專利名稱：用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法
技術領域：
本發明涉及用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，尤其涉及在具有含牙髓細胞的牙髓的離體牙的移送中，提高該細胞的保存性。
背景技術：
自古以來，如同通過輸血而被大家所熟知的那樣，使用采集的細胞，使由于外傷或疾病以及事故等失去的組織或臟器再生的再生醫療的研究開發一直很活躍。近年來，再生醫療的具體過程以如下過程為目標采集未分化狀態的干細胞，將其在體外進行培養，根據不同情況使其分化后，移植到患處促使再生。作為用于這方面的干細胞，已知有胚胎干細胞(ES細胞)和成體干細胞。胚胎干細胞是具有高增殖能力和多能性的源自胚胎的細胞，但是關于將其應用到再生醫療方面，還存在由于使用受精卵帶來的倫理問題及因移植產生的排斥反應問題等。另一方面，成體干細胞與胚胎干細胞相比，雖然限制了分化能力，但是由于以較未分化的狀態存在于活體的各種組織中，因此可以采集、培養自身細胞，用于治療。因此，成體干細胞在其應用方面不具有如胚胎干細胞那樣的倫理方面及排斥反應的問題，因此，在再生醫療方面正在向實用化方面發展。至今為止，雖然認為在骨髓、肌肉、神經、肝臟、脾臟、小腸等多個組織中存在成體干細胞，但由于能夠向間葉組織(皮膚、骨、軟骨、齒、神經、血管、心肌等)分化的間葉干細胞(mesenchymal stem cell)的有用性，因此現今最被期待用于再生醫療中。作為含有該間葉干細胞的組織，以骨髓為首，還已知有牙髓、脂肪組織、臍帶血等。但是，由上述組織中采集干細胞時，采集對象往往要擔負痛苦等風險，例如，骨髓需要進行基于骨髓穿刺的骨髓采集手術，從脂肪組織中的采集需要伴隨吸脂手術來實施等。此外，雖然臍帶血的采集幾乎不伴有痛苦，但是需要配備滿足嚴格采集條件的設備，并且采集的時機僅限于分娩時。因此，提出了與這些組織相比，能夠以極低的風險進行采集的牙髓干細胞的應用(專利文獻I及2)。即，含牙髓干細胞的牙髓細胞可以采集自以往在醫療設施中作為醫療廢棄物來處理的立事牙(智齒)或乳牙等離體牙，因此容易收集，在確立培養方法及保存方法方面也給出了高實用性的啟示。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本專利第4125241號公報專利文獻2 :日本特開2004-201612號公報
發明內容
要解決的技術問題但是，一般情況下，以用于再生醫療為目的進行采集、培養的干細胞需要冷凍保存，直至實際用于治療時為止。但是，個人將干細胞在最佳條件下進行長期保存是完全不現實的事情，因此現在，對采集干細胞的培養、保存處理及保存，大多必然要委托給具備細胞保藏設備的機構。因此，在牙髓干細胞的情況下，在各牙科醫療機構拔除的牙在從該機構移送給細胞保藏機構，直至進行培養、保存處理為止的這段時間，顯然需要使干細胞處于存活狀態。但是，為了更加切實地利用從離體牙中采集的僅極微量的牙髓干細胞，使其在維持同活體內一樣高的增殖能力的狀態下，將牙髓干細胞移送到細胞保藏機構的技術還未見報道。因此，在所述機構中進行細胞采集、保存處理的階段，存在已經對干細胞造成功能損傷的可能性。即，在上述體制的情況下，由于進行準備及運輸，從牙齒被拔除掉開始到取出 牙髓細胞、進行培養及保存處理為止，需要2Γ48小時左右，但是難以從經過這樣一段時間后的離體牙中確保完整的牙髓細胞。尤其是恒牙的情況下，即使浸潰于保存液中進行移送，但由于保存液被象牙質所包圍，不能夠充分浸透到牙髓，因此牙髓細胞只能夠保持極短的時間。因此，能夠想到預先從離體牙中取出帶有牙髓細胞的牙髓，并浸潰到保存液中進行移送，但是在技術及設備存在差異的各醫療設施中，要將因微量而難以處理的牙髓以穩定的品質進行處理，實際上被認為是不可能的。本發明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供一種不損傷牙髓細胞在活體內的功能，移送用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的方法。