用于創傷護理和/或其它組織愈合應用的支架材料的制作方法

專利名稱：用于創傷護理和/或其它組織愈合應用的支架材料的制作方法
用于創傷護理和/或其它組織愈合應用的支架材料領域
本發明涉及用于創傷護理和/或其它組織愈合應用的支架材料及其制備方法。支架材料包含來自魚皮的脫細胞細胞外基質。背景
目前將多種人、動物和合成材料描述或用于醫學程序以增強、修復或糾正組織缺陷。例如美國公布專利申請號2003/0059460公開一種雜化聚合物材料，其包含可用于活體組織再生的合成和天然聚合物。雜化物包含交聯的天然存在的聚合物和生物降解-可吸收的合成聚合物。但是，必須采取一系列復雜的加工步驟以制備該雜化材料。此外，所得雜化材料含有合成以及天然存在的材料。 美國專利號6，541，023描述來自魚皮的多孔膠原凝膠用作組織工程支架的用途。制備膠原凝膠包括研磨魚皮。另外，中國專利號1068703描述制備用于敷裹燒傷創傷的魚皮的方法，包括從魚體分離魚皮，將該皮膚置于足以建立2. 5-3的pH值的量的碘酊、乙醇、樟醇、磺胺嘧啶鋅和鹽酸的防腐液中。但是，這些產物可能難以處理，因為美國專利號6，541，023的產物為凝膠形式，中國專利號1068703的產物貯存于溶液中。此外，源自人皮膚(ALL0DERM 再生組織基質(LifeCell));胎牛真皮(PRIMATRIX 皮膚修復支架(TEI Biosciences));豬膀胱(MATRISTEM 細胞外基質創傷片(Medline Industries, Inc.));和豬小腸黏膜下層(OASIS 創傷基質(HealthpointLtd.))已產生多種用于醫療用途的細胞外基質產物。但是，需要改良的產品和方法以增強創傷愈合和組織修復。本發明滿足這種需要。概述
脊椎動物的細胞外基質(ECM)是包圍和支持細胞的復雜結構實體。ECM由結構蛋白的復雜混合物組成，其中最豐富的是膠原，及其它特化的蛋白和蛋白聚糖。本文描述的支架材料是來自魚皮的天然生物ECM組分的非常完整的無細胞支架。該支架還可包含來自魚皮的天然存在的脂質。皮膚ECM的天然三維結構、組成和功能基本不變，并提供支架以支持細胞移行、粘附、增殖和分化，由此促進組織的修復和/或更換。本發明還涉及該支架材料的制備方法和使用方法。附圖
簡述
圖I顯示根據本文所述方法用魚皮制備的脫細胞ECM產物(支架材料)的示例性樣
品;
圖2顯示以IOOx (2A)和400x (2B)放大的支架材料橫截面的光學圖像；
圖3顯示以300x (3A)和600x (3B)放大的支架材料橫截面的掃描電鏡(SEM)圖像。描述
本發明的支架材料由完整魚皮獲得。圖I顯示示例性樣品，其顯示支架材料樣品的外觀。任何物種的魚，包括硬骨魚或軟骨魚，都可用作魚皮來源。例如來源可以是圓型魚如鱈魚、黑線鱈和It魚；比目魚，如大比目魚、鰈魚和鰨魚；鮭魚如大馬哈魚和鱒魚；鯖科如鮪魚；或者小型魚如青魚、鳳尾魚、鯖魚和沙丁魚。在某些實施方案中魚皮由冷水多脂魚和/或已知含有大量ω-3油的魚獲得。ω-3油高的魚的實例是大馬哈魚、青鱗魚、鮪魚、青魚、鱈魚、沙丁魚、鯖魚、裸蓋魚(sable fish)、胡瓜魚、白鮭、南極鱈魚(hoki fish)和一些鱒魚品種。在加工之前從魚去除魚皮。如果魚皮來自有鱗品種的魚,應當將魚皮去鱗以便除去實質部分的鱗或者至少從鱗除去羥磷灰石。短語“除去實質部分的鱗”或者“基本無鱗”指除去魚皮上至少95%，優選至少99%，更優選100%的鱗。“基本無鱗的”魚皮還可指來自無鱗品種魚的魚皮。要么在所有加工之前，用單純的機械壓力(通過例如刀、與研磨劑一起振蕩、水壓、使用與刀相同的機械力的專用去鱗設備或其它壓力設備，如用陶瓷或塑料拋光)除去鱗，要么在某種化學處理(如脫細胞)之后除去鱗，然后用機械壓力洗掉鱗。如果將魚皮首先化學和/或酶處理(如用TRITON X-100處理)，機械壓力一般需要柔和，因為在脫細胞之后皮膚更容易撕裂受損。