專利名稱：作為腫瘤治療中的有效工具的靶向腫瘤血管的新型疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新穎的方法，該方法設計用于刺激免疫系統以產生幾乎專門地靶向腫瘤血管的抗體。這些抗體對抗優先地在腫瘤血管中和腫瘤血管周圍表達的自身蛋白，導致對腫瘤血管的免疫攻擊，從而誘發腫瘤生長的顯著減慢。盡管本發明總體上涉及用于哺乳動物的疫苗，但優選的實施方案涉及用于人、犬、貓或馬的疫苗，本發明將總體上并參考此類用于人、犬科動物、貓科動物和馬科動物使用的疫苗進行描述。
背景技術：
血管發生-新生毛細血管形成-在發育和需要血管發生的生理狀況諸如傷口愈合和月經周期的過程中至關重要。然而，在健康的男性中，血管發生是稀少的，并且內皮細胞 池的更新時間為數百天。然而，延長的和過度的血管發生涉及許多病理過程，即，類風濕性關節炎，視網膜病變和腫瘤生長。正常的脈管系統受到天然存在的促血管生成因子和抗血管生成因子之間平衡的緊密調節。一個非常重要的此類因子是血管內皮生長因子(VEGF)，其是胚胎發生期間血管系統發育所必需的，并且也是成人新生血管形成的重要調節物[I]。迄今為止，已經記述了多種對血管發生負調節的內源性因子[2]。到目前為止記述的抑制劑主要分成三組血漿蛋白類，基底膜蛋白類和絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins)。血管發生的內源性抑制劑的實例為凝血酶敏感蛋白(TSP)，基底膜蛋白，內皮抑素(endostatin),膠原蛋白XVIII的片段,血管抑素(angiostatin),纖溶酶原和腫瘤抑素(tumstatin)的片段，膠原蛋白IV的片段。它們的作用機制涉及通過利用整聯蛋白作為受體或通過特異性地結合不同的基質成分，誘導內皮細胞凋亡和/或干擾整聯蛋白功能。遺傳證據進一步支持了這些分子作為血管發生的負調節物的作用。在小鼠皮膚中TSP-I的過 度表達導致皮膚癌癥形成延緩和減少，而缺少TSP-2的小鼠則具有增加的皮膚血管化并顯示增強的癌癥形成[3]。此外，缺少腫瘤抑素或內皮抑素的表達的小鼠顯示加速的腫瘤生長和血管化[4]。血管生成抑制以許多方式作為治療以過度血管形成為特征的疾病的臨床策略受到關注，特別是當與化療聯合時。通過減少血管化饑餓腫瘤不靶向腫瘤區室，并且因此不依靠腫瘤細胞的特定特質，所述特定特質已知是遺傳學不穩定的。到目前為止，美國食品藥品監督管理局(FDA)已經批準了 5種抗血管生成藥物，它們均靶向VEGF或VEGFR2[1]。在臨床上，迄今為止最為成功的是VEGF-中和抗體貝伐珠單抗(Bevacizumab)(貝伐單抗(Avastin)),其在2004年早期就被批準。當與化療聯合給藥時,Avastin延長患有轉移性結腸癌、肺癌和乳腺癌的患者的存活。由FDA批準的第二種抗血管生成藥物是抗-VEGF適體培加尼布(Pegaptanib)/哌加他尼鈉(Macugen),其用于治療年齡相關性黃斑變性(AMD)。另外，靶向VEGFR2 (以及TOGF-受體β、Flt3和c_Kit)的受體酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼(Sunitinib) (Sutent)和索拉非尼(Sorafenib) (Nexavar)分別于 2006 年 I 月和 2005 年12月被批準用于治療腎癌和胃腸癌。靶向VEGF-誘導的信號傳導的第五種藥物是VEGF-中和抗體片段蘭尼單抗(Ranibizumab) (Lucentis),于2006年6月被FDA批準用于治療年齡相關性黃斑變性，該病在西方世界是失明的主要病因。以前設想由于其靶向腫瘤中的未轉化細胞，抗血管生成治療將不會遭受耐藥性相關的問題，該問題是與化療普遍相關的問題。然而，這種假設證明是不完全正確的。積累的數據顯示當疾病進展時其他血管生成途徑可以替代VEGF[5]。因此，開發可與現在腫瘤學家所使用的一系列細胞毒性藥物相當的、靶向血管生成的血管的不同功能的、用于臨床使用的多種抗血管生成藥物是很重要的。上述這些方法中的數種是非常昂貴的，藥物需要一周數次，每天一次或有時一天數次經靜脈內或肌內注射以獲得最大效應，并且還常常顯示僅在非常有限數目的癌癥類型中起效。因此需要更容易給藥、更成本有效的并且具有更寬的腫瘤類型譜的新型藥物。對于許多類型的疾病，疫苗接種是令人關注的方式。廣泛的疫苗接種計劃已經實際上根除了致殘和威脅生命的病癥諸如小兒麻痹癥、白喉和天花。對于癌癥使用疫苗接種作為治療策略的可能性成為深入研究的焦點已經持續一些時間了。然而到目前為止對于該疾病還沒有在臨床中使用疫苗接種。為什么較難以開發用于癌癥治療的疫苗存在數種原因。首先，被靶向的抗原經常是自身抗原，其也可能在生理條件下，但以較低的水平表達或在胚胎發生期間表達。