技術方案為了實現上述目的，本發明人進行了深入研究，結果發現通過對離體牙進行使牙髓露出的特定處理，然后以保存狀態進行運送，能夠在使牙髓干細胞保持再生醫療所需的正常功能的狀態下，移送含牙髓的離體牙，至此完成了本發明。S卩，本發明的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征為，其包括下列工序在離體牙的表面添加直線形的槽；沿著槽分割所述離體牙，使牙髓露出；將所述離體牙浸入培養基，以維持在適合細胞保存的溫度的狀態進行運送。并且，在所述方法中，所述直線形的槽優選為沿著從離體牙的齒冠至齒根的縱切線，從該離體牙的側面向中心形成槽。并且，在所述方法中，所述直線形的槽優選為沿著離體牙的齒冠部咬合面的分割線，從該離體牙的上面向中心形成。并且，在所述方法中，所述運送所需時間優選為48小時以內。并且，在所述方法中，所述離體牙為恒牙，優選為牙髓未經處理的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。并且，在所述方法中，所述直線形的槽的長度優選為5 10mm、寬度優選為
O.5^1. 5mm、深度優選為2 4mm。此外，本發明的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征為，包括將形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體乳牙浸入培養基內，以維持在適合細胞保存的溫度的狀態進行運送的工序。
并且，在上述方法中，所述運送所需時間優選為48小時以內。發明效果根據本發明，將具有含牙髓干細胞的牙髓的離體牙向細胞保藏機構等移送所需的2Γ48小時期間，能夠不損害并維持在活體內的功能。因而，在拔牙后能夠保持接近活體內的狀態直至進行牙髓干細胞的培養、保存處理，因此能夠將從離體牙中采集的僅極微量的牙髓干細胞有效地應用于再生醫療。
圖I為根據本發明方法的(A)乳牙、(B)恒牙的牙髓細胞的增殖曲線。圖2為根據本發明方法的(A)乳牙、(B)恒牙的牙髓細胞的ALP染色質像。
圖3為根據本發明方法的(A)乳牙、(B)恒牙的牙髓細胞的SA-β -gal染色質像。圖4為根據本發明方法的牙髓細胞的培養細胞的染色體像。圖5為根據本發明方法的牙髓細胞的培養細胞的染色體像。
具體實施例方式本發明提供一種例如在細胞保藏機構中對牙髓細胞進行培養、保存處理，必要時應用于再生醫療的這一模型中，在從齒科醫療機構運送到細胞保藏機構期間，用于保存牙髓的存活細胞數量及其功能的移送方法，所述牙髓細胞存在于從在各地齒科醫療機構被拔除的牙中得到的牙髓中，并含有牙髓干細胞。從將牙髓中的微量細胞切實地用于培養、保存的角度來看，本發明與技術、設備無關，在任何齒科醫療機構都可以容易地實施，并且可發揮穩定的細胞保持效果。此外，本發明方法顯然也能夠適用于除所述的從齒科醫療機構送至細胞保藏機構以外的的細胞移送中。下面，對本發明方法的優選實施方式進行說明。本發明使用的離體牙，只要是具有牙髓的離體牙即可，可以是乳牙，也可以是恒牙。通常，可以使用在牙科醫療機構通過牙科處理來拔除掉的離體牙。并且即使是自然脫離的牙，只要牙的狀態符合下述條件，并且能夠迅速地進行后述的對離體牙的處理，就可以使用。作為特別適合利用牙髓干細胞的離體牙可以例舉如下狀態的離體牙。作為乳牙，可以使用未經過處理的牙、修復牙中的任何一種，但進行了牙髓切斷及拔髓等處理的牙不優選。并且，對于已被確認為搖動的乳牙，優選沒有齲齒，且形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體牙。患有齲齒、根尖牙周炎(Per)等的離體牙，由于不能期望采集到正常的牙髓，因此不適合使用。此外，對于沒有被確認搖動的乳牙，同樣優選沒有齲齒，且形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體牙。但是，即使有齲齒，但進程停止在Cl (琺瑯質齲齒)或C2 (象牙質齲齒)并確認形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體牙也可以使用。另一方面，因齲齒而發生牙髓炎的離體牙。