可以多于一個的步驟去鱗，例如在脫細胞前部分除去，接著在脫細胞期間和/或之后進一步除去。或者可以只通過化學處理去鱗。在鱗已除去后，將魚皮在脫細胞前任選冷凍。可通過將皮膚培養在液氮中或者用 其它可將皮膚冷凍至-70°C或更低的專用冷凍裝備將魚皮快速冷凍，以保存支架的膠原結構。或者，可將魚皮冷凍在通常見于魚廠的常規類型冷凍庫中。冷凍過程可溶解或部分溶解構成完整魚皮的細胞，幫助促進魚皮脫細胞。如果魚皮已冷凍，可將其稍后解凍用于進一步加工。無論魚皮是否冷凍，在進一步加工之前都可將其用緩沖液洗滌。例如可將魚皮用緩沖液洗滌1-3次，緩沖液任選含有一種或多種抗氧化劑(如抗壞血酸(比如50 mM抗壞血酸)，維生素A、C、E，和β-胡蘿卜素)，抗生素(如鏈霉素和青霉素)，蛋白酶(如分散酶II)和蛋白酶抑制劑(如抗痛素、抑肽酶、苯甲脒、苯丁抑制素、DFP、EDTA、EGTA、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素、膦酰二肽和PMSF)以促進魚皮的消毒和穩定化。緩沖液可為至少5. 5的pH，比如6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9.0，如7. 5-8. 5。緩沖液還可用作其中可將魚皮貯存幾天至幾周或更久的介質。在某些實施方案中將魚皮貯存于約4V溫度的該緩沖液中。在冷凍和/或洗滌和/或貯存于緩沖液中后，將魚皮用一種或多種脫細胞溶液處理以除去魚皮的細胞材料，包括抗原材料，而對天然存在的細胞外基質的機械完整性和結構完整性和生物活性有最小限度的損害乃至無損害。術語“細胞外基質”或“ECM”用于本文指存在于魚皮內的無細胞組織材料，除了執行各種其它重要功能外為皮膚細胞提供結構支持。本文描述的ECM不包括已完全用提取、純化或分離的ECM組分(如膠原)構成或再形成的基質材料。術語“無細胞的”、“脫細胞的”、“脫細胞的魚皮”等用于本文指從中已除去基本量細胞和核酸內容物剩下復雜的ECM三維間質結構的魚皮。“脫細胞劑”是從ECM有效除去基本量細胞和核酸內容物的那些劑。當已從ECM除去至少50%活力和無活力核酸及其它細胞材料時，將ECM稱為“脫細胞的”或“基本不含”細胞和核酸內容物(即已除去“基本量”)。在某些實施方案中，除去約 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99. 5%或100%活力和無活力核酸和細胞材料。脫細胞可通過例如測試經處理魚皮的DNA含量驗證。可以例如通過ECM的組織學檢查，和/或通過生化測定比如PIC0GREEN 測定、二苯胺測定，或者通過PCR，確定從ECM除去的核酸。脫細胞破壞細胞膜和釋放細胞內容物。脫細胞可涉及一種或多種物理處理、一種或多種化學處理、一種或多種酶處理或其任何組合。物理處理的實例是聲處理、機械攪動、機械按摩、機械壓力和冷凍/解凍。化學脫細胞劑的實例是離子鹽(如疊氮鈉)、堿、酸、去污劑(如非離子和離子去污劑)、氧化劑(如過氧化氫和過氧酸)、低滲溶液、高滲溶液、螯合劑(如EDTA和EGTA)、有機溶劑(如三(正丁基)_磷酸酯)、抗壞血酸、蛋氨酸、半胱氨酸、馬來酸和與DNA結合的聚合物(如聚-L-賴氨酸，聚乙烯亞胺(PEI)，和聚酰胺胺(PAMAM))。非離子去污劑包括4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚(TRITON X-100) (Dow Chemical Co·)。離子去污劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、TRITON X-200和兩性離子去污劑(如CHAPS)。