因此，與針對外來病毒或細菌抗原的疫苗接種相反，需要破壞免疫系統針對所述抗原的自身耐受性。其次，腫瘤細胞具有演變機制以逃避免疫系統的識別，進一步使針對腫瘤細胞抗原的疫苗接種復雜化。第三，當針對自身抗原進行疫苗接種時，重要的是使用疾病特異性靶標。在此我們提出了一種通過將自身抗原、腫瘤血管靶標連接至非自身抗原上來增強腫瘤疫苗的功效的新策略，所述非自身抗原的尺寸大至足以包含大量T細胞表位。這確保被大多數任意MHC背景中的T細胞識別和可以用于遠系繁殖群體(OUtbread)如人中的疫苗。血管的優先靶向還減少了腫瘤細胞耐受治療的可能性。此外，抗血管生成疫苗接種可以為藥物的反復和長期給藥提供一種成本有效的替代方式。對于處于發生遺傳類型癌癥高危的個體，抗血管生成疫苗接種也可作為預防性治療。我們為開發癌癥疫苗選擇的抗原是在成人生命期間優先地在腫瘤脈管系統中表達的六種不同的抗原，纖維連接蛋白的胞外結構域(extra-domain)B (EDB) [6]、纖維連接蛋白的胞外結構域A(EDA) [6]、腱生蛋白(tenascin)-C的胞外結構域C[7]、膜聯蛋白(annexin)Al [8]、內皮唾酸蛋白(endosialin) [9,10]和 Robo4(magic roundabout) (MR)。EDB是一個通過選擇性剪接插入至纖維連接蛋白中的91個氨基酸的結構域。EDB在胚胎發生期間表達，但在成人中在正常情況下不表達。然而，EDB在許多實體腫瘤中高度表達[6]。通過施用與放射性試劑或細胞毒性劑連接的抗體靶向EDB已經在癌癥的小鼠模型中且在II期臨床試驗中得到了非常有希望的結果(關于更新的信息參見http:// WWW. philogen. com/)。EDA是通過選擇性剪接插入至纖維連接蛋白中的另一個胞外結構域(REF)。此結構域已經被發現在某些腫瘤組織中表達，但一般不在成人的其他組織中表達ο腱生蛋白C的C-結構域在多種腫瘤類型中過度表達，例如，在高級別星形細胞瘤中，但在大多數正常成人組織中檢測不到[7]。同樣MR在活躍的血管生成的部位處表達，如腫瘤，但除了胚胎發生期間以外在正常組織中不表達[7]。同樣內皮唾酸蛋白和膜聯蛋白Al兩者優先地在腫瘤組織中表達。
現有技術治療癌癥的疫苗接種策略已經成為來自制藥工業和學術研究者兩方面都非常活躍的研究領域。然而，成功非常有限。對于此不成功的一個非常重要的因素是大多數臨床和臨床前試驗采用未修飾的蛋白進行。這也導致腫瘤生物學領域內的幾乎所有研究小組都得出結論，不可能獲得有效的腫瘤疫苗。因此幾個小組和公司已經轉向使用單克隆抗體。采用EDB所面臨的甚至更為困難的情形是該序列極端保守，使得幾乎不可能在小鼠或大鼠中制備針對人蛋白質的單克隆抗體，已經使用噬菌體展示技術來獲得用于治療的EDB結合結構(參見http://www. philogen. com/)。然而至少有一家公司已經采用修飾的蛋白質進行了癌癥疫苗的研究，其是位于丹麥的Pharmexa。他們已經使用了來自于各種非自身蛋白質的所謂的優勢免疫表位。這些短的優勢免疫表位已經被插入至祀分子中(WWW. pharmexa.com)。然而，插入優勢免疫表位的思路是，表位與特定的MHC I類，或II類分子非常強的結合。這使得這些疫苗依賴于高度變化的參數，即MHC分子的肽特異性。通過使用具有較多數目的肽的融合蛋白，我們克服了采用單一的優勢免疫表位的問題，并且獲得了具有更普遍用途的疫苗。所有以前測試的疫苗還靶向腫瘤和非血管相關抗原。腫瘤抗原已經顯示容 易被下調，并且腫瘤可以因此相對容易地逃避這些治療方法。這是由腫瘤細胞的高度可塑性導致的。然而，所有腫瘤需要血管來生存和生長，因此采用新的更強力的治療性疫苗(該疫苗由單種或至多6種不同的腫瘤特異性血管靶標的組合組成)靶向血管的這種策略是一種靶向侵襲性極強的快速生長腫瘤的新的和更為有效的方式。本發明的目的本發明的目的是提供一種通過靶向腫瘤脈管系統(生長中的腫瘤的必要部分)用于治療各種類型癌癥的方便的、有效的和成本有效的方法。采用由纖維連接蛋白的細胞外結構域B (EDB)、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C的胞外結構域C或Robo4 (MR)與任何非自身來源的外源載體分子之間的融合蛋白組成的疫苗，一次用這些融合蛋白中的一種或用這些融合蛋白中的兩種至六種的組合治療各種類型的癌癥。
發明內容
根據本發明通過疫苗或疫苗的組合實現了上述目的，所述疫苗的特征在于包含與一種或多種異源載體蛋白連接的一種蛋白或兩種至六種蛋白的組合并且任選地包含佐劑，所述蛋白具有來自待接種物種的處于其原始形式或多聚形式的EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C的胞外結構域C或Robo4(MR)的完整氨基酸序列或所述氨基酸序列的大于5個氨基酸的節段。