作為恒牙，適合使用作為所謂立事牙(智齒)的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙等可以拔掉的牙，但同乳牙一樣，不優選經過牙髓處理的離體牙及牙髓患病的離體牙。即使是因拔牙處理等出現牙損傷或缺損的情況下，只要該離體牙為停止在琺瑯質或象牙質等不影響后述的離體牙處理，就沒有問題，能夠使用。接下來，對離體牙的處理進行詳細說明。上述離體牙，根據需要對其表面進行擦拭、消毒，并在表面設置直線形的槽。由于該槽作為下一步工序中對牙齒進行分割時的向導，因此在沿著該槽對牙進行分割時，需要在位于牙齒中心的牙髓露出的位置及方向上形成。在分割時應盡可能地露出牙髓，對于槽的形成位置及方向沒有限制，例如可例舉下述實施方式。
(例I)沿著從離體牙的齒冠至齒根的縱切線，從該離體牙的側面向中心形成槽。離體牙側面上的所述縱切線的位置，只要沿該縱切線的槽可朝向該離體牙中心進行雕刻即可，沒有限制。(例2)沿著離體牙的齒冠部咬合面的分割線，從所述離體牙的上面向中心形成槽。此時，成為槽的分割線優選通過咬合面的大致中心，但只要槽朝向離體牙中心進行雕刻，所述分割線的位置就不成為問題。希望的是上述槽盡可能長、深地形成。槽的長度及寬度，只要是能夠以該槽作為向導進行分割的程度即可，根據離體牙的大小及設置槽的部位，優選在長5 10mm、寬
O.5^1. 5mm的范圍內進行適當調節。并且，槽的深度為從琺瑯質至象牙質的程度，優選為向牙中心2 4_的范圍。如果槽過深，則牙髓細胞往往會破碎，因此需注意。并且，所述槽的形成，例如可以在注水條件下，使用金剛石刻刀實施。在本發明的方法中，在離體牙上按照上述方法設置槽后，沿著該槽對牙進行分割。如果所述槽朝向牙髓所在的中心進行適當雕刻，則離體牙沿著該槽能夠正好切成兩部分。即，通過預先在上述的工序中，添加適當的槽，則與技術及設備無關，能夠使堅固的牙齒容易地進行分割。對于分割離體牙的方法沒有限制，通常，將牙根梃子等插入到槽中，沿著槽壓開，從而能夠將牙齒分為兩個部分。困難的情況下，可以將角鑿等插入到槽中，用木槌等敲打，可以分成兩部分。沿著預先設置的槽將離體牙進行適當的分割時，存在于其內部中央的牙髓會露出。此時，優選不使器具等與露出的牙髓接觸。此外，對牙齒的分割數量也沒有限制，但對于使牙髓露出，可認為分成兩部分已經足夠。但是，在通過一次分割不能夠使牙髓充分露出的情況下，根據需要，需要重新從形成槽的工序再次進行。將分割后的離體牙浸潰于細胞用培養基或保存液中，并保持在適合保存細胞的溫度下。通過在這種狀態下進行運送，能夠使存在于離體牙內的牙髓中的，含有牙髓干細胞的牙髓細胞在48小時以內幾乎完全維持原有的全部功能(生理活性)及其存活細胞數。適合保存細胞的低溫是指在抑制代謝活性的狀態下，使細胞能夠存活的溫度，一般為4 8°C，最優選為4°C。
使用的培養基或保存液，只要是通常用于細胞培養及細胞保存中的即可，尤其優選 a -MEM 培養基(20%FBS、100yM L(+)_ 抗壞血酸、青霉素(50u/mL)/鏈霉素(50 μ g/mL)。將這些培養基或保存液放入用于培養的帶蓋試管等中，將露出牙髓的分割離體牙浸潰到其中，并蓋上蓋子，以維持適合保存細胞的溫度(例如4°C)的狀態進行運送為優選。此外，離體牙為乳牙，齒根部被吸收的情況下，培養基或保存液容易浸透到牙髓。因此，對于乳牙，也可以省略上述在牙齒上形成槽的工序及分割工序，僅按照上述方法將離體乳牙浸潰到細胞用培養基或保存液中，保持在低溫下進行運送。這種情況下，牙髓細胞也能夠幾乎以完整的狀態保存2Γ48小時。當然，同樣也可以像恒牙一樣，在乳牙上形成槽及進行分割處理。按照上述順序進行移送的離體牙中的含牙髓干細胞的牙髓細胞(牙髓)優選在細胞保藏機構中，在適當的條件下從離體牙中取出，按照公知的細胞處理方法進行培養、保存 處理后，長期保存。可以在必要時取出保存的牙髓細胞，用于再生醫療等。或者也可以對保存的細胞施以iPS化等技術，用于醫療或研究。實施例下面，表示本發明的實施例，但本發明并不限于這些實施例。首先，表示根據本發明方法的離體牙(乳牙、恒牙)移送(保存)例。〈移送(保存)例〉乳牙按照牙科的方法拔掉沒有齲齒，且形成2/3以上后繼恒牙齒根的搖動的乳牙或者有未達琺瑯質僅限于象牙質的齲齒且形成2/3以上后繼恒牙齒根的非搖動的乳牙。