其它合適的脫細胞去污劑包括聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯和聚氧乙烯(80)脫水山梨醇單油酸酯(Tween 20和80)、3_[ (3_氯氨基丙基)-二甲氨基]_1_丙-磺酸酯、辛基-葡糖苷和十二烷基硫酸鈉。酶脫細胞劑的實例是蛋白酶、核酸內切酶和核酸外切酶。蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、 金屬蛋白酶(如熱解素)和谷氨酸蛋白酶。脫細胞一般在至少5. 5的pH進行，比如6.0，6.5，7. O, 7.5，8. O, 8.5，9. O, 9.5，10. O 或更大。在某些實施方案中 pH 為 7. 0-9. 0，如 7. 5-8. 5。脫細胞步驟的實施例是將魚皮培養在包含I M NaCl, 2%脫氧膽酸，O. 02%疊氮鈉和500 ppm鏈霉素的溶液中。在另一個實施例中，將魚皮用包含蛋白酶(如2. 5 U/mL分散酶II)及其它組分(如O. 02%疊氮鈉)的第一脫細胞溶液培養。倒出第一脫細胞溶液，然后將魚皮用第二脫細胞溶液處理，比如包含去污劑(如O. 5% TRITON X-100)及其它組分(如O. 02%疊氮鈉)的溶液。在另一個實施例，將魚皮首先用包含去污劑(如O. 5% TRITON X-100)及其它組分(如0.02% EDTA、疊氮鈉和/或脫氧膽酸)的脫細胞溶液處理，然后培養在包含去污劑比如SDS的第二脫細胞溶液中。魚皮可以在或不在振蕩下培養。通過倒出任何剩余的脫細胞溶液，用緩沖液(如Hank’s平衡鹽溶液)任選洗滌魚皮，然后用另一個脫細胞步驟再次處理魚皮，可根據需要重復脫細胞步驟。一旦已除去足量細胞材料，可去除脫細胞溶液(如通過抽吸或通過輕輕地倒出溶液)。在脫細胞后，可將魚皮任選用水、緩沖溶液和/或鹽溶液洗滌。合適洗滌溶液的實例包括Dulbecco's磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、Medium 199(M199, SAFC Biosciences, Inc.)和/或L-谷氨酰胺。洗漆步驟一般在至少5. 5的pH進行，比如6.0，6.5，7. O, 7.5，8. O, 8.5，9. O, 9.5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為 7. 0-9. 0，如 7. 5-8. 5。可將魚皮任選漂白以改善終產物的外觀。漂白可在脫細胞之前、之后和/或同時進行。例如，可將一種或多種漂白劑摻入一種或多種脫細胞溶液內和/或一種或多種緩沖溶液內。漂白劑的實例包括亞硫酸鈉、過氧化氫、過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉。在某些實施方案中，如果使用強漂白劑如過硫酸鹽，漂白和脫細胞可合并為單個步驟，包含將魚皮培養在漂白劑、增稠劑和過氧化物源中的一種或多種的混合物中。例如，可制備干漂白混合物(見如描述于實施例5的“漂白混合物”)，接著加入水、過氧化氫或其組合至干混合物中以形成漂白溶液，該漂白溶液還足以脫細胞。漂白劑(如亞硫酸鈉、過氧化氫、過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉)應占干混合物約40-60% w/w。可將EDTA和過硫酸鹽的組合加入混合物以加速漂白和脫細胞。在某些實施方案中EDTA在干混合物中的濃度為約O. 25-5% w/W。過氧化氫可占混合物約15-25%;過氧化物源可以是過碳酸鈉和過碳酸鉀。磷酸鈉過水合物和碳酸鈉或偏硅酸鎂和硅酸硅也可用作過氧化物源。干混合物還可包括硅石和水合硅石，例如以1-10% w/w，和任選的一種或多種硬脂酸鹽(如硬酯酸銨、硬脂酸鈉和/或硬脂酸鎂)。