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病或者糖尿病大血管病變。
24.一種治療葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的組合物，包括能夠調節所需的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs的表達的一種成分或成分的混合物，和藥學上可接受的載體。
25.權利要求24的組合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠上調所需的一種或多種細胞中的一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達。
26.權利要求25的組合物，其特征在于，所述至少一種miRNA選自miR-1，miR-146a,miR200b 或者 miR-320。
27.權利要求25的組合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物包括一種寡核苷酸或寡核苷酸的混合物。
28.權利要求27的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物以miRNA、其衍生物或類似物、miRNA前體、成熟miRNA或者編碼所述至少一種miRNA的DNA分子的形式提供。
29.權利要求27的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物選自SEQID NOs. 1-4。
30.權利要求25的組合物，其特征在于，所述成分或成分的混合物能夠下調一種或多種miRNAs中的至少一種miRNA的表達。
31.權利要求30的組合物，其特征在于，一種或多種miRNAs中的至少一種選自miR-1444 或者 miR-450。
32.權利要求30的組合物，其特征在于，成分或成分的混合物包括所述的至少一種miRNA的抑制劑或抑制劑的混合物。
33.權利要求32的組合物,其特征在于,抑制劑或抑制劑的混合物選自antagomir、反義RNA或者短干擾RNA。
全文摘要
本發明涉及治療受試者的葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的方法，包括向所述受試者施用能夠調節受試者的一種或多種損傷細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分。本發明還涉及治療葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的組合物，包括能夠調節一種或多種損傷細胞中的一種或多種miRNAs表達的成分。本發明還涉及診斷受試者的葡萄糖介導的細胞損傷相關疾病的方法，包括糖尿病視網膜病變的診斷。
文檔編號A61K31/7088GK102970994SQ201080057925
公開日2013年3月13日 申請日期2010年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者薩巴瑞塔·切卡拉克巴蒂, 馮表, 陳莎莉, 吳月修, 卡拉·麥克阿瑟 申請人:昆山市工業技術研究院小核酸生物技術研究所有限責任公司