拔掉后放入充滿a -MEM培養基的無菌試管中，在低溫(4°C)下冷藏，包括運送時間保存24小時。恒牙按照牙科的方法拔掉沒有齲齒，未處理牙髓的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。拔掉后，使用金剛石刻刀在牙齒的側面中央位置，從齒冠上端至根尖添加槽，槽的深度至象牙質。然后，沿著槽使用牙根梃子將牙縱切為兩部分，使牙髓露出。將分割后的牙放入充滿a -MEM培養基的無菌試管中，在4°C下冷藏，包括運送時間保存24小時。將進行了上述移送(保存)例的乳牙及恒牙的牙髓細胞按照下述順序進行培養、保存，并對其功能的保持進行了研究。<培養方法>I.牙髓的采集將上述移送(保存)例的離體牙(從拔牙開始24小時)在滅菌皿中拍攝照片。然后，使用鑷子和鉆孔器，取出牙髓。對取出牙髓的牙拍攝照片，用福爾馬林固定。回收牙髓，以IOOXg 4°C 20sec進行離心后，去除上清液，加入IOmL的沖洗用PBS，對其再次離心，反復進行3次這種沖洗工序。去除上清液，加入2mL的酶解用培養基，在37°C下處理I小時(30分鐘混合一次)，將其在2000rpm (4°C)下離心5分鐘。去除上清液，加入5mL的a -MEM培養基，在2000rpm (4°C )下離心5分鐘。然后，去除上清液，加入5mL的a-MEM培養基，對細胞數量進行計數，將獲得的牙髓細胞接種至T-25燒瓶中。并且，上述酶解用培養基為7. 5mL的a -MEM培養基(a -MEM :395mL、FCS IOOmL,200mM 的抗壞血酸:250 μ L、PS 5mL 的混合液)，2· 5mL 的 DispaseII (2. 4U/mL、Roche 公司生產)，以及30mg的膠原酶(和光純藥公司生產)的混合液。2.牙髓細胞培養在上述工序后，2天更換一次培養基，融合后進行下一步的繼代操作。并且，在接種I天后及繼代前拍攝細胞照片。3.繼代使用PBS (—)對培養細胞進行2次沖洗后，加入ImL O. 05%的胰蛋白酶/EDTA進行再次沖洗，在37°C下進行5分鐘孵育(incubater)。然后，加入5mL新的a -EME培養基進行懸浮后,在IOOOrpm (4°C)下離心5分鐘。去除上清液，懸浮于新的培養基中，接種到IOcm的培養皿中，進行培養(繼代第2代)。并且，采集IOmL將繼代第2代培養了 3天以上的培養基，并在_20°C下保存，將保存的液體作為病毒檢查的檢體。通過重復上述操作，按照同樣的方法獲得繼代第3代 第10代。4.原種的制備各繼代的原種按照下述方法制備。在上述繼代操作后,對細胞數量進行計數,在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。然后，去除上清液，加入細胞庫II (Cell Banker II)進行懸浮，使每瓶中的細胞數為I X IO6細胞/mL以上。將其分別注入到小瓶中，每瓶注入lmL，將小瓶放入到生物冷凍容器(ΒΙ0FREEZING VESSEL)中，在_80°C下放置2天后，移入到液氮中。將由上述方法培養的繼代第3代、第7代、第10代的牙髓細胞按照下述方法進行試驗。〈制作增殖曲線〉將在培養皿上培養的細胞用PBS (—)清洗2次后，加入ImLO. 05%胰蛋白酶/IOmMEDTA，洗凈。然后，在37°C下進行5分鐘孵育，確認細胞已從培養皿中剝離后，加入培養基進行懸浮。將細胞懸浮液在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘，去除上清液后，再次加入培養基進行懸浮，在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。然后，將細胞懸浮于新的培養基中，對細胞數量進行計數。將5. 4 X IO5數量的細胞懸浮于9. 5mL培養基中，在24孔板的12個孔中以500 μ L/孔分別注入。然后，在各孔中分別加入500 μ L培養基，使其為ImL/孔。將其在37°C，5%C02培養箱中培養，每24小時對2個孔中的細胞數量進行計數。計數直到細胞增殖達到穩定期為止，從而得到圖I所示的增殖曲線。圖I中的(A)為乳牙、(B)為恒牙的牙髓細胞的增殖曲線。所述乳牙、恒牙均是通過上述移送(保存)例獲得的。牙髓細胞的培養是根據上述培養方法進行的。如圖I所示，使用的恒牙、乳牙中的任意牙髓細胞，直至第10代為止均維持了幾乎同等的增殖能力，與一般的牙髓細胞(拔牙后立即進行培養)的增殖曲線相比沒有發現異