此外干混合物可任選包括增稠劑，比如羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、藻素(即藻酸鹽)、有機樹膠(如纖維素、黃原膠)、偏硅酸鈉及其組合，以增加漂白/脫細胞溶液的粘度和保護蛋白纖維免受損害。漂白和/或漂白加脫細胞一般在至少5. 5的pH進行，比如6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9. 0，如7. 5-8. 5。在漂白和/或漂白加脫細胞后，將魚皮在上文描述的pH條件下用包含L-谷氨酰胺的溶液任選洗滌。在某些實施方案中，用消化酶處理魚皮。與漂白類似，消化可在脫細胞之前、之后和/或同時進行。合適的酶包括蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。在某些實施方案中消化酶是絲氨酸蛋 白酶比如胰蛋白酶。消化酶可以是在堿性環境中發揮作用的酶，限制ECM內交聯，并軟化魚皮。消化一般在至少 5. 5 的 pH 進行，比如 6. O, 6. 5，7. O, 7. 5，8. O, 8. 5，9. O, 9. 5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9. O,如7. 5-8. 5。可將脫細胞的魚皮任選冷藏。冷藏可包括在冷凍之前將魚皮浸在冷凍保護劑溶液中。冷凍保護劑溶液一般包含適當的緩沖劑、一種或多種冷凍保護劑和任選溶劑，如有機溶齊U，其與水組合發生最小程度的膨脹和收縮。冷凍保護劑的實例包括蔗糖、棉子糖、右旋糖酐、海藻糖、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、乙二醇、甘油、丙二醇、2-甲基-2，4-pantandial、某些抗凍蛋白和肽，及其組合。或者，如果將脫細胞的魚皮速凍(閃凍)之后升華以將冷凍步驟期間形成的冰晶減到最少，可將該皮膚任選冷凍在不包括冷凍保護劑的緩沖液中。冷藏一般在至少 5. 5 的 pH 進行，比如 6. O, 6. 5，7. O, 7. 5，8. O, 8. 5，9. O, 9. 5，10. O 或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9. O,如7. 5-8. 5。可將脫細胞的魚皮包裝在無菌容器比如玻璃管瓶或袋內。在一個實施方案中，使用TYVEK 袋。例如可將魚皮培養在冷凍保護劑溶液中，包裝在TYVEK 袋內，然后放入冷凍干燥器中，以與冷凍保護劑相容的速率冷凍。可將脫細胞的魚皮凍干，即在低溫和真空條件下冷凍以便在沒有冰重結晶的情況下從各冰晶相連續除去水。在凍干期間，一般首先經過升華除水，然后如果需要則經過解吸除水。另一種在加工后和滅菌前除去過量水的方法是真空加壓。在某些實施方案中，在冷凍之前和/或之后將脫細胞的魚皮滅菌。滅菌方法在本領域眾所周知。例如可將脫細胞的魚皮置于環氧乙烷室中，用合適的環氧乙烷循環來處理。其它滅菌方法包括用臭氧、二氧化碳、氣態甲醛或輻射(如Y輻射、X-射線、電子束加工和亞原子粒子)滅菌。作為冷凍、冷凍-干燥和/或水的真空加壓的替代或補充，可將脫細胞的魚皮保存在非水溶液比如醇中。所得產物(支架材料)是具備可促進組織再生、修復和/或更換(如內源性組織的修復、再生和/或生長)的性質的無菌、膠原基基質。術語“支架材料”指包含已被脫細胞和任選漂白、消化、凍干等(如上文討論)的魚皮的材料。支架材料可提供完整支架用于支持內皮和/或上皮細胞，可由宿主整合，可生物相容，不顯著鈣化，并可在環境溫度貯存和運輸。短語“由宿主整合”在本文指用支架材料處理的患者的細胞和組織可長入支架材料內并且支架材料的確整合/吸收入患者體內。術語“可生物相容”指在其預期使用的體內環境中基本無毒，并且基本不被患者生理系統排斥(即非抗原性)的材料。