圖1A、B、C、D、E和F分別顯示人EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C的胞外結構域C或Robo4 (MR)的氨基酸序列。圖2顯示硫氧還蛋白-EDB和GST-EDB構建體，和來自相同構建體的純化蛋白的示意性圖示，所述構建體作為ELISA包被抗原用于免疫并且用于小鼠腫瘤模型中的概念驗證的研究。圖3顯示疫苗接種后對腫瘤重量的作用。給出了接種小鼠和對照小鼠組中的抗體效價。圖4顯示了在小鼠腫瘤模型中疫苗接種策略對腫瘤大小的顯著作用。
具體實施例方式抗EDB抗體、抗EDA抗體、抗膜聯蛋白Al抗體、抗內皮唾酸蛋白抗體、抗腱生蛋白C胞外結構域C抗體或抗Robo4(MR)抗體在宿主中通過主動免疫(所謂的疫苗接種)制備。通過將修飾的EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4 (MR)注射至宿主中，宿主的免疫系統針對其自身的EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4(MR)產生多克隆抗體應答，從而通過免疫系統靶向腫瘤特異性血管進行攻擊。非常重要的是修飾抗原使得宿主的免疫系統將被修飾的自身蛋白識別為非自身蛋白。這可以通過將非自身氨基酸區域與來自待治療物種的EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4(MR)或這三種分子的選擇區域共價偶聯來實現。然后非自身區域內的肽吸引并激活未耐受的T細胞，所述T細胞對潛在的自身反應性B細胞提供幫助。 對自身蛋白質進行這些修飾有至少三種不同的策略。一種方法是在原核或真核系統中產生非自身蛋白和完整的自身EDB、腱生蛋白C或MR或自身EDB、腱生蛋白C或MR的5個氨基酸以上的選擇片段之間的融合蛋白。EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4(MR)的開放閱讀框，以圖I中示例的人EDB，EDA，膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4 (MR)為例，然后首先克隆至細菌、真菌或真核載體中。此融合蛋白構建體然后被轉染至哺乳動物或原核宿主中用于產生所需的融合蛋白。融合伴侶可以為10個氨基酸至幾百kD的任何尺寸的任何非自身蛋白。然而，通常有利地使用尺寸與自身蛋白大致相同的融合伴侶。備選地，未修飾的EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4(MR)可以在哺乳動物或原核宿主或宿主細胞系中制備，然后通過化學偶聯共價連接至載體蛋白。第三種替代方案，在我們的心目中是不太有吸引力的，該方案將EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4 (MR)序列的選擇區域制成合成肽，然后通過化學偶聯將這些肽連接至外源載體分子。此第三種備選方案在注射至患者中后通常導致顯示針對天然適宜折疊的蛋白質的低結合活性的抗體應答，并且因此產生較小的臨床效果。在制備后，疫苗抗原然后被純化并測試致熱原含量和其他污染物的潛在含量。為了獲得針對自身表位足夠強的免疫應答，接著疫苗抗原(任選地)與佐劑混合，然后注射至患者中。在患者中施用后，疫苗誘導針對疫苗抗原的免疫應答。由于疫苗抗原中自身表位的存在，此蛋白還誘導針對靶分子的抗體應答，所述靶分子在此是EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C或Robo4 (MR)，從而靶向免疫系統以攻擊腫瘤血管，導致腫瘤生長的減緩并且可能甚至全部清除腫瘤。實施例為了測試本發明的功效，91個氨基酸長的人和小鼠纖維連接蛋白的細胞外結構域B(EDB)和大小為大約IOkD的細菌抗原大腸桿菌硫氧還蛋白之間的融合蛋白用作疫苗抗原以研究在動物模型中的作用。EDB結構域是極其高度保守的并且在被研究的所有胎盤哺乳動物中幾乎是相同的。此融合蛋白在原核宿主中制備成幾乎同質(圖2)。然后硫氧還蛋白-EDB-融合蛋白與佐劑一起注射至小鼠中。3周后，小鼠接受加強劑量的疫苗，并且治療5周后，測試來自這些動物的血清中產生的抗EDB抗體的量。如從圖3中所看到的那樣，所有動物顯示高效價的抗EDB抗體，而所有對照則是陰性的。這顯示該疫苗具有在測試動物中誘導大量抗EDB抗體產生的能力。然后在小鼠腫瘤模型中測試這些抗體的體內功效。發現疫苗接種和在激發宿主免疫系統后產生的抗體有效地減小這些動物中的腫瘤尺寸(圖4)。抗EDB抗體還導致腫瘤組織的顯著變化，如通過電子顯微鏡檢查所觀察到的那樣(數據未顯示)。抗EDB抗體與腫瘤脈管系統的結合明確地導致免疫細胞的顯著浸潤和免疫系統對這些血管的攻擊。對脈管系統的這種作用最有可能導致在接種疫苗的動物中所觀察到的腫瘤尺寸的有效減小。總之，與對癌癥疫苗的以前的大多數研究相反，我們顯示了由疫苗誘導的高效價