堂
巾O并且，對沒有進行本發明的移送方法，而僅是在拔牙后浸入保存液中進行24小時以內上述培養的牙也進行了同樣的試驗，對于恒牙的增殖能力大幅度降低，每增加一次繼代次數，其降低程度變得顯著。并且，根據本發明，能夠在維持含干細胞的牙髓細胞的增殖能力的狀態下，對離體牙進行移送。〈堿性磷酸酶(ALP)染色〉將在培養皿中培養的細胞用PBS (—)清洗2次后，進一步加入ImL O. 05%胰蛋白酶/IOmM EDTA，洗凈。然后，在37°C下進行5分鐘孵育，確認細胞已從培養皿中剝離后，力口入培養基進行懸浮。將細胞懸浮液在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘，去除上清液，然后再次加入培養基進行懸浮，在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。
然后，對細胞數量進行計數，在6孔板中以I X IO5細胞/孔進行接種，培養I夜。培養后，將細胞用PBS清洗I次，用2mL 4%的PFA固定3分鐘，用PBS清洗2次。然后，加入 ImL 的檢測緩沖液(IM Tris-HCl (pH 9. 5) :50mL、3M NaCl : 16. 67mL、IM MgCl 25mL、B, W :408. 33mL的混合溶液)，放置2分鐘。吸出檢測緩沖液，加入500 μ L顯色液(檢測緩沖液5mL、NBT : 16. 5 μ L、BCIP 16 μ L)，避光放置2小時后，用蒸餾水清洗5分鐘孔中的細胞。在各個孔中加入700 μ L的4% PFA/PBS，在室溫下孵育10分鐘。然后，去除4% PFA/PBS，用PBS (一)沖洗3次。接著，在各個孔中加入3滴IMMU-M0UNT，蓋上蓋玻片，在室溫下保存。圖2中的(A)為乳牙、(B)為恒牙的牙髓細胞的染色質象。所述乳牙、恒牙，均是通過上述移送(保存)例獲得的。牙髓細胞的培養是根據上述方法進行的。堿性磷酸酶(ALP)用作成骨細胞的標記，已知表示骨形成的細胞被染成紫色(ALP陽性細胞)。如圖2所示，使用的恒牙、乳牙中的任意牙髓細胞均確認為ALP陽性細胞。雖然可看出ALP陽性細胞隨著繼代數的增加而減少，但通過繼代，細胞的總數本身增加。因此,能夠想到這些牙髓細胞在整形外科疾病(骨折等骨修復等)方面非常有用。并且，該結果不遜色于通過其它途徑得到的通常的牙髓細胞(拔牙后立即進行培養的牙髓細胞)所帶來的效果O并且，對沒有進行本發明的移送方法，而僅是在拔牙后浸入保存液中進行24小時以內上述培養的牙也進行了同樣的試驗，對于恒牙，可知ALP陽性細胞數量及細胞的總數明顯少于圖2 (B)。因此，根據本發明，能夠在維持含干細胞的牙髓細胞的增殖能力的狀態下，對離體牙進行移送。〈細胞老化的測定(SA-β-gal染色)>將在培養皿中培養的細胞用PBS (—)清洗2次后，進一步加入ImL O. 05%胰蛋白酶/IOmM EDTA，洗凈。然后，在37°C下進行5分鐘孵育，確認細胞已從培養皿中剝離后，力口入培養基進行懸浮。將細胞懸浮液在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘，去除上清液，然后再次加入培養基進行懸浮，在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。然后，將細胞懸浮于新的培養基中，對細胞數量進行計數，在6孔板中以I X IO5細胞/孔進行接種后，在37°C，5%C02下孵育24小時。
除去培養基，用PBS (—)沖洗，在各孔中加入700 μ L的4%PFA/PBS，在RT下孵育10分鐘。然后，去除4% PFA/PBS、，用PBS (一)沖洗3次。在各孔中加入700μ L的SA-β-gal溶液，在室溫下孵育I夜，在顯微鏡下對染色的細胞進行檢查后攝影。除去SA-β-gal溶液，用PBS (—)進行2次沖洗后，在各孔中加入700 μ L的4%的PFA/PBS，在室溫下孵育10分鐘。然后，去除4%PFA/PBS，用PBS沖洗3次。接著，在各孔中加入3滴IMMU-M0UNT，蓋上蓋玻片，在室溫下保存。圖3中的(A)為乳牙、(B)為恒牙的牙髓細胞的SA-β-gal染色質象。所述乳牙、恒牙均是通過上述移送(保存)例獲得的，牙髓細胞的培養是根據上述方法進行的。、