這可通過材料通過生物相容性測試的能力測量，所述測試陳述于國際標準組織(ISO)標準號10993和/或美國藥典(USP) 23和/或美國食品藥品管理局(FDA)藍皮書備忘錄號G95-1，題為 〃Use of International Standard IS0-10993, Biological Evaluation of MedicalDevices Part I: Evaluation and Testing(國際標準 IS0-10993 的使用，醫療裝置生物評價部分I :評價和測試)"。通常，這些測試測量材料的毒性、傳染性、致熱原性、刺激可能性、反應性、溶血活性、致癌性和/或免疫原性。生物相容性結構或材料，當引入大部分患者時，將不引起顯著的不良、長期或擴大的生物學反應或應答，并區別于手術或將異物植入活體內通常伴隨的輕微、暫時性炎癥。持續高水平的基質金屬蛋白酶(MMP)可促成創傷慢性。本文所述支架材料可吸收 基質金屬蛋白酶(MMP)從而促進創傷愈合和從慢性轉變為急性創傷。支架材料含有來自魚皮細胞外基質(ECM)的蛋白質。支架材料中的ECM組分可包括例如結構蛋白；粘附糖蛋白；蛋白聚糖；非蛋白聚糖多糖；和基質細胞(matricelIular)蛋白。結構蛋白的實例包括膠原(ECM中最豐富的蛋白)，比如原纖維膠原(I，II，III，V和XI型)；間斷三股螺旋的原纖維締合(facit)膠原(IX，XII和XIV型)，短鏈膠原(VIII和X型)，基底膜膠原(IV型)，及其它膠原(VI，VII和XIII型)；彈力蛋白；和層粘連蛋白。粘附糖蛋白的實例包括纖維連接蛋白；細胞粘合素；和血小板反應素。蛋白聚糖的實例包括硫酸肝素；硫酸軟骨素；和硫酸角質素。非蛋白聚糖多糖的實例是透明質酸。基質細胞蛋白是一組在結構上不同的細胞外蛋白，通過與細胞表面受體、細胞因子、生長因子、蛋白酶和ECM的相互作用調節細胞功能。實例包括血小板反應素(TSP) I和2 ;細胞粘合素；和SPARC (分泌性蛋白，酸性，富含半胱氨酸)。在某些實施方案中，脫細胞(及其它任選加工步驟)不從魚皮脂質層除去全部天然存在的脂質。因此，支架材料可包含一種或多種來自魚皮，特別是來自魚皮脂質層的脂質。例如支架材料可包括至多約25% w/w脂質(凍干后總支架材料的干重)，比如0.1%，0. 5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%,17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%或24% w/w脂質。可以例如通過有機溶劑提取接著層析來驗證支架材料中存在脂質。合適有機溶劑的實例包括丙酮和氯仿。支架材料中的脂質可包括，例如脂肪酰(即脂肪酸，其共軛物和衍生物)；甘油脂質；甘油磷脂(即磷脂)；神經鞘脂；糖脂(saccharolipid);聚酮；甾醇脂質(即甾醇類)；某些脂溶性維生素；異戊烯醇脂類(prenol lipids);和/或聚酮。脂肪酰的實例包括飽和脂肪酸，比如多不飽和脂肪酸；脂肪酯；脂肪酰胺；和類花生酸類。在某些實施方案中脂肪酸包括ω-3脂肪酸，比如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)(高濃度見于魚油中)。其它見于魚油的脂肪酸包括花生酸、鱈油酸、花生四烯酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、異油酸、亞油酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、山崳酸、薺酸和掏酸。甘油脂質的實例包括單-、二 -和三-取代的甘油，比如單酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油(即甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯)。