和生物活性抗體，以及其對腫瘤生長具有良好的療效。參考文獻[I]Olsson AK, Dimberg A，Kreuger J，Claesson-Welsh L. VEGF receptorsignalling-in control of vascular function. Nat Rev Mol Cell Biol 2006 ；7 (5)359-71.[2]Folkman J. Endogenous angiogenesis inhibitors. Apmis 2004 ;112 (7-8)496-507.[3]Hawighorst T，Velasco P, Streit M，Hong YK, Kyriakides TR, Brown LF，etal. Thrombospondin-2 plays a protective role in multistep carcinogenesis a novelhost anti-tumor defense mechanism. Embo J 2001 ；20 (11) :2631-40.[4]Sund M， Hamano Y， Sugimoto H， Sudhakar A， Soubasakos M， Yerramalla U等.Function of endogenous inhibitors of angiogenesis as endothelium-specifictumor suppressors. Proc Natl Acad Sci USA 2005 ；102 (8) :2934-9.[5]Ferrara N，Kerbel RS. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature2005 ；438(7070) :967-74.[6]Scarpino S,Stoppacciaro AiPellegrini CiMarzullo A,Zardi L,TartagliaF 等· Expression of EDA/EDB isoforms of fibronection in papillary carcinoma ofthe thyroid. J Pathol 1999; 188 (2) :163-7.[7]Silacci M，Brack SS, Spath N，Buck A，Hillinger S，Ami S，et al.人monoclonal antibodies to domain C of tenascin—C selectively target solid tumorsin vivo.Protein Eng Des Sel 2006 ；19 (10) :471-8.[8] Oh P，Li Y，Yu J，Durr E，Krasinska KM, Carver LA，et al. Subtractiveproteomic mapping of the endothelial surface in lung and solid tumours fortissue-specific therapy. Nature 2004 ；429 (6992) :629-35.[9]Teicher BA. Newer vascular targets endosialin(review). Int J Oncol2007 ；30(2) :305-12.[10] Rettig WJ, Garin-Chesa P，Healey JH, Su SL, Jaffe EA, Old.Identification of endosialin， a cell surface glycoprotein of vascularendothelial cells in 人 cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ；89 (22) :10832-6.[ll]Huminiecki L, Gorn M，Suchting S，Poulsom R，Bicknell R. Robo4 is anew member of the roundabout receptor family that is endothelial speci fic andexpressed at sites of active angiogenesis. Genomics 2002 ；79 (4) :547-52.