SA-β-gal用作細胞的老化標記，已知停止細胞分裂的老化細胞被染成藍色(SA-β-gal陽性細胞)。如圖3所示，使用的恒牙、乳牙中任意的牙髓細胞均不被認為是SA-β -gal陽性細胞，即使重復繼代，該結果也沒有變化。由此能夠想到在這些牙髓細胞中由繼代帶來的增殖能力的變化很小，能夠進行穩定的培養，非常有用。并且，該結果不遜色于通過其它途徑得到的通常的牙髓細胞(拔牙后立即進行培養的牙髓細胞)所帶來的效果。并且，對沒有進行本發明的移送方法，而僅是在拔牙后浸入保存液中進行24小時以內上述培養的牙也進行了同樣的試驗，對于恒牙，已確認為SA-β -gal陽性細胞。因此，根據本發明，能夠在維持含干細胞的牙髓細胞的增殖能力的狀態下，對離體牙進行移送。〈染色體分析〉取根據上述移送(保存)例的源自女性恒牙及男性乳牙的人類牙髓細胞各I例，按照上述培養方法進行培養，分析其染色體數。對分別50個培養細胞的染色體數進行分析，分析結果如表I及表2所示。具體的分析方法如下。將經過10代繼代的牙髓細胞制成染色體標本，進行姬姆薩染色，確定染色體數量后，將該標本通過Quinacrine-Hoechst染色進行顯帶。基于標準核型對染色體進行分類，并進行核型分析。表I
權利要求
1.一種用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，其包括下列工序: 在離體牙的表面添加直線形的槽； 沿著槽分割所述離體牙，使牙髓露出； 將所述離體牙浸入培養基，以維持在適合細胞保存的溫度的狀態進行運送。
2.根據權利要求I所述的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述直線形的槽是沿著從離體牙的齒冠至齒根的縱切線，從該離體牙的側面向中心形成槽。
3.根據權利要求I所述的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述直線形的槽是沿著離體牙的齒冠部咬合面的分割線，從該離體牙的上面向中心形成。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述運送所需時間為48小時以內。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述離體牙為恒牙，其為牙髓未經處理的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述直線形的槽的長度為5 10mm、寬度為O. 5^1. 5mm、深度為2 4mm。
7.一種用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，包括將形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體乳牙浸入培養基內，以維持在適合細胞保存的溫度的狀態進行運送的工序。
8.根據權利要求7所述的用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述運送所需時間為48小時以內。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種不損傷牙髓細胞在活體內的功能，移送用于培養及保存牙髓細胞的離體牙的方法。本發明的牙髓細胞的采集方法包括下列工序在離體牙的表面添加直線形的槽；沿著槽分割所述離體牙，使牙髓露出；將所述離體牙浸入培養基，以維持在適合細胞保存的溫度的狀態下進行運送。
文檔編號A61L27/00GK102725398SQ20108005731
公開日2012年10月10日 申請日期2010年12月14日 優先權日2009年12月21日
發明者大久保亮, 大友宏一, 齋藤一郎 申請人:學校法人總持學園鶴見大學, 株式會社再生醫療推進機構