甘油磷脂的實例包括磷脂酰膽堿；磷脂酰乙醇胺；和磷脂酰絲氨酸。神經鞘脂的實例包括鞘磷脂和糖鞘脂。留醇脂質的實例包括膽留醇；類固醇；和開環留類(secosteiOids，各種形式的維生素D)。異戊烯醇脂類的實例包括類異戊二烯；類胡蘿卜素；和醌和氫醌，比如維生素E和K。支架材料可含有一種或多種添加的活性劑(即在支架材料加工期間或之后加入的劑)，比如抗生素、防腐劑(antis印tic)、抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑和抗炎劑。活性成分可以是促進創傷護理和/或組織愈合的化合物或組合物比如抗氧化劑或藥物。還可以是一種或多種蛋白和/或其它生物制劑。可加入足夠為支架材料提供有效抗微生物性質的量的抗生素、防腐劑和抗微生物劑。在某些實施方案中，抗微生物劑是一種或多種抗微生物金屬，比如銀、金、鉬、銅、鋅或其組合。例如在加工期間可將銀以離子、金屬、元素和/或膠體形式加入支架材料。還可將銀與其它抗微生物劑組合。可加入足夠減輕和/或抑制應用支架材料的創傷或組織區域處的炎癥的量的抗炎劑。可使用干燥形式的支架材料。或者，可在使用之前將支架材料再水合。在某些實 施方案中，將一種或多種支架材料層疊在一起以形成更厚的支架材料。一般，支架材料為約O. 1-4. O mm厚(即在橫截面)，比如O. 5，I. O, I. 5，2. O,2.5，3.0或3.5 mm厚。厚度可取決于許多因素，包括用作原料的魚品種、加工、凍干和/或再水合(見實施例14)。當然，當產物包含不止一層支架材料時，厚度成比例地更大。本文所述支架材料可用于多種醫療應用。例如支架材料可用作創傷敷料和/或縫合材料，其中將支架材料應用于創傷或組織區域上或其中一部分。術語“創傷”指導致組織損傷、組織穿透、撕裂或病損的任何損傷。可順應支架材料治療的創傷包括可位于任何部位，包括內部、界面、外部、間隙、體外和/或體內的損傷。適合用支架材料覆蓋的創傷實例包括切割傷、深裂傷、開放性創傷、組織破裂、褥瘡、皮炎、病損、慢性創傷、戰場創傷、壞死性創傷、急性、慢性、外傷性、撕裂、磨損、挫傷、壞死性筋膜炎(necrotizing facitis)、中毒性表皮壞死、壓傷、靜脈功能不全性潰瘍、動脈潰瘍、糖尿病性或神經性潰瘍、壓迫性潰瘍、混合潰瘍、燒傷、毛霉菌病、脈管炎創傷、膿皮病、壞疽，及本領域技術人員已知的其等同物和/或組合。預期在人和動物受試者中治療創傷。在某些實施方案中，將支架材料用于腹壁重建，例如用于修復疝。例如在修復疝時，外科醫生將在疝位置的附近做切口。對于腹股溝疝，切口就在腹部連接大腿的皺褶的上方。為了修復臍疝，切口靠近肚臍。如果疝發生在以前手術的部位，則再打開該手術的切口。以大致相同的方式進行手術，無論在哪里做切口。小心地打開疝囊，將腸或其它組織放回腹內。將變弱的區域用將腹肌組織拉回到一起的合成網狀物或縫線修復和加強。本文所述支架材料可用作網狀物材料或縫線，或者用來強化網狀物材料或縫線。支架材料可用于加強或增強創傷護理或組織愈合產品比如創傷敷料、網狀物材料、繃帶或縫線。例如支架材料可與創傷敷料、網狀物材料或縫線緊靠使用或者互繞。當用作網狀物材料或縫線，或者用來強化網狀物材料或縫線時，可將支架材料用例如化學交聯劑比如戊二醒(gluteraldehyde)或鉻處理以增加組分ECM材料的交聯。支架材料還可用于代替因牙周病損失的牙銀、形成膀胱懸帶(bladder sling),和促進骨盆底重建。如用于本文，單數形式〃a〃、〃an〃和〃the〃包括復數指示物，除非上下文另外明確提示。提供本文公開的出版物只是因為它們的公開先于本申請的提交日期。在此絕不應解釋為承認本公開因為在先公開而不具備比此類出版物日期提前的權利。而且，提供的出版物日期可能不同于實際的出版日期，這可能需要獨立證實。本文引述的所有出版物、專利、專利申請及其它參考文獻由此通過引用全部結合到本文中。雖然本公開已參考其某些實施方案詳細描述，本領域技術人員將清楚可在不脫離本公開范圍的情況下進行各種改變和采用等同物。此外，下列實施例只是說明性的，不應視為以任何方式限制本公開。 實施例實施例I