權利要求
1.一種疫苗，其由與載體分子連接的處于其原始形式或多聚形式的EDB、EDA、膜聯蛋白Al、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白C胞外結構域C、Robo4 (MR)或其至少一個片段的氨基酸序列的單個或組合，以及藥用佐劑組成。
2.根據權利要求I所述的疫苗，其中處于其原始形式或多聚形式的EDB的至少一個片段與載體分子連接。
3.根據權利要求I或2所述的疫苗，其中所述EDB是人、犬科動物、貓科動物或馬科動物來源的。
4.根據權利要求I或2的EDB疫苗，所述疫苗用于藥物中。
5.融合蛋白在醫用疫苗的制備中的用途，所述融合蛋白由來自待治療物種的整個EDB或一部分EDB和外源載體蛋白組成。
6.根據權利要求I所述的疫苗，其中處于其原始形式或多聚形式的EDA的至少一個片段與載體分子連接。
7.根據權利要求I或6所述的疫苗，其中所述EDA是人、犬科動物、貓科動物或馬科動物來源的。
8.根據權利要求I或6的EDA疫苗，所述疫苗用于藥物中。
9.融合蛋白在醫用疫苗的制備中的用途，所述融合蛋白由來自待治療物種的整個EDA或一部分EDA和外源載體蛋白組成。
10.根據權利要求I所述的疫苗，其中處于其原始形式或多聚形式的膜聯蛋白Al的至少一個片段與載體分子連接。
11.根據權利要求I或10所述的疫苗，其中所述膜聯蛋白Al是人、犬科動物、貓科動物或馬科動物來源的。
12.根據權利要求I或10的膜聯蛋白Al疫苗，所述疫苗用于藥物中。
13.融合蛋白在醫用疫苗的制備中的用途，所述融合蛋白由來自待治療物種的整個膜聯蛋白Al或一部分膜聯蛋白Al和外源載體蛋白組成。
14.根據權利要求I所述的疫苗，其中處于其原始形式或多聚形式的內皮唾酸蛋白的至少一個片段與載體分子連接。
15.根據權利要求I或14所述的疫苗，其中所述內皮唾酸蛋白是人、犬科動物、貓科動物或馬科動物來源的。
16.根據權利要求I或14的內皮唾酸蛋白疫苗，所述疫苗用于藥物中。
17.融合蛋白在醫用疫苗的制備中的用途，所述融合蛋白由來自待治療物種的整個內皮唾酸蛋白或一部分內皮唾酸蛋白和外源載體蛋白組成。
18.根據權利要求I所述的疫苗，其中處于其原始形式或多聚形式的腱生蛋白C胞外結構域C的至少一個片段與載體分子連接。
19.根據權利要求I或18所述的疫苗，其中所述腱生蛋白C胞外結構域C是人、犬科動物、貓科動物或馬科動物來源的。
20.根據權利要求I或18的腱生蛋白C胞外結構域C疫苗，所述疫苗用于藥物中。
21.融合蛋白在醫用疫苗的制備中的用途，所述融合蛋白由來自待治療物種的整個腱生蛋白C胞外結構域C或一部分腱生蛋白C胞外結構域C和外源載體蛋白組成。
22.根據權利要求I所述的疫苗，其中處于其原始形式或多聚形式的Robo4(MR)的至少一個片段與載體分子連接。
23.根據權利要求I或22所述的疫苗，其中所述Robo4(MR)是人、犬科動物、貓科動物或馬科動物來源的。
24.根據權利要求I或22的Robo4(MR)疫苗，所述疫苗用于藥物中。
25.融合蛋白在醫用疫苗的制備中的用途，所述融合蛋白由來自待治療物種的整個Robo4 (MR)或一部分Robo4 (MR)和外源載體蛋白組成。
全文摘要
本發明涉及一種用于治療各種癌癥的組合物。所述組合物是含有與一個或數個異種外源載體分子連接的單個或組合的EDB、EDA、膜聯蛋白A1、內皮唾酸蛋白、腱生蛋白的C結構域或Robo4(MR)的序列或其片段的疫苗。所述疫苗將產生針對在腫瘤血管中或周圍優先表達的自身蛋白的抗體。所述疫苗優選地與佐劑一起給藥。
文檔編號A61P35/00GK102791290SQ201080057357
公開日2012年11月21日 申請日期2010年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者A-K·奧爾森, L·赫爾曼 申請人:斯拉瓦克制藥股份公司