皮膚去除
連同盡可能多的表皮脂肪一起，將皮膚從魚片去除。通過用刀刮擦魚皮表面在砧板上將魚皮去鱗。消毒和穩定化
將去鱗皮膚用分別含有50 mM抗壞血酸、500 ppm鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖鹽水在4°C洗滌2次持續I小時。脫細胞
a)將魚皮在IM NaCl中放置8小時，接著培養在含有O. 02%疊氮鈉和500 ppm鏈霉素的2%脫氧膽酸中 e
b)倒出a)中的溶液。將魚皮在室溫以40RPM置于Hank’s平衡鹽溶液中10分鐘。重復該步驟，并將魚皮置于層流通風櫥中的容器內，打開，吸除溶液。再重復該程序2次，
c)將魚皮用含有O.5% SDS的脫細胞溶液處理，將容器在室溫置于40 RPM旋轉器上I小時β
d)通過抽吸按照b)中描述除去脫細胞溶液。將魚皮用50mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗漆。消化
將魚皮在室溫在消化溶液中培養18小時，該溶液由I M Tris-HClA.OSyg/mL胰蛋白酶組成，pH為8. 5。冷凍保護
將魚皮浸在含有在Hank’s平衡鹽溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的預冷凍溶液內。洗滌
將魚皮用預冷凍溶液洗滌，在室溫下置于40 RMP旋轉器中120分鐘。包裝
將魚皮插入袋內，將袋熱封關閉。該袋是來自DuPont的醫用級多孔TYVEK 膜袋，適合用環氧乙烷(EtOx)滅菌。凍干
將裝有魚皮的袋插入冷凍干燥器內冷凍干燥。
滅菌
將裝有魚皮的袋插入環氧乙烷室內，用1-5次環氧乙烷循環進行處理使魚皮滅菌。實施例2 皮膚去除
連同盡可能多的表皮脂肪一起，將皮膚從魚片去除。通過用刀刮擦魚皮表面在砧板上將魚皮去鱗。消毒和穩定化
將去鱗皮膚用分別含有50 mM抗壞血酸、500 ppm鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖鹽水在4°C洗滌2次持續I小時。脫細胞
a)將魚皮置于含有2.5 U/mL分散酶II (或鏈霉蛋白酶)和O. 02%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖鹽水中，在連續振蕩下在4°C培養8小時。然后倒出溶液，在輕微振蕩下將樣品在O. 5%TRITON X-100和O. 02%疊氮鈉的第二溶液中培養24小時β
b)倒出a)中的第二溶液。將魚皮在室溫以40RPM置于Hank’s平衡鹽溶液中10分鐘。重復該步驟，將魚皮置于層流通風櫥中的容器內，打開，吸除溶液。再重復該程序2次
c)將魚皮用含有O.5% SDS的脫細胞溶液處理，將容器在室溫置于40 RPM旋轉器上I小時》
d)通過抽吸按照b)中描述除去c)的脫細胞溶液。將魚皮用50mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。消化
將魚皮在室溫在消化溶液中培養18小時，該溶液為I M Tris-HCUO. 05 μ g/mL胰蛋白酶，pH 為 8. 5。冷凍保護
將魚皮浸在含有在Hank’s平衡鹽溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的預冷凍溶液內。洗滌
將魚皮用預冷凍溶液洗滌，在室溫下置于40 RMP旋轉器中120分鐘。包裝
將魚皮插入TYVEK 膜袋內并熱封關閉。凍干
將裝有魚皮的袋插入冷凍干燥器內冷凍干燥。滅菌
將裝有魚皮的袋插入環氧乙烷室內，用1-5次環氧乙烷循環進行處理使魚皮滅菌。實施例3 皮膚去除
連同盡可能多的表皮脂肪一起，將皮膚從魚片去除。通過用刀刮擦魚皮表面在砧板上將魚皮去鱗。冷凍將魚皮在標準漁廠速凍冰箱中冷凍。在冷凍過程期間細胞溶解。冷凍抑制微生物生長。解凍
使魚皮在4°C解凍。消毒和穩定化
將去鱗皮膚用分別含有50 mM抗壞血酸、500 ppm鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖鹽水在4°C洗滌2次持續I小時。脫細胞
a)將魚皮用含有O.5% SDS的脫細胞溶液處理，將容器在室溫置于40 RPM旋轉器上I小時， b)通過抽吸除去脫細胞溶液。將魚皮用50mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。消化
將魚皮在室溫在I M Tris-HCUO.OSyg/mL胰蛋白酶、pH 8. 5的消化溶液中培養18小時。冷凍保護
將魚皮浸在含有在Hank’s平衡鹽溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的預冷凍溶液內。洗滌
將魚皮用預冷凍溶液洗滌，在室溫置于40 RMP旋轉器中120分鐘。包裝
將魚皮插入TYVEK 膜袋內并熱封關閉。凍干
將裝有魚皮的袋插入冷凍干燥器冷凍干燥。滅菌
將裝有魚皮的袋插入環氧乙烷室內，用1-5次環氧乙烷循環進行處理使魚皮滅菌。實施例4
按照實施例1-3各自的描述加工魚皮，只是在洗滌步驟還將漂白劑(亞硫酸鈉)以O. 5%濃度加入預冷凍溶液以獲得漂白支架基質。實施例5
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權利要求
1.一種支架材料，其包含脫細胞的魚皮。
2.權利要求I的支架材料，其中支架材料包含來自魚皮的細胞外基質材料。
3.權利要求2的支架材料，其中支架材料進一步包含來自魚皮脂質層的脂質。
4.權利要求I的支架材料，其中支架材料采用創傷敷料、繃帶、縫合材料和/或網狀物材料的形式。
5.權利要求I的支架材料，其中支架材料基本無鱗。
6.權利要求I的支架材料，其中支架材料是生物相容的。
7.權利要求I的支架材料,其中支架材料進一步包含一種或多種加入的活性劑。
8.權利要求6的支架材料，其中加入的活性劑選自抗生素、防腐劑、抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗炎劑、抗氧化劑、藥物、蛋白質、肽，及其組合。
9.一種制備支架材料的方法，其包含 (a)獲得魚皮；和 (b)使魚皮脫細胞。
10.權利要求9的方法，其進一步包含將魚皮去鱗、洗滌、冷凍、漂白、消化和/或冷藏。
11.權利要求9的方法，其中脫細胞包含一種或多種物理處理、一種或多種化學處理、一種或多種酶處理，或其任何組合。
12.權利要求11的方法，其中化學處理包含用一種或多種脫細胞劑處理魚皮，脫細胞劑選自離子鹽、堿、酸、去污劑、氧化劑、高滲溶液、螯合劑、有機溶劑、蛋氨酸、半胱氨酸、馬來酸、與DNA結合的聚合物，及其組合。
13.權利要求11的方法，其中酶處理包含用一種或多種選自蛋白酶、核酸內切酶和核酸外切酶的酶處理魚皮。
14.一種支架材料，其用權利要求9的方法制備。
15.一種治療創傷的方法，其包含將權利要求I的支架材料應用于創傷。
全文摘要
描述了用于創傷護理和/或其它組織愈合應用的支架材料及其制備方法。支架材料由來自魚皮的脫細胞細胞外基質構成。支架材料還可包括來自魚皮脂質層的脂質。還描述了制備和使用支架材料的方法。
文檔編號A61L31/00GK102781485SQ201080055320
公開日2012年11月14日 申請日期2010年10月6日 優先權日2009年10月7日
發明者D.H.吉斯拉多蒂爾, G.F.西古爾榮松, G.古蒙森 申請人